ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА С СОДЕРЖАНИЕМ КСЕНОГЕННЫХ ОЛИГО- ИЛИ/И ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДОВ Российский патент 2006 года по МПК A61K9/06 A61K9/14 A61K31/7105 A61P31/22 A61P35/00 

Изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим в качестве активного компонента ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды. Также оно относится к применению таких ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов при лечении инфекций, вызванных вирусным герпесом, и кожных злокачественных заболеваний.

Уровень техники

Вирусы семейства Herpesviridae представляют собой патогенные, распространенные во всем мире вирусы, от которых страдает большая часть позвоночных. Наиболее важными вирусами герпеса человека являются вирусы пузырькового герпеса 1 и 2, вирус опоясывающего лишая, вирус ветряной оспы зостер и человеческий цитомегаловирус. Вирус пузырькового герпеса вызывает у иммунокомпетентных индивидуумов поражения кожи и слизистых оболочек, которые в виде рецидивов могут повторяться с разной частотой. Различают разные вирусы герпеса в зависимости от локализации поражений, например, пузырьковый герпес губ, герпес половых органов и пр.

Применяемые в настоящее время методы терапии против этих вирусов имеют своей главной целью подавление вирусной репликации, например, посредством ацикловира, являющегося известным ингибитором вирусной ДНК-полимеразы. Правда, с течением времени вирус преобретает устойчивость к действию ацикловира, это касается, в частности, вируса пузырькового герпеса. Кроме того, хотя традиционные средства и снижают острые формы поражения, однако эффективно рецидивы не предупреждаются.

В конце 60-х и начале 70-х годов в рамках исследований в области трансплантации было установлено, что ткани, предварительно обработанные ксеногенными гетерогенными нуклеиновыми кислотами, или слабые антигены при разных иммунологических методах исследования обнаруживали существенно повышенные антититры. Эти результаты были затем подтверждены рядом разных антигенов при исследованиях in vitro и т vivo. Однако отсутствовали признаки того, что нуклеиновые кислоты и, в частности, олиго- или/и полирибонуклеотиды ксеногенного происхождения могут найти применение в борьбе с инфекциями.

Прежде всего в США проводились одновременно опыты с определенными искусственными поли- и олигонуклеотидами, в частности рибонуклеотидами, которые однако in vivo далее не проводились из-за высокой токсичности.

Из US 4213970 известен препарат транспортной РНК, содержащий также ДНК, в качестве антивирусного средства. Это средство используется преимущественно в водной среде и должно снова применяться каждый день или раз в два дня. О возможности предупреждения рецидива не сказано. В FR 2713487 описано гомеопатическое средство для лечения в числе прочего и инфекционных заболеваний, которое разводится в водном растворе обычно в количестве 10^-36, что теоретически исключает присутствие в нем нуклеиновой кислоты, в которой может содержаться ДНК или РНК.

Задачей настоящего изобретения является создание лекарственного средства для лечения инфекций герпесного вируса и злокачественных кожных болезней. Еще одной задачей изобретения является создание лекарственного средства, которое снижает количество рецидивов при кожных поражениях, в частности, при вирусных поражениях.

Сущность изобретения

Задача решается согласно изобретению с помощью лекарственного средства, содержащего в качестве активного начала ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды.

Ксеноген в смысле настоящего изобретения означает, что рибонуклеиновая кислота получена из другого организма, чем тот, который подлежит лечению, т.е. такие олиго- или/и полирибонуклеотиды, которые не происходят из организма, в который вводится лекарственное средство. Из ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов согласно изобретению речь идет предподчительно о таких из них, которые получены из животных тканей (например, тканей крупного рогатого скота, эмбрионального теленка), из растений и одноклеточных организмов, преимущественно дрожжевых клеток (в частности, Saccharomyces cerevisiae). Предпочтительно применяются олиго- или/и полирибонуклеотиды, полученные из организмов, которые по истории своего развития по возможности дальше отстоят от подлежащего лечению организма. Следовательно, в лекарственных средствах для человека применяется предпочтительно РНК, полученная из тканей животных, особо предпочтительно из растений и одноклеточных организмов, таких как дрожжи.

