ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 1998 года по МПК A61K31/70 A61K9/06 

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и касается средств для лечения герпетических инфекций.

Интерес к изучению инфекций, вызываемых у человека вирусом простого герпеса, остается постоянным на протяжении последних тридцати лет. Это обусловлено значительным ростом заболеваемости герпесом гениталий, офтальмогерпесом, невралгическим герпесом и т.д. Число госпитализированных в нашей стране больных с различными формами герпетической болезни ежегодно составляет 2,5 млн. человек.

В связи с этим разработка высокоэффективных противогерпетических препаратов остается по-прежнему актуальной. Необходим поиск средств, которые не только обладают противовирусной активностью, но могут быть просты в изготовлении и применении. Перспективными в этом направлении являются препараты, которые не требуют парентерального или инъекционного введения, т.е. препараты наружного применения, в частности мази.

Для ряда инфекций показано, что эффективным является аппликационный способ применения химиотерапевтических средств [1] или индукторов интерферона, при этом достигается влияние препарата в месте размножения вируса или внешних проявлений заболевания [2, 3].

Известен препарат "Ацикловир" фирмы Glaxo Wellcome (Великобритания) и его производные [8] для лечения герпетических и других вирусных инфекций, который представляет собой ациклический нуклеозидный аналог гуанина, полученный синтетическим путем. Мазевая форма содержит 3% ацикловира и применяется для лечения Herpes simplex гениталий [4]. При этом мазь наносится на пораженное место 5 раз в день в течение 3 дней. Однако даже столь интенсивное применение мази на ранней стадии инфекции не достаточно эффективно, поскольку сопровождается накоплением вируса в пустулах и образованием эрозий в пораженных местах. Мазь "Ацикловир", обладая способностью купировать острую фазу заболевания, не предотвращает развитие повторных рецидивов.

Наиболее близким препаратом по составу и достигаемому эффекту является мазь "Ларифан" (производство Латвии) - высокомолекулярный индуктор интерферона природного происхождения, представляющий собой двуспиральную РНК фага f₂ с молекулярной массой выше 200000 [5, прототип].

"Ларифан" проявляет защитное действие при различных вирусных инфекциях, обладает выраженными иммуномодулирующим, а также антибактериальным эффектом. Применяется в качестве лечебно-профилактического средства при арбовирусных и рабдовирусных инфекциях и терапевтического - при герпетических заболеваниях.

Мазь содержит 0,05% ларифана. Ее наносят на пораженные места 3-4 раза в день. При этом уровень интерферона в сыворотке крови достигает максимальных значений через 6-8 ч. Однако уже через сутки индукция интерферона значительно снижается, что удлиняет курс лечения до 10-14 дней. Еще одним недостатком мази "Ларифан" является то, что активную основу его составляет фаговая нуклеиновая кислота, представляющая потенциальную опасность для человека в связи с недавним обнаружением массивной контаминации фагами вирусных вакцин.

Технической задачей изобретения является создание нового противовирусного средства на основе dsРНК как индуктора интерферона, который может применяться с большей эффективностью для дерматологической обработки поражений, вызванных вирусом герпеса, обладает пролонгированным действием и безвреден для организма человека.

Предлагаемое противовирусное средство в виде мазевой композиции содержит 0,15 - 0,5 мас.% комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных рибонуклеиновых кислот из Saccharomyces cerevisiae (комплекс ds РНК), заключенного в водной фазе эмульсионной основы следующего состава: вазелиновое масло - 20%, твин-80 - 17%, эмульгатор T-2 - 13%, хлоргексидина биглюконата - 0,04% и вода до 100%.

Сущность изобретения заключается в том, что предложено противовирусное средство - мазь, содержащая в качестве лекарственного средства комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных рибонуклеиновых кислот из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (комплекс ds РНК). Указанный комплекс является биологически активной составной частью препарата "Ридостин", который известен как индуктор интерферона, обладающий высокой эффективностью, сниженной токсичностью и хорошей переносимостью (6). Ридостин представляет собой стерильный лиофильно высушенный раствор указанного выше комплекса натриевых солей dsРНК в 0,9% изотоническом растворе NaCl.

