РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TUL4spCBD, ШТАММ ESCHERICHIA COLI M15 [pREP4, pTUL4spCBD] - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TUL4spCBD, РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК TUL4spCBD И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ TUL4spCBD Российский патент 2006 года по МПК C12N15/11 C12N1/21 C07K19/00 C12P21/00 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, микробиологии и может быть использовано для производства рекомбинантной плазмиды, кодирующей синтез иммунодоминантного антигена TUL4, слитого с помощью Gly-Ser спейсера с целлюлолозосвязывающим доменом гена эндонуклеазы, рекомбинантного белка и получения на его основе субъединичной вакцины против туляремии.

В настоящее время для профилактики туляремии в Российской Федерации используют живую туляремийную вакцину. Ежегодно вакцинации и ревакцинации против туляремии подвергают от двух до трех миллионов человек, проживающих на энзоотических территориях, а также группы риска. Единственным продуцентом живой туляремийной вакцины является аттенюированный штамм F.tularensis №15 НИИЭГ (или LVS по терминологии зарубежных авторов), полученный еще в 40-х годах прошлого столетия. Штамм подвержен диссоциации и для сохранения ценных иммунобиологических свойств требует постоянного контроля, а при необходимости - восстановления утраченной в процессе хранения протективной активности. Полученные в последние годы данные по исследованию генома штамма F. tularensis свидетельствуют о наличии в нем основных факторов патогенности возбудителя, что ограничивает возможности применения живой туляремийной вакцины для определенного контингента лиц.

В этой связи становится особенно актуальной проблема создания вакцинных препаратов нового поколения, в частности конструирование субъединичной безопасной вакцины на основе протективных антигенов F. tularensis.

Известно, что основными иммунодоминантными антигенами F. tularensis являются белки наружной мембраны (основной и наиболее изученный - TUL4 с молекулярной массой 17 кДа), а также липополисахарид.

Показано, что белок TUL4 консервативен у различных штаммов F. tularensis (Sjostedt A., Kuoppa К., Johansson Т., Sandstrom G. The 17 kDa lipoprotein and encoding gene of F. tularensis LVS are conserved in strains of F. tularensis. Microb. Pathog., 1992, V.13 (3), Р.243-249), узнается Т-клетками лиц, вакцинированных F. tularensis, некоторые Т-клеточные детерминанты белка TUL4 идентифицированы (Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A., Jaurin В. Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis. J. ImmunoL, 1990, V.145 (1), P.311-317).

Ген белка TUL4 был клонирован и экспрессирован в штамме Salmonella enterica, серовар Typhimurium (Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A. Humoral and cell-mediated immunity in mice to a 17-kilodalton lipoprotein of Francisella tularensis expressed by Salmonella typhimurium. Infect. Immun., 1992, V.60 (7), Р.2855-2862), однако экспрессия была очень низкой и доказана лишь методом иммуноблоттинга. Ген белка TUL4 проклонирован и экспрессирован в Е. coli. В этом случае была также получена незначительная экспрессия (менее 1% от общего белка клетки), показанная только с помощью иммуноблоттинга (Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A., Jaurin В. Molecular cloning and expression of a T-cell stimulating membrane protein of Francisella tularensis. Microb. Pathog., 1989, V.6 (6), Р.403-414).

Известен препарат, представляющий собой липополисахарид-белковый комплекс наружных мембран Francisella tularensis (Khlebnikov V.S., Golovliov I.R., Kulevatsky D.P., Tokhtamysheva N.V., Averin S.F., Zhemchugov V.E., Pchelintsev S.Y., Afanasiev S.S., Shcherbakov G.Y. Outer membranes of a lipopolysaccharide-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1996, V.13 (3), Р.227-233), который может быть использован для создания субклеточной вакцины против туляремии.

Однако липополисахарид-белковый комплекс представляет собой сложную смесь белков, липополисахаридов, жирных кислот и других компонентов клетки F. tularensis. Состав препарата сложно стандартизовать, что является существенным ограничением в его использовании в качестве вакцины против туляремии.

