СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОСТРЫХ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНЫХ ЯЗВ У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ В РАННЕМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/68 G01N33/52 

Изобретение относится к хирургии и биохимии и может быть использовано для прогнозирования развития острых послеоперационных гастродуоденальных язв у больных колоректальным раком.

В хирургической практике известен способ прогнозирования острых гастродуоденальных язв в раннем послеоперационном периоде.

Исследование иммунного статуса перед травматичными операциями и в раннем послеоперационном периоде. С этой целью у больных забирают периферическую кровь и исследуют показатели клеточного иммунитета. Иммунный дисбаланс и "синдром напряженности" иммунитета до операции и декомпенсация иммунной системы после операции являются предрасполагающими факторами в развитии острых гастродуоденальных язв. В частности для оценки состояния иммунной системы и неспецифической резистентности используют тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Тест основан на пиноцитозе нейтрофилами раствора нитросинего тетразолия (НСТ) и накоплении в фагоцитарных вакуолях с последующим восстановлением и превращением растворимого бесцветного НСТ в нерастворимый темно-синий диформазан, который идентифицируют визуально. Проведение теста позволяет судить о реактивности и функциональном резерве гранулоцитов [Скрябин О.Н. Острые послеоперационные гастродуоденальные язвы // дисс... док. мед наук. - 1994 г. - С.274-275. - СПб.].

Недостатки известного способа.

Исследование иммунного статуса длительно, трудоемко и практически невозможно у больных, оперируемых в экстренном порядке [Скрябин О.И. Острые послеоперационные гастродуоденальные язвы // дисс... док. мед наук. - 1994 г. - С.274. СПб.]. Отсутствует диапазон временной устойчивости - интервал, в течение которого медико-биологический параметр сохраняет свою функциональную специфичность и однозначность. Достоверность и специфичность методики относительно не высока.

Изобретение направлено на решение задач: повышение точности и достоверности диагностики, упрощение методики.

Указанные задачи достигаются путем определения в эритроцитах периферической крови активности общей аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) и натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы (Na⁺-K⁺-АТФ-азы) на четвертые сутки послеоперационного периода. При снижении к 4 суткам после операции активности общей АТФ-азы ниже 0,6 мкмоль освободившегося фосфора неорганического (Фн)/ч на 1 мг белка, a Na⁺- K⁺-АТФ-азы ниже 0,3 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка прогнозируют развитие острых гастродуоденальных язв.

Способ осуществляют следующим образом. Венозную кровь больного для исследования получают из кубитальной вены утром натощак в объеме 5 мл. Для получения эритроцитов в пробирку с кровью добавляют гепарин в дозе 10 Ед/мл крови (0,01 мл фарм. препарата гепарина активностью 5000 Ед/мл добавляют к 5 мл крови). Для определения активности фермента берут 2-4 мл гепаринизированной крови. Эритроциты осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Плазму и верхний слой эритроцитов с лейкоцитами удаляют. К осажденным эритроцитам добавляют 0,9% раствор хлорида натрия в объеме, в 2 раза большем объема эритроцитов. Центрифугируют при 3000 об/мин 10 минут, надосадочную жидкость удаляют, добавляют физиологический раствор в объеме, в 2 раза большем объема эритроцитов, и центрифугируют еще раз, затем удаляют надосадочную жидкость. Тени эритроцитов выделяют с помощью гипоосмотического гемолиза [Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалободов А.Д. // Биохимия - 1984. - т 49, №7 - С.1089-1095. Bedin M., Ponzi D. et. al. // Pediatric Research - 2001. - vol.50. - P.56-60]. Для этого отмытые эритроциты ресуспендируют изотоническим раствором, доводя до объема 2 мл, затем добавляют 18 мл охлажденной дистиллированной воды. Гемолизат центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок теней эритроцитов промывают 3 раза 20 объемами 10 мМ трис-HCl-буфера, каждый раз осаждая тени при 8000 об/мин в течение 20 мин. Конечный осадок доводят 10 мМ трис-НСЛ-буфером до 2 объемов первоначального объема эритроцитов и полученную суспензию используют для определения активности АТФ-азы. Определяют общую активность АТФ-азы и активность Mg²⁺-АТФ-азы. Активность Na⁺, К⁺-АТФ-азы вычисляют по разнице между общей активностью АТФ-азы и Mg²⁺-АТФ-азы. В инкубационную смесь, состоящую из 0,95 мл 100 мМ трис-буфера (рН 7,4), 0,1 мл 6 мМ раствора MgCl₂, 0,1 мл 100 мМ раствора NaCl, 0,1 мл 20 мМ раствора KCl вносят 0,1 мл взвеси теней эритроцитов. Для определения активности Mg²⁺-АТФ-азы в субстратную смесь вносят 0,1 мл раствора MgCl₂, а вместо NaCI и KCI 0,2 мл дистиллированной воды. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл 20 мМ раствора АТФ-Na₂, Смесь инкубируют 60 мин при температуре 37°С, после чего во все пробы для прекращения реакции добавляют 0,25 мл 30% трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы раствор АТФ-Na₂ вносят после добавления трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Из каждой пробы берут по 0,1 мл надосадочной жидкости для определения неорганического фосфора (Фн) по спектру поглощения молибденатных комплексов, стабилизированных аскорбиновой кислотой по методу [Fiske C.H., Subbarow Y. The colorimetric determination of phosphorus. // J. Biol. Chem. - 1925. - vol.66. - P.375-400]. Реагенты смешивают в следующем порядке: к 3 мл спирта добавляют 0,1 мл определяемой пробы, 0,4 мл молибденового раствора и 0,2 мл раствора аскорбиновой кислоты с перемешиванием пробы. Затем пробы инкубируют 10 мин при температуре 37°С. После этого пробы фотометрируют в кювете на 10 мм при длине волны 390 нм. Параллельно каждый раз ставят пробы с стандартным раствором фосфора 0,16 мкмоль/л. Активность АТФ-азы выражают в мкмоль освободившегося Фн/ч на 1 мг белка теней эритроцитов.