В 1993 г решением Президиума Фармакологического комитета МЗМП РФ было рекомендовано применение первого отечественного индуктора интерферона ридостина в качестве противовирусного средства для лечения герпетических заболеваний (протокол N 23 от 23.12.94). Учитывая высокий противогерпетический потенциал ридостина, он может быть использован в качестве основы для создания мазевой формы противовирусного средства.

Мазь готовится следующим образом: вазелиновое масло, твин-80 и эмульгатор T-2 смешивают в необходимых весовых количествах и нагревают до 75^oC до полного расплавления смеси, дистиллированную воду, подогретую до 75^oC, медленно вливают в расплавленную массу при постоянном перемешивании, снижают температуру до 40^oC и вводят комплекс ds РНК, растворенный в части дистиллированной воды, необходимой по рецепту, и хлоргексидина биглюконат. Перемешивание ведут до образования стойкой эмульсии.

При проведении клинических испытаний предложенной мази показана высокая противогерпетическая активность, хорошая переносимость и способность значительно уменьшать частоту рецидивов.

На модели генитального герпеса у морских свинок продемонстрирован выраженный лечебный эффект патентуемой мази при 3-кратной аппликации (см. табл. 1), что существенно ниже, чем рекомендовано в схемах применения других мазей.

Сравнение эффективности применения препарата "Ацикловир" и заявляемой мазевой формы показывает, что ранее применение мази, содержащей комплекс ds РНК, не приводит к образованию эрозий и пустул у инфицированных животных, в то время как лечение ацикловиром сопровождается накоплением вируса в пустулах в первые 3 суток. По сравнению с ацикловиром кратность нанесения заявляемой мази оказывается меньшей и составляет 3 аппликации (ацикловир-5).

В связи с полученными результатами можно предположить, что препарат вызывает продукцию эндогенного интерферона, который в свою очередь препятствует как размножению вируса простого герпеса 2 типа, так и снижает воспалительные явления при этом заболевании. Заявляемая мазевая форма обладает противогерпетическим действием, что показано на модели герпеса гениталей (морские свинки).

В экспериментах на морских свинках оценивали уровень интерферона в разные сроки после применения мази индуктора. При однократной аппликации мази обнаруживается некоторое повышение уровня интерферона через 24 ч (см. табл. 2). Дальнейшее (максимальное) нарастание регистрируется через 3 дня.

Сравнение интерферониндуцирующей активности патентуемой мази и известного препарата "Ларифан" (производство Латвии) показывает, что уровень интерферона в сыворотке крови при применении ларифана достигает максимальных значений через 6-8 ч и к 24 ч приближается к следовым количествам, тогда как повышение титра интерферона после применения мази, содержащей комплекс ds РНК из дрожжей, отмечается через 3-6 ч, достигает максимума через 3 суток и регистрируется в крови в течение 7 дней. Этот факт явно указывает на пролонгированный лечебный эффект нового противовирусного средства.

Изучение биологических эффектов заявляемой мази показало, что при однократном местном применении у мышей повышается фагоцитарная активность макрофагов (см. табл. 3), а у морских свинок индуцируется продукция сывороточного интерферона (табл. 2). Сохранение основных свойств индуктора интерферона в мазевой форме свидетельствует о правильно выбранном составе наполнителя.

Мазь хранится при 4^oC в течение года. Полученная композиция имеет следующие физико-химические характеристики:
Подлинность - целостность двуспиральной РНК после приготовления мази выявляется методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле: на дорожках, содержащих образцы мази, видны две полосы, соответствующие L и M фрагментам dsРНК в эталонном образце ридостина (фиг. 1)).

Водородный показатель pH - 5,5-6,5
Фагоцитозстимулирующая активность,% - не менее 125, P 0,05
Микробиологическая чистота, KOE/г - не более 100
При хранении в течение года приведенные показатели существенно не изменяются и отвечают требованиям ГФ СССР XI.