В основе изобретения лежат исследования с применением содержащих РНК препаратов для лечения герпесных инфекций. При этом было выявлено, что нанесение изолированной ксеногенной РНК на кожное поражение пациентов, страдавших пузырьковым герпесом губ, пузырьковым герпесом cruris disseminata и герпесом половых органов, сопровождалось - помимо немедленного воздействия на пораженные участки - также неожиданно значительным сокращением количества рецидивов у пациентов, страдавших от их частого повторения на протяжении года. Затем было установлено, что аналогичный эффект - указанная РНК - вызывает и при кожных опухолях, например при базалиомах.

Применяемые согласно изобретению олиго- или/и полирибонуклеотиды являются нетоксичными и не антигенными.

Эффективно могут применяться препараты из общей РНК, ее солей и соединений. Особо предпочтительна тРНК. В качестве способа получения применяемых согласно изобретению РНК особо предпочтительна экстракция фенолом, это - способ, который специально разделен на методы I и II.

Эффективное количество ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов при разовой дозе введения зависит для каждого пациента от разных факторов, например, от локализации поражений или от размера соответствующей поверхности, от вида введения. Доза составляет 0,1 мг и более на дозированную единицу. Нижний количественный предел на одну дозированную единицу составляет предпочтительно по меньшей мере 0,5 мг, более предпочтительно по меньшей мере 2 мг и еще более предпочтительно по меньшей мере 5 мг; верхний предел составляет предпочтительно 5 мг, более предпочтительно 20 мг и еще более предпочтительно 10 мг.

Предпочтительно, чтобы лекарственное средство согласно изобретению содержало в себе ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды в основном в безводной форме, например, в виде флокул, порошка, гранулята, мази и пр. Однако олиго- или/и полирибонуклеотиды могут приготовлены и в виде водного или иного раствора.

Кроме того, лекарственное средство согласно изобретению может содержать в себе физиологические совместимые наполнители, вспомогательные вещества, разбавители или/и добавки или/и стимуляторы.

Галеновые композиции, содержащие ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды согласно изобретению, могут выпускаться для орального приема в виде просто таблеток, таблеток для сосания или жевания, жидких суспензий, порошков или гранулятов, эмульсий, в твердых или мягких капсулах, в виде сиропа или эликсиров, обладающих замедленным действием, или в виде осмотических капсул с медленным растворением.

Другой галеновой формой, обладающей особо превосходным действием, являются безводные мази из смесей полиэтиленгликоля.

Назначение может быть преимущественно наружным, оральным, парентеральным, ректальным или ингаляция. Выражение "парентеральный" здесь означает подкожные, внутривенные, внутримышечные или внутристернальные инъекции или приемы вливания.

При наружном применении используемая общая РНК или тРНК, предпочтительно в виде порошка или полиэтиленгликолевой мази (т.е. в безводной форме) наносится на пораженный участок, при использовании порошковой формы кожа может быть слегка увлажнена. Предпочтительно при этом сушить на воздухе в открытом виде.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является композиция лекарственного средства для терапии вызванных вирусом герпеса заболеваний, которая также снижает частоту рецидивов этих заболеваний. Особо предпочтительным является средство согласно изобретению для терапии поражений, вызванных вирусами пузырькового и опоясывающего герпеса, например поражений и рецидивов, вызванных пузырьковым герпесом губ (губные пузырьки) и герпесом половых органов.

Ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды и лекарственное средство согласно изобретению пригодны также для лечения кожных злокачественных заболеваний, таких как, например, базалиомы.

Еще одним предметом изобретения является применение названных ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов для приготовления лекарственного средства для лечения заболеваний, вызванных вирусами герпеса, и кожных опухолей.

Предпочтительно начинать лечение поражения или рецидива по возможности рано, причем уже одноразовое применение снижает частоту повторного проявления.