Известен препарат ОМ-«С», представляющий собой комплекс наружных мембран, выделенный из вакцинного штамма 15 F. tularensis (заявка на патент Жемчугова и др. №2003102089, 2003 г.). Иммунизация этим препаратом защищает мышей от подкожного заражения вирулентными штаммами возбудителя туляремии. Препарат может служить основой для создания субклеточной вакцины против F. tularensis.

Однако препарат ОМ-«С», также как и липополисахарид-белковый комплекс, представляет собой сложную и трудно стандартизируемую смесь компонентов клетки F. tularensis. В связи с этим его использование в качестве вакцины против туляремии у людей менее предпочтительно по сравнению с препаратами индивидуальных белков и/или липополисахаридов или их смеси.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является препарат, представляющий собой рекомбинантный или очищенный белок TUL4, инкапсулированный в иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs) (Golovliov I., Ericsson M., Akerblom L., Sandstrom G., Tarnvik A., Sjostedt A. Adjuvanticity of ISCOMs incorporating a T cell-reactive lipoprotein of the facultative intracellular pathogen Francisella tularensis. Vaccine, 1995, V.13 (3), Р.261-267). Мыши, вакцинированные этим препаратом, обладали ограниченной устойчивостью к заражению F. tularensis LVS.

Однако препарат рекомбинантного или очищенного белка TUL4, инкапсулированного в иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs), получают достаточно сложным и трудоемким способом. Кроме того, удельная концентрация иммуногенного белка TUL4 в препарате невысока, что может приводить к снижению протективных свойств данного препарата. Невозможность повышения удельной концентрации белка TUL4 в данном препарате определяется токсичностью основного компонента ISCOMs, адъюванта Quil A.

Задачей изобретения является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] - продуцента рекомбинантного белка TUL4spCBD, конструирование рекомбинантного белка TUL4spCBD и создание способа получения специфических антител к белку TUL4spCBD, обеспечивающих высокий уровень продукции рекомбинантного белка TUL4, упрощение процесса его очистки, концентрирования и иммобилизации на целлюлозосодержащем сорбенте.

Сущность изобретения состоит в том, что рекомбинантная плазмидная ДНК pTUL4spCBD кодирует синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, состоящего из белка TUL4 Francisella tularensis, Gly-Ser спенсера, целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum, размером 4388 н.п., имеющая последовательность нуклеотидов №1 и содержащая:

- искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка TUL4spCBD, включающий:

промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 н.п.),

ген рекомбинантного белка TUL4spCBD (115-1113 н.п.),

терминатор транскрипции (1134-1230 н.п.);

- бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампицилину (4183-3323 н.п. комплементарной цепи);

- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli.

Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD], депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-8728 от 18.05.2004 г., является продуцентом рекомбинантного белка TUL4spCBD.

Способ получения рекомбинантного белка TUL4spCBD включает выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD], получение супернатанта гидролизата клеток, обработку супернатанта целлюлозосодержащим сорбентом с последующим выделением целевого продукта.

Рекомбинантный белок TUL4spCBD обладает антигенными свойствами белка TUL4 и способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащими сорбентами, состоит из белка TUL4 Francisella tularensis с последовательностью аминокислот №2, Gly-Ser спейсера с последовательностью аминокислот №3 и целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum с последовательностью аминокислот №4.

В способе получения специфических антител к белку TUL4spCBD иммунизацию животных проводят иммобилизованным на целлюлозе рекомбинантным белком TUL4spCBD.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Штамм Escherichia coli, полученный путем трансформации клеток Escherichia coli M15 [pREP4] плазмидой pTUL4spCBD, обеспечивает высокий уровень продукции рекомбинантного белка TUL4spCBD, упрощение процесса его очистки, концентрирования и иммобилизации белка на целлюлозосодержащем сорбенте.

Технический результат достигается за счет конструирования рекомбинантного белка TUL4spCBD, способного самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентом.