Изобретение иллюстрируется следующим чертежом: электрофореграмма ридостина и мазевой формы комплекса ds РНК в 1% геле агарозы, где дорожка 1 - ридостин 100 мкг/мл; дорожки 2-4 - мазь в 2-х, 4-х и 8 - кратном разведении.

Сущность изобретения раскрывается в следующих примерах:
Пример 1. Приготовление противовирусного средства для наружного применения.

Мазь готовят в термостойком стакане объемом 600 мл. На весах взвешивают 100 г вазелинового масла, 65 г эмульгатора T-2 и 85 г твина-80. Стакан помещают в водную баню, нагретую до температуры 75^oC, и выдерживают 25-30 мин до полного расплавления смеси.

245 г дистиллированной воды нагревают до температуры 75^oC и медленно вливают в расплавленную смесь при постоянном перемешивании. Охлаждают до температуры 40^oC при постоянном перемешивании и вводят 1 г хлоргексидина биглюконата.

0,75 г комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных рибонуклеиновых кислот Saccharomyces cerevisiae растворяют в 5 мл дистиллированной воды и вводят в смесь при температуре 37^oC; продолжая перемешивать, охлаждают до температуры 25^oC.

Мазь фасуют во флаконы из темного стекла по 5 г и закрывают полиэтиленовыми крышками.

Пример 2. Определение подлинности противовирусного средства.

Определение подлинности мазевой формы комплекса dsРНК осуществляют путем установления целостности dsРНК - основного компонента лекарственного средства методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Для этого образцы раствора мази (1 г мази в 3 мл электрофоретического буфера pH, 8,05) разводят в 2, 4, 8 раз буферным раствором и наносят по 20 мкл полученных проб в смеси с 5 мкл бромфенолового синего и сахарозы на трубки с 1% агарозным гелем. В качестве контроля используют образец ридостина. Электрофорез проводят 1-1,5 ч при токе 10 мА на трубку.

После окончания электрофореза гель окрашивают в растворе бромитого этидия в течение 15 мин, промывают дистиллированной водой и просматривают в ультрафиолетовом свете при помощи хромоскопа.

Результаты электрофореза представлены на фиг. 1. На дорожках (2, 3, 4), содержащих образцы мази, четко видны две полосы двуспиральной РНК, соответствующие L и M-фрагментам dsРНК в эталонном образце ридостина (дорожка 1).

Пример 3. Лечебный эффект противовирусной мази.

Изучение специфической активности мазевой формы комплекса dsРНК проводят на модели генитального герпеса (герпес 2 типа штамм MS из ГКВ РАМН) самцов морских свинок. Перед использованием в эксперименте вирусный штамм пассируют дважды на культуре клеток Vero E6. Титр вируса составляет 10⁶ ЦПД.

В эксперимент берут 48 животных, которых делят на 6 групп. Животные 1-5 групп заражаются на наружную поверхность penis вышеуказанным штаммом вируса герпеса. Первая группа животных получает терапию в виде мазевых аппликаций через 1, 24 и 48 ч после заражения. Вторая группа животных получает препарат "Ридостин", предварительно растворенный в 3% глюкозе, в виде аппликаций на место заражения в те же сроки. Третья группа животных получает по той же схеме препарат сравнения - вазелин. Четвертая группа - положительный контроль (животные заражены и не получают никакого лечения), а пятая группа - отрицательный контроль, т. е. здоровые животные, по отношению к которым сравнивается интенсивность герпетических изменений. Лечебный эффект оценивают по разности баллов в 4-ой - 1-ой опытных группах в период максимального проявления заболевания (3-4 день после инфицирования).