Наряду с лечением людей с применением ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов согласно настоящему изобретению такое лечение показано и для теплокровных, таких как, например, лошади, крупный рогатый скот, овцы и пр.

Ниже изобретение поясняется примерами и результатами опытов.

Примеры

Пример 1

Получение олиго- или/и полирибонуклеотидов для применения согласно изобретению

В специальной литературе описаны многочисленные методы получения нуклеиновых кислот, нуклеотидов и нуклеозидов, известных каждому, имеющему в этой области опыт. Два метода, различающиеся незначительными модификациями и базирующиеся на обработке фенолом, предпочтительно применяются в данном случае, это - метод I для получения общей РНК (Георгиев Г.П. и Мантиева В.Л., Biochim. Biophys. Acta 61, 153 (1962)) и метод II для получения тРНК (Bauer S. и др., Biotechnology and Bioengineering 15, 1081 (1973)). Оба эти методы предназначены для экстракции в значительных количествах.

Метод I

15%-ую суспензию пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), помещенную в буферный раствор (А) [0,001 М ЭДТК, 0,01 М трис-HCl, рН 5-6,25% сахарозы, 0,5% додецилсульфата натрия, 0,3% дезоксихолата натрия], гомогенизировали в мешалке Воринга при скорости вращения 3000 об/мин, при температуре 10°С в течение 3 минут. Продукт гомогенизации примешивали к одинаковому объему раствора (В) [80% перекристаллизованного фенола в буферном растворе (А), 0,1% 8-оксихинолина, 1,2% диэтилпирокарбоната] с последующим медленным перемешиванием при 60°С в течение 30 минут. Все буферные растворы были приготовлены на деионизированной воде, предварительно смешанной с бентонитом. После этого фенольный гомогенат центрифугировали при 10000g при комнатной температуре, около 20°С, в течение 15 минут. Водную фазу сливали, фенольную и промежуточную фазы отбрасывали. В водную фазу добавили одинаковый объем 1:1 смеси из раствора (В) и хлороформизоамилового спирта (96:4) и экстрагировали, как описано выше. Водную фазу трижды экстрагировали встряхиванием с использованием полуобъема диэтилэфира с целью удаления остаточного фенола. Раствор довели до 2% ацетата натрия и перевели РНК в осадок с помощью 2,5 объемов абсолютного этанола.

Выпавшую в осадок РНК выделили центрифугированием при 0°С и скорости 5000 об/мин и поместили в 0,01 М ледяного трис-HCl, рН 7,0, и 0,001 М MgCl₂. Для разложения возможно присутствующей ДНК в раствор примешали чистую, полученную электрофорезом панкреатическую ДНКазу (4 мкг/мл) и инкубировали в течение 3 часов при 22°С. Затем остатки протеина, ДНКазу и РНКазу с проназой (10 мкг/мл) подвергали перевариванию в течение 3 часов при 37°С. В течение этого времени произошло разрушение проназы под действием самопереваривания. Раствор РНК, как описано выше, экстрагировали раствором (В) в течение 20 минут при 60°С с щадящем перемешиванием, фазы отделяли центрифугированием, водную фазу слили и экстрагировали диэтилэфиром при встряхивании. После добавки ацетата натрия (с конечной концентрацией 2%) РНК перевели в осадок с помощью 2,5 объема этанола и отделили центрифугированием. Осадок поместили в ледяной 2%-ный ацетат натрия, осадили 2,5 объемами этилового спирта и отстаивали в течение ночи при -20°С в спиртовой смеси. Затем осадок отделили центрифугированием, дважды промыли 75%-ным, дважды абсолютным этанолом и дважды диэтиловым эфиром. После сушки в термостате получили рыхлую сухую РНК, которую хранили в темной стеклянной посуде при комнатной температуре.

Метод II

Этот метод также предназначен для экстракции дрожжей в больших количествах (кодограммы).