Эффект повышенного синтеза рекомбинантного белка TUL4spCBD достигается за счет введения в состав рекомбинантного белка целлюлозосвязывающего домена из эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum, а также за счет возможности одностадийной высокоэффективной очистки рекомбинантного белка TUL4, содержащего целлюлозосвязывающий домен на целлюлозосодержащем сорбенте.

На чертеже представлена схема рекомбинантной плазмидной ДНК pTUL4spCBD.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмиды pTUL4spCBD.

а) Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов.

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы твердофазным амидофосфитным методом с помощью синтезатора АСМ 100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12%-ном ПАА геле.

б) Получение гена TUL4 с последующим его клонированием.

Копию гена TUL4 получали методом полимеразной цепной реакции, для чего были выбраны праймеры, соответствующие началу и концу данной области ДНК. Используя в качестве ДНК-матрицы хромосомную ДНК F. tularensis, методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров состава (подчеркнуты сайты рестриктаз BamHI, Kpn2I и BglII)

1. 5'-gcgagcggatccactctagggttaggtggctctgatgatg-3'

2. 5'-atatttccggaaattaagatcttcttgaatcagaagcgattacttctttgtc-3',

соответствующих начальной и концевой части ДНК, амплифицировали последовательность нуклеотидов. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг ДНК, 10 пкМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°С), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Реакцию амплификации проводили под вазелиновым маслом: 1 цикл 94°С - 5 мин; 5 циклов: 94°С - 2 мин, 60°С - 30 с 72°С - 2 мин; 35 циклов: 94°С - 1 мин, 65°С - 30 с и 72°С - 1 мин; затем 65°С - 5 мин и 72°С - 10 мин. Продукт амплификации размером 412 н.п. обрабатывали хлороформом, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде. Для клонирования данного продукта полученную ДНК PCR TUL4, а также ДНК плазмиды pQE16 (Quagene, USA) гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и Kpn2I при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 часов. Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК, соответствующий гену TUL4, размером 395 н.п., и фрагмент плазмиды pQE16 размером 3028 н.п. лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки Е. coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и Kpn2I, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны pTUL4, плазмидная ДНК которых (размером 3423 н.п.) содержит последовательность гена TUL4:

ATGAGAGGATCCACTCTAGGGTTAGGTGGCTCTGATGATGCAAAAGCTTCA

GCTAAAGATACTGCTGCTGCTCAGACAGCTACTACTGAGCAAGCTGCTGCTG

TATCTAAGCCAACTGCAAAAGTAAGTTTAAATAAACTTGGTCAGGATAAAA

TAAAAGCAACTGTATATACAGCATACAATAATAACCCACAAGGAATGTAAG

ATTACAATGGCAGGCTCCAGAAGGTTCTAAGTGCCATGATACAAGCTTCCCA

ATTACTAAGTATGCTGAGAAGAACGATAAAACTTGGGCAACTGTAACAGTT

AAGCAAGGTAATAACTTCTGTAGCGGTAAGTGGACAGCTAATGTAGTTTAT

GACAAAGAAGTAATCGCTTCTGATTCAATAAGATCTTAA

Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием.

Аминокислотная последовательность TUL4 (последовательность №2)

MRGSTLGLGGSDDAKASAKDTAAAQTATTEQAAAVSKPTAKVSLNKLGQDKI

KATVYTYNNNPQGSVRLQWQAPEGSKCHDTSFPITKYAEKNDKTWATVTVKQ

GNNFCSGKWTANVVYDKEVIASDSIRS

в) Получение последовательности, кодирующей Gly-Ser спейсер, с последующим ее клонированием.

Для получения последовательности спейсера, состоящего из повторов аминокислотных остатков Gly-Ser, были синтезированы два комплементарных олигонуклеотида следующего состава (подчеркнут сайт эндонуклеазы рестрикции BglII, под нуклеотидной последовательностью первого олигонуклеотида приведена кодируемая последовательность аминокислот (последовательность №3):

1. 5'-gatcc ccg ggt tct ggc tcc ggc tct ggt tcc ggt tct ggc gcc aga tct a - 3'

P G S G S G S G S G S G A

2. 5'-agcttagatctggcgccagaaccggaaccagagccggagccagaacccggg-3'.