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что в группах животных, которые не получали лечения мазевой формой препарата (группы 2-4), развивается клиническая картина герпетической инфекции: в первые двое суток отмечается небольшая отечность и покраснение на месте заражения, к 72 ч определяются некоторые пустулезные явления, которые затем (96-120 часы) сопровождаются выраженной гиперемией и появлением эрозий на месте пустул. У животных 3-4 групп на 96 ч после заражения из пустулезных элементов или эрозий был выделен вирус герпеса 2 типа 10² ЦПД. У животных второй группы, получавших лечение препаратом "Ридостин" растворенном в глюкозе, на месте заражения отмечается отечность и гиперемия (в первые двое суток) к третьим суткам отмечаются отдельные пустулезные проявления. К 120 ч эти явления снижаются. Тем не менее эффект применения жидкой формы препарата "Ридостин" не столь выражен, как при применении мазевой формы. В то же время при применении мазевой формы комплекса dsРНК получена выраженная терапевтическая эффективность - лишь у части животных (два из шести) отмечалось покраснение и отечность на месте заражения в первые двое суток. Других характерных для герпесвирусной инфекции проявления отметить не удалось.

За животными первой группы наблюдение продолжалось 60 суток. У этих животных отмечен эффект купирования внешних проявлений герпетической инфекции после применения мазевой формы. На всем сроке наблюдения не отмечено рецидивов заболевания, выделений вируса как в месте заражения, так и из крови.

Таким образом, мазевая форма комплекса dsРНК обладает выраженной противогерпетической активностью. Противовирусный эффект препарата обусловлен как его формой, так и способом применения. В контрольных группах ни вазелин, ни местная аппликация растворенной формы, ни инъекция препарата не обеспечивают противовирусного эффекта.

Пример 4. Оценка интерферониндуцирующей активности мази комплекса ds РНК.

Изучение интерферониндуцирующей активности заявляемой мазевой формы проводят в экспериментах на морских свинках. Для этого формируют 4 группы по 8 особей в каждой. Животным первой группы на наружную поверхность penis наносят в виде аппликации мазь. Второй группе - ридостин, растворенный в 3% глюкозе. Третьей группе - вазелин. Все препараты наносят однократно. Четвертая группа является интактным контролем. У животных через 1, 3, 5 и 7 суток берут кровь для определения титров интерферона. Продукцию сывороточного интерферона у животных определяют в цитопатическом тесте на культуре клеток Л-68, используя в качестве тест-штамма вирус EMC. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Анализ представленных данных показывает, что уровень исходного сывороточного интерферона во всех экспериментальных группах одинаков и составляет 2-4 МЕ/мл. Через 1, 3, 5 и 7 суток у животных 2-4 групп не отмечалось продукции сывороточного интерферона. Напротив, в первой группе после однократной аппликации мази обнаруживается некоторое повышение уровня интерферона через 24 ч. Дальнейшее нарастание регистрируется через 3 дня и к 7 суткам показатели интерферона в этой группе не отличаются от данных трех остальных групп.

Через 1, 3, 5 и 7 суток у животных 2-4 групп не отмечается продукции сывороточного интерферона. Напротив, в первой группе после однократной аппликации мази обнаруживается некоторое повышение уровня интерферона через 24 ч. Дальнейшее нарастание регистрируется через 3 дня и к 7 суткам показатели интерферона в этой группе не отличаются от данных трех остальных групп.

Таким образом, мазевая форма комплекса ds РНК при местном применении обладает способностью индуцировать интерферон у морских свинок. Характерно, что латентный период продукции сывороточного интерферона, вызываемый мазью, более длителен, чем в случае применения инъекционной формы ридостина. Если наибольшие титры интерферона после парентерального применения ридостина регистрируются через 3-6 ч, то при мазевых аппликациях - через 3 суток.

Пример 5. Определение биологической активности мазевой формы комплекса ds РНК.

Известно, что вирусы герпеса способны угнетать функциональную активность макрофагов и синтез интерферона, что в конечном итоге сказывается на неспособности элиминировать вирус из организма (7). Очевидно, что при отборе перспективных антигерпетических средств следует оценивать их влияние на фагоциты.

Биологическую активность заявляемой мазевой формы оценивают по фагоцитарной активности на монослойной культуре перитонеальных макрофагов мышей ICR, самцов. На свежевыстриженную холку загривка мышей наносят мазь ридостина в количестве 30-32 мг на см² поверхности и втирают в течение 10-12 сек. В контрольных группах используют основу мази, которую втирают аналогичным образом.