Дрожжи в заданном весовом количестве гомогенизировали в четырехкратном объеме буферного раствора (А) в холодном помещении (см. выше метод I). К продукту гомогенизации добавляли фенольный раствор (В) в количестве 40% в объемном отношении и кубики льда из деионизированной воды в количестве 5% в отношении веса к объему и перемешивали в течение 30 минут. Надосадочную жидкость отсосали и еще дважды обрабатывали фенолом, как описано выше для метода I. Водные надосадочные жидкости собрали в один сосуд, в котором находилась взвесь диэтиламиноэтила и целлюлозы (около 10% в отношении веса к объему, Whatman DE-22) в половинном объеме от собранных надосадочных жидкостей. Взвесь диэтиламиноэтила перевели в суспензию перемешиванием в течение 30 минут. После этого отстаивали взвесь диэтиламиноэтила в течение часа. Надосадочную часть отсосали. В это время промежуточную и фенольную фазы дважды смешивали с аликвотным количеством раствора (С) (83% дионизированной воды, 15% в отношении веса к объему кубиков льда, 2% концентрата ацетата магния [0,5 М ацетата магния в 0,25 меркаптоэтанола] в течение 30 минут и затем сепарировали в течение 70-80 минут. Водные надосадочные части перевели в сосуд с диэтиламиноэтилом, снова размешали и отстаивали. Надосадочную жидкость отсосали, диэтиламиноэтил, как указано выше, сначала дважды промыли раствором (С), затем повторно раствором (D) (2 объема концентрата ацетата магния, 2 объема концентрата NaCl [3,75 М NaCl в воде], 0,2 объема концентрата триоксиметиламинометана и HCl [2,5 М триоксиметиламинометана и HCl, рН 7,5, в воде, 96 объемов воды]).

Затем диэтиламиноэтил целлюлозу поместили в колонку, которая снизу была закрыта. Все последующие операции проводились в холодном помещении при 4°С. Колонку промывали раствором (D) в 12-кратном количестве от объема колонки при скорости потока 1,4 л/ч (только самотеком). Затем тРНК элюировали раствором Е [2 объема концентрата ацетата магния, 0,2 объема коцентрата трис-HCl, 14 объемов концентрата Na-Cl, 84 объема воды, конечная концентрация NaCl=0,525 М) при потоке 3 л/ч. Фракции с содержанием более 35 А_260нм единиц/мл объединили и осадили этанолом в количестве 1,5 объема. Далее действовали, как описано в методе I.

В качестве альтернативы осадок может помещаться в воду и лиофилизироваться.

Вариантом данного метода является обычная обработка исходного материала фенолом: из верхней фазы осаждают сырую тРНК с помощью изопропанола. После центрифугирования осадок экстрагируют буферным раствором ацетата натрия и проводят хроматографию на ДЭАЕ целлюлозе. Элюирование производится при градиентах ацетата натрия/хлорида натрия, известных биохимикам, занятым в этой области. Пригодные к использованию фракции, см. выше, определяют измерением соотношений и объединяют. С помощью этанола переводят в осадок тРНК, осадок, как указано выше, помещают в воду и преимущественно лиофилизируют.

Следующие тесты проводились для исследования степени чистоты общей РНК и тРНК и для получения их характеристик.

Белок определяли по Lowry О.И. и др. (J.Biol. Chem. 193, 265 (1951)) и через А₂₆₀/А₂₈₀≅2, ДНК по Дише (Mikrochemie 8, 4 (1930), общую РНК по Мейбауму (Physiol. Chem. 258, 117 (1939)), количественное определение тРНК и встраивание аминокислоты по Шпринцлу и Штернбаху (Methods in Enzymology 59, 182 (1979)), токсичность по М.Нельднеру (индивидуальное сообщение), отсутствие вызывающих лихорадку компонентов in vitro по Германской фармакопее 1997 г. (тест LAL) и in vivo по Европейской и Германской фармакопее 1997 г.

Результаты исследований

(Свойства общей РНК и тРНК, как усредненные значения по десяти тестам).