Для получения двуцепочечного фрагмента ДНК смешивали по 20 пкМ каждого олигонуклеотида, прогревали смесь 10 мин при 95°С и охлаждали в течение 4 ч до 25°С. Для клонирования данного продукта ДНК плазмиды pQE13 гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и HindIII при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч. Выделенный из геля рестрикционный фрагмент плазмиды pQE13 размером 3420 н.п. объединяли с двуцепочечным фрагментом ДНК, кодирующим спейсер, и лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки Е. coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и HindIII, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны pRsp, плазмидная ДНК которых (размером 3471 н.п.) содержит последовательность №3 Gly-Ser спейсера. Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием по методу Сэнгера.

г) Получение участка гена CelD, содержащего последовательность целлюлозосвязывающего домена (CBD), с последующим его клонированием в плазмидную конструкцию pRsp.

Копию участка гена CelD получали методом полимеразной цепной реакции, для чего были выбраны праймеры, соответствующие началу и концу данной области ДНК. Используя в качестве ДНК-матрицы хромосомную ДНК Anaerocellum thermophilum, методом ПЦР с олигонуклеотидными праймерами состава (подчеркнуты сайты рестриктаз BamHI и HindIII и BglII):

1. 5'-aaagaaggatccaatgcacctttaggcg-3' и

2. 5'-cctcaaaaaagctttaggtagatctaacattatctatatac-3',

соответствующих начальной и концевой частям ДНК, амплифицировали последовательность нуклеотидов. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг ДНК, 10 пкМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°С), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Реакцию амплификации проводили под вазелиновым маслом: 5 циклов: 93°С - 2 мин, 57°С - 5 мин и 72°С - 30 с; 30 циклов: 93°С - 1 мин, 63°С - 1 мин и 72°С - 30 с; затем 63°С - 5 мин и 72°С - 10 мин. Продукт амплификации размером 583 н.п. обрабатывали хлороформом, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде. Для клонирования данного продукта полученную ДНК PCRCBD гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и HindIII при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч. Также ДНК плазмиды pRsp гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BglII и HindIII. Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК, соответствующий участку гена CelD размером 563 н.п., и фрагмент плазмиды pRsp размером 3465 п.н., содержащий селективный маркер, участок инициации репликации, промоторную область и последовательность, кодирующую Gly-Ser спенсер, лидировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки Е. coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и HindIII, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны pspCBD (размером 4028 н.п.), плазмидная ДНК которых содержит последовательность участка гена CelD со спейсером на N-конце, состоящим из Gly-Ser повторов. Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием. Нуклеотидная последовательность CBD из гена CelD:

AGATCCAATGCACCTTTAGGCGAAAAAGTCTTACCATCCACGTTTGAAGATG

ACACTCGTCAGGGCTGGGATTGGGATGGACCATCTGGTGTGAAAGGTCCTA

TTACTATCGAAAGTGCGAATGGTTCAAAAGCGCTATCTTTTAATGTTGAGTA

TCCAGAGAAAAAACCACAAGATGGCTGGGCAACAGCTGCAAGGCTTATACT

TAAAGACATAAATGTAGAAAGGGGAAATAATAAATATTTGGCTTTTGATTTT

TATTTGAAACCAGATAGGGCTTCAAAAGGTATGATTCAGATGTTTTTAGCTT

TTTCACCACCTTCCTTAGGTTACTGGGCTCAGGTACAAGACAGTTTTAATATT

GACCTTGGCAAAACTGTCAAGTGCAAAAAAGATAGAAGAACAGAAGTTTAT

AAGTTCAATGTATTTTTTGACTTAGACAAGATACAAGATAATAAAGTACTGA

GTCCAGACACACTCTTGAGAGATATAATAGTAGTCATAGCAGATGGCAATA

GCGATTTTAAGGGGAAAATGTATATAGATAATGTTAGATCTACCTAA

Аминокислотная последовательность CBD из гена CelD (последовательность №4)