Расчет производят по формуле:

0,16×(Ео-Ек)/Е ст×Р, где

0,16 мкмоль/л - концентрация стандартного раствора фосфора

Ео - экстинция опытной пробы

Ек - экстинция контрольной пробы

Ест - экстинция стандартного раствора фосфора

Р - концентрация белка в тенях эритроцитов, мг.

Содержание белка в тенях эритроцитов определяют по методу Lowry [Lowry О.Н, Rosebrough N.J., Fair A.L., et. al. // J. Biol. Chem., 1951, v.193, №1. p.265-275.].

Активность общей АТФ-азы и Na⁺, К⁺-АТФ-азы в тенях эритроцитов периферической крови определяют на 4 сутки после операции. При снижении к 4 суткам послеоперационного периода активности общей АТФ-азы ниже 0,6 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, a Na⁺-К⁺-АТФ-азы ниже 0,3 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка прогнозируют развитие острых гастродуоденальных язв.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больной Ощепков В.П., 61 года. Диагноз - рак среднеампуллярного отдела прямой кишки Т4 N0 М0. Операция: передняя резекция прямой кишки. Активность общей АТФ-азы на 1 сутки после операции-0,61 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, активность Na⁺-К⁺-АТФ-азы 0,24 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. На 4 сутки после операции активность общей АТФ-азы - 0,49 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, активность Na⁺-K⁺ - 0,24 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. При фиброгастроскопии на 5 сутки после операции обнаружен эрозивный бульбит. Таким образом, у данного больного возникновение эрозивных поражений гастродуоденальной слизистой сопровождалось снижением активности общей и Na⁺-K⁺-АТФ-азы к 4 суткам послеоперационного периода.

Пример 2. Больной Игнатьев Э.М., 64 лет. Диагноз - рак нижнеампуллярного отдела прямой кишки Т4 N0 М0. Операция: брюшнопромежностная экстирпация прямой кишки. Активность АТФ-азы на 1 сутки после операции: общей - 0,73 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-К⁺ - 0,24 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. Активность АТФ-азы на 4 сутки после операции: общей - 0,489 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺ - 0,24 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. При фиброгастроскопии на 6 сутки после операции обнаружена острая язва луковицы ДПК. Таким образом, у данного больного возникновение острой язвы желудка сопровождалось снижением активности общей и Na⁺-K⁺-АТФ-азы к 4 суткам послеоперационного периода.