Абсорбция

А₂₆₀/А₂₈₀=1,94-2,0.

Анализ на содержание С, Н и N

C32,6732,42H5,225,20N2,292,00

при согласующихся значениях разных общей РНК и тРНК.

Ультрафиолетовый и инфракрасный спектры

Ультрафиолетовый и инфракрасный спектры варьируются, они почти одинаковые, но не идентичны в соответствии с биологическими веществами.

Молекулярный вес

Общая РНК и тРНК, полученная из дрожжей, имели средний показатель ≅22000-27000 дальтонов, который варьировался при разных препаратах.

ПротеинДНК (общее содержание)2,3%отр. общая РНК Saccharomyces cerevisiae1,9%отр. тРНК Saccharomyces cerevisiae0,9%отр. общая РНК, происходит от крупного  рогатого скота

Качество среднее, обычно принятое. Повышенная чистота, полученная при непропорционально возросших затратах, не сопровождалась существенным улучшением терапевтического эффекта.

Встраивание аминокислоты при наличии тРНК, среднее значение по 10 исследованиям

Лизин69-85 пМоль/А₂₆₀ единицаФенилаланин41-55Серин39-50Валин77-90

Эти средние значения колеблются для дрожжей разных партий в указанных пределах.

Токсичность

Испытание на острую токсичность, проведенное на мыши:

Животные:мыши NMRI, самец, ф. "Janvier", ФранцияПрименение:введение внутрь вены хвостаВремя наблюдения:24 часаОбъем выборочной пробы:n=10 при максимальной концентрациивещество-эталон:а. общая РНК, полученная от крупного  рогатого скота;  b. тРНК, полученная из пивных дрожжей  (Saccharomyces cerevisiae)Растворитель:0,9% NaCl в воде

Результат:

При внутривенном введение максимальной дозы 1 г/кг/10 мл подопытные животные при наблюдении в течение 24 часов ничем не выделялись.

Отсутствие вызывающих лихорадку компонентов

А. Содержание вызывающих лихорадку компонентов в общей РНК и в тРНК, которые описаны выше, определяли тестом in vitro на эндотоксинах в соответствии с Германской фармакопеей 1997 г. (Тест LAL) и на кроликах в соответствии с Европейской / Германской фармакопеей 1997 г.

1. Общая РНК

Эндотоксин, стандарт ЕС 5 Амебоцитенлизат

- заявленная чувствительность: 0,06 ед. энтропии/мл

- найденная чувствительность: 0,06 ед. энтропии/мл

Испытательный раствор: 100 мг РНК, растворенной в 20 мл воды

LAL (0.5%).

Результат:

Содержание эндотоксина в испытатльном растворе с концентрацией 0,5%, разбавленного водой LAL в соотношении 1:5, составило <0,03 ед. энтропии/мл.

2. тРНК

Эндотоксин, стандарт ЕС 5

Амебоцитенлизат

- заявленная чувствительность: 0,06 ед. энтропии/мл

- найденная чувствительность: 0,06 ед. энтропии/мл

Испытательный раствор: 100 мг РНК, растворенной в 20 мл воды

LAL (0,5%).

Результат:

Содержание эндотоксина в испытатльном растворе с концентрацией 0,5%, разбавленного водой LAL в соотношении 1:10 составило <0,03 ед. энтропии/мл.

В. Испытание in vivo на отсутствие вызывающих лихорадку компонетов согласно Европейской /Германской фармакопии 1997 г.

1. Общая РНК

1%-й испытательный раствор вещества-эталона в воде без вызывающих лихорадку компонентов.

Доза: 1,0 мл/животное

Животные: 3 кролика, согласно Германской фармакопеи 1997 г.

Результат:

Сумма температурной разницы 3 кроликов составила 1,05°С, присутствие вызывающих лихорадку компонентов не установлено.

2. тРНК

1%-й испытательный раствор вещества-эталона в воде без вызывающих лихорадку компонентов.