RSNAPLGEKVLPSTFEDDTRQGWDWDGPSGVKGPITIESANGSKALSFNVEYPE

KKPQDGWATAARLILKDINVERGNNKYLAFDFYLKPDRASKGMIQMFLAFSPP

SLGYWAQVQDSFNIDLGKTVKCKKDRRTEVYKFNVFFDLDKIQDNKVLSPDTL

LRDIIVVIADGNSDFKGKMYIDNVRSYRST

е) Получение плазмиды, содержащей последовательность гена TUL4, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD.

Для получения плазмиды, содержащей последовательность гена TUL4, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD, плазмиду pTUL4 гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BglI и BglII при 37°С в буфере 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1 ч, а плазмиду pspCBD гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и BglI при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 37°С), 10 мМ хлорида магния, 100 мМ хлорида натрия и 0,1 мг/мл BSA, в течение 1 ч. Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК плазмиды pTUL4, включающий участок гена TUL4 размером 1377 н.п., а также фрагмент ДНК плазмиды pspCBD, включающий Gly-Ser спейсер и последовательность целлюлозосвязывающего домена CBD, размером 3011 н.п., лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки Е. coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI, BglI а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны pTUL4spCBD (размером 4388 н.п.), плазмидная ДНК которых содержит последовательность гена TUL4, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD. Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием.

Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмидной ДНК pTUL4spCBD представлена в последовательности №1.

Пример 2. Получение штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка TUL4spCBD, состоящего из TUL4, Gly-Ser спейсера, целлюлозосвязывающего домена.

Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка TUL4spCBD, клетки штамма Е. coli M15 [pREP4] трансформировали плазмидой pTUL4spCBD.

Полученный штамм Е. coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, укороченной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1×3,5 мкм, подвижные.

Культуральные признаки. При росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда М-15 с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде pTUL4spCBD гена β-лактамазы (bla), и к канамицину (до 30 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде pREP4 гена, кодирующего устойчивость к канамицину (kan).

Полученный штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-8728.

Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм., индуцировали 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 8 ч.

Для контроля продукции рекомбинантного белка TUL4spCBD клетками Е. coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] применяли метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изо-пропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штаммов Е. coli M15 [pREP4] и Е. coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 36,1 кДа, что соответствует молекулярной массе рекомбинантного белка TUL4spCBD.

Уровень синтеза белка pTUL4spCBD определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы.

Согласно полученным данным, клетки штамма Е. coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] синтезируют около 75 мг иммунореактивного TUL4spCBD белка на литр культуры клеток при концентрации 10⁹ клеток на мл.

Пример 3. Метод получения препарата белка TUL4spCBD, иммобилизированного на целлюлозе и раствора TUL4spCBD.

Клетки Е. coli M15 [pREP4], трансформированные плазмидой pTUL4spCBD, выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 ч. Культуру разводили до оптической плотности 0,7 при 530 нм, отбирали 400 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ, 50 мМ, рН 6,0), лизировали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 10 мин.

Для иммобилизации к супернатанту добавляли 2 мл гранулированной целлюлозы. Целлюлозу со связавшимся белком 5 раз отмывали от клеточного лизата в 10-кратном объеме 1% раствора тритона Х-100.

Для получения раствора белка TUL4spCBD целлюлозу с иммобилизованным белком вносили в колонку, снимали белок 100% формамидом и диализовали в течение ночи против раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,0 и 150 мМ NaCl.

По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН концентрация белка составляла 3 мг на 1 мл сорбента для иммобилизованного белка TUL4spCBD, 0,3 мг/мл для раствора белка TULspCBD. Степень чистоты всех препаратов составляла не менее 95%.

Пример 4. Способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD.