Пример 3. Больная Банникова Н.Г., 57 лет. Диагноз - рак нижнеампуллярного отдела прямой кишки Т4 N3 М0. Операция: брюшнопромежностная экстирпация прямой кишки. Активность АТФ-азы на 1 сутки после операции: общей - 0,95 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-К⁺ - 0,15 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. Активность АТФ-азы на 4 сутки после операции: общей - 1,0 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺ - 0,73 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. При фиброгастроскопии на 5 сутки после операции острых эрозивно-язвенных поражений слизистой оболочки желудка не обнаружено. У данной больной не произошло снижения активности общей и Na⁺-K⁺-АТФ-азы к 4 суткам послеоперационного периода и при эндоскопическом контроле поражений слизистой оболочки желудка обнаружено не было.:

Пример 4. Больной Московкин А.П., 55 лет. Диагноз - рак среднеампуллярного отдела прямой кишки Т4 N1 М0. Операция: передняя резекция прямой кишки с анастомозом. Активность АТФ-азы на 1 сутки после операции: общей - 0,76 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺ - 0,45 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. Активность АТФ-азы на 4 сутки после операции: общей - 0,54 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-К⁺ - 0,14 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. При фиброгастроскопии на 3 сутки после операции обнаружен эрозивный бульбит. У данной больного возникновение эрозивно-язвенных поражений гастродуоденальной слизистой сопровождалось снижением активности общей и Na⁺-К⁺-АТФ-азы к 4 суткам послеоперационного периода.

Пример 5. Больная Черемухина Е.Ф., 48 лет. Диагноз - рак верхнеампуллярного отдела прямой кишки Т2 N0 М0. Операция: передняя резекция прямой кишки с анастомозом. Активность АТФ-азы на 1 сутки после операции: общей - 0,61 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺ - 0,3 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. Активность АТФ-азы на 4 сутки после операции: общей - 1,83 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺-АТФ-аза - 0,73 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. При фиброгастроскопии на 7 сутки после операции острых эрозивно-язвенных поражений слизистой оболочки желудка не обнаружено. У данной больной не произошло снижения активности общей и Na⁺-К⁺-АТФ-азы к 4 суткам послеоперационного периода и при эндоскопическом контроле также поражений слизистой оболочки желудка обнаружено не было.

Определение активности АТФ-азы теней эритроцитов периферической венозной крови в раннем послеоперационном периоде проведено у 68 больных колоректальным раком, перенесших радикальные оперативные вмешательства. Среди них у 16 обнаружены острые эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.

У пациентов с острыми послеоперационными эрозивно-язвенными поражениями слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки активность АТФ-азы составила: в первые сутки после операции общая АТФ-аза 0,68±0,03 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-К⁺-АТФ-аза - 0,3±0,03 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. На четвертые сутки активность фермента составила: общая АТФ-аза 0,55±0,05 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺-АТФ-аза - 0,22±0,04 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. У больных без острых эрозивно-язвенных поражений гастродуоденальной слизистой активность АТФ-азы составила: в первые сутки после операции общая АТФ-аза 0,85±0,08 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺-АТФ-аза - 0,29±0,06 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка. На четвертые сутки активность фермента составила: общая АТФ-аза 1,0±0,08 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка, Na⁺-K⁺-АТФ-аза - 0,42±0,05 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка.

Положительный эффект.

Взятие крови из периферической вены не представляет технических трудностей.

Возникновение острых эрозий и язв желудка и двенадцатиперстной кишки в раннем послеоперационном периоде сопровождается достоверным снижением активности общей АТФ-азы и активности Na⁺-К⁺-АТФ-азы эритроцитов по сравнению с больными, у которых данное осложнение не возникло (р<0,05).

Снижение к 4 суткам послеоперационного периода активности общей АТФ-азы ниже 0,6 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка и Na⁺-K⁺-АТФ-азы ниже 0,3 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка позволяет прогнозировать развитие острых эрозивно-язвенных поражений слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и биохимии. В эритроцитах периферической крови больных колоректальным раком определяют активность общей АТФ-азы и Na⁺-К⁺-АТФ-азы на 4 сутки после операции. При снижении к 4 суткам активности общей АТФ-азы ниже 0,6 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка и Na⁺-К⁺-АТФ-азы ниже 0,3 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка прогнозируют развитие острых гастродуоденальных язв. Техническим результатом способа является повышение точности и достоверности диагностики, упрощение методики.

Способ прогнозирования острых гастродуоденальных язв у больных колоректальным раком в раннем послеоперационном периоде путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что на 4 сутки после операции в эритроцитах периферической крови определяют активность общей АТФ-азы и Na⁺-К⁺-АТФ-азы и при снижении активности общей АТФ-азы ниже 0,6 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка и Na⁺-К⁺-АТФ-азы ниже 0,3 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка прогнозируют развитие острых гастродуоденальных язв.