Доза: 1,0 мл/животное

Животные: 2 группы по 6 кроликов, согласно Германской фармакопеи 1997 г.

Результат:

а. Сумма температурных разниц по 6 кроликам одной группы: 5,40°С.

b. Сумма температурных разниц по 6 кроликам другой группы: 4,10°С.

Вызывающие лихорадку компоненты подтверждены.

Пример 2

Доказательства эффективности веществ согласно изобретению

70 пациентов, из которых 40 страдали пузырьковым герпесом I (пузырьковым герпесом губ) и 30 пацинтов пузырьковым герпесом II (герпесом половых органов) с частыми рецидивами, лечились с применением общей РНК. РНК получили экстракцией из ткани эмбриона крупного рогатого скота, за исключением печени. Поршкообразную РНК наносили на слегка увлажненные пораженные участки в количестве от 5 до 10 мг - в зависимости от размера поражения - и сушили. Все пациенты наблюдались в течение года.

5 пациентов не ответили в отношении рецидивов, 7 пациентов не были проанализированы из-за отсутствия согласия с их стороны. Для остальных пациентов, у которых раньше отмечалось несколько рецидивов в год, отмечено существенное их снижение. Анализ производился с помощью непараметрического теста U Манна-Уитнея. Значимость результатов составила р<0,001 (SPSS, Npar, тест U Манна-Уитнея).

При двойном слепом опыте с наблюдением в течение года лечили две группы по 100 человек, страдавших соответственно пузырьковым герпесом губ и пузырьковым герпесом половых органов с количеством рецидивов свыше 4 в год, с применением общей РНК, полученной, как описано выше, из ткани крупного рогатого скота, и тРНК, пролученной из пивных дрожжей. Оценку производили через год по программе SPSS, Npar TEST: Mann-Whitney и тест X².

По сравнению с пациентами, принимавшими плацебо, снижение рецидивов было высоким: в обоих группах - р<0,001. Различие между обоими видами РНК было небольшим.

Данные результаты оправдывают применение РНК при лечении пациентов, тем более что на протяжении нескольких лет не отмечались побочные действия или отравления.

При использовании описанных веществ для лечения пузырькового герпеса лица у пациентов, страдавших также базалиомой, наблюдалось ее уменьшение. Поэтому лекарственного средства согласно изобретению показаны также для злокачественных заболеваний.

Предложено: применение ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов, а именно общей РНК и тРНК в качестве активного ингредиента безводного наружного лекарственного средства для однократного лечения при рецидиве опухолей кожи (например, базалиомы) или инфекций, вызванных вирусом герпеса, соответствующий способ лечения. Изобретение отличается тем, что заявленные безводные наружные лекарственные средства эффективно снижают рецидивы указанных заболеваний при одном приеме. 2 н.и 3 з.п. ф-лы.

1. Применение ксеногенных олигорибонуклеотидов и/или ксеногенной общей РНК и/или ксеногенной тРНК в качестве активного начала безводного, применяемого наружно однократно при рецидиве лекарственного средства для лечения герпесвирусных инфекций и/или кожных опухолей.2. Применение по п.1, отличающееся тем, что лекарственное средство содержит дополнительно физиологически совместимые наполнители, вспомогательные вещества, разбавители или/и добавки.3. Применение по 1 или 2, отличающееся тем, что указанные олигорибонуклеотиды, и/или ксеногенная общая РНК, и/или ксеногенная тРНК происходят из организмов, которые по своей истории развития далеко отстоят от подлежащего лечению организма.4. Применение по любому из предшествующих пунктов при лечении кожи или/и слизистой оболочки, пораженных вирусом пузырькового герпеса или/и вирусом ветряной оспы зостер.5. Способ лечения герпесвирусных инфекций или/и кожных опухолей, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в таком лечении, или животному однократно при рецидиве применяют ксеногенные олигорибонуклеотиды, и/или ксеногенную общую РНК, и/или ксеногенную тРНК в виде безводной композиции в эффективном количестве 0,1 мг и более на дозированную единицу.