Для получения специфических антител против антигена TUL4spCBD, иммобилизованного на целлюлозе, использовали кроликов породы шиншилла с массой тела 2,5-3,0 кг, которых подкожно иммунизировали по специально разработанной схеме. Иммунизация состояла из 5 циклов, в каждом из которых доза вводимого антигена составляла 0,15 мг/мл TUL4spCBD, иммобилизованного на целлюлозе; в первом и втором циклах дополнительно использовали полный и неполный адъювант Freund's соответственно. Интервал между циклами иммунизации составлял три или пять недель. В результате получена гипериммунная кроличья сыворотка, содержащая антитела.

Специфичность антител определяли методом иммуноблоттинга. Для этого получали лизаты бактерий штамма F. tularensis 15. Для получения лизатов использовали 18-24-часовые культуры клеток, выращенных при 37°С на цистиносердечном агаре с гемоглобином (CHA+Hg, Difco, США). Отмытые физиологическим раствором бактериальные клетки (рН 7,0-7,2) ресуспендировали в растворе 62,5 мМ трис-HCl (рН 6,8) с 2% ДСН, 5% 2-меркаптоэтанолом, 10% глицерином до концентрации 2,5х10⁹ КОЕ на 1 мл и инкубировали на кипящей водяной бане в течение 6 мин.

Полученные лизаты и очищенный белок TUL4spCBD подвергали ДСН-ПААГ электрофорезу в 12% геле с последующим переносом белков на нитроцеллюлозные фильтры. Для выявления антигена TUL4 в качестве антител использовали кроличью сыворотку к белку TUL4spCBD, после чего проводили обработку конъюгатами белка А с пероксидазой хрена. Результаты иммуноблоттинга продемонстрировали взаимодействие специфической сыворотки с белком, соответствующим по подвижности белку TUL4 клеточного лизата штамма F. tularensis 15, и с рекомбинантным белком TUL4spCBD.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии, микробиологии. Предложен рекомбинантный белок TUL4spCBD, который состоит из белка TUL4 Francisella tularensis, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum, обладает антигенными свойствами белка TUL4 и способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащими сорбентами. Описана рекомбинантная плазмидная ДНК pTUL4spCBD размером 4388 н.п., кодирующая рекомбинантный белок TUL4spCBD. Плазмида содержит: искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка TUL4spCBD, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 н.п.), ген рекомбинантного белка TUL4spCBD (115-1113 н.п.), терминатор транскрипции (1134-1230 н.п.); бактериальный оперон бета-лактамазы, определяющий устойчивость к ампицилину (4183-3323 н.п. комплементарной цепи); бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E. coli (4388 н.п.). Предложены также штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD], депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-8728, продуцент рекомбинантного белка TUL4spCBD и способ получения очищенного, сконцентрированного и иммобилизованного рекомбинантного белка TUL4spCBD из указанного штамма путем обработки целлюлозосодержащим сорбентом супернатанта гидролизата клеток Escherichia coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] обработки. Раскрыт способ получения специфических антител к белку pTUL4spCBD, предусматривающий иммунизацию животных иммобилизованным на целлюлозе рекомбинантным белком TUL4spCBD. Предложенное изобретение обеспечивает высокий уровень продукции рекомбинантного белка TUL4spCBD, упрощение процесса его очистки, концентрирования и иммобилизации белка на целлюлозосодержащем сорбенте, что достигается за счет введения в состав рекомбинантного белка TUL4spCBD целлюлозосвязывающего домена из эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum. 5 н.п. ф-лы, 1 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTUL4spCBD, кодирующая синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, состоящего из белка TUL4 Francisella tularensis, Gly-Ser спейсера, целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum, размером 4388 н.п., имеющая последовательность нуклеотидов №1 и содержащая

искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка TUL4spCBD, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 н.п.), ген рекомбинантного белка TUL4spCBD (115-1113 н.п.), терминатор транскрипции (1134-1230 н.п.);

бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампицилину (4183-3323 н.п. комплементарной цепи);

бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е.coli.