Исследование фагоцитоза макрофагов проводят через 5, 24, 48 ч после втирания мази. Макрофаги выделяют из перитонеальной полости мышей путем вымывания средой Хенкса и гепарином (5 ед.акт. на мг среды). Культивирование и все последующие операции проводят в среде Хенкса с 3% сыворотки крупного рогатого скота. Суспензию макрофагов (1•10⁶ в мл) высевают на покровное стекло, помещенное в бюкс диаметром 35 мм. Инкубацию проводят 1 ч при температуре 37^oC. Для исследования фагоцитоза монослой отмывают от неприкрепившихся клеток и в качестве объекта фагоцитоза наносят 20 мкл суспензии опсонизированных эритроцитов барана (ЭБ) из расчета 20 эритроцитов на макрофаг. Монослой макрофагов продолжают инкубировать в течение 45 мин, отмывают, высушивают, готовят для микроскопического анализа.

Оценку фагоцитоза проводят путем подсчета перитонеальных макрофагов, поглотивших эритроциты барана.

Фагоцитарную активность (ФА) оценивают в % от общего числа макрофагов. Достоверность различий (Р) данных, полученных в опыте и контроле, оценивают с помощью критерия Стьюдента при обсчете 250 клеток на монослой. Процент стимуляции определяют по отношению показателей опытных групп животных к контролю по формуле:

Результаты этих экспериментов представлены в таблице 3.

Как видно из представленных данных, через 5 ч уровень фагоцитоза макрофагов в опыте и контроле одинаков (P = 0,05). Однако уже через 24 ч показатель функциональной активности перитонеальных макрофагов опытных животных возрастает и превышает контрольный в 1,5-2 раза (P = 0,05). Через двое суток обнаруживается уменьшение фагоцитарной активности макрофагов (P = 0,05), хотя в целом по группам эта активность остается повышенной.

Таким образом, исследование показывает, что патентуемая мазевая форма обладает выраженной способностью активировать фагоцитоз. Это указывает на лечебное антигерпетическое действие препарата мази.

Пример 6. Определение граничного содержания комплекса dsРНК в мази.

Оптимальный интервал содержания комплекса dsРНК в мази определяют в экспериментах стимуляции фагоцитоза макрофагов. Исследования фагоцитоза макрофагов проводят после втирания мази с содержанием комплекса dsРНК 0,075%, 0,15%, 0,5%, 0,75%.

Результаты этих исследований представлены в табл. 4.

Исходя из полученных данных, оптимальный интервал содержания комплекса dsРНК в мази - 0,15-0,50%.

Сравнение эффективности применения заявляемой мазевой формы и ацикловира (Wellcome, Великобритания) показывает, что ранее применение заявленного препарата не приводит к появлению эрозий и пустул у инфицированных животных. По сравнению с ацикловиром кратность нанесения мази ридостина оказалась меньшей и составила 3 аппликации (против 5 у Ацикловира).

Касаясь другого средства - мази ларифана (Латвия), нужно отметить, что наибольший эффект его применения достигается также при раннем применении мази. Однако рекомендуется 3-кратное применение препарата в сутки и курс лечения 10-14 дней.

Из приведенных сведений очевидно, что мазевая форма комплекса dsРНК не уступает по лечебному эффекту мазям с аналогичным спектром действия и выпускаемым за рубежом. Учитывая, что отечественный препарат ридостин используется при лечении и иных герпетических заболеваний, можно думать, что мазевая форма его биологически активной составляющей (комплекс dsРНК) окажется так же эффективной в этих случаях.

Таким образом, создана новая противовирусная мазевая композиция на основе компонента отечественного препарата индуктора интерферона "Ридостина", которая может применяться с большей эффективностью для дерматологической обработки поражений, вызванных вирусом герпеса, обладает пролонгированным действием и безвредна для организма.

Литература
1. Темичева Е.В., Малиновская В.В., Чекунова Э.В.//В сб. "Интерферон-89".- М. - 1989.- с. 136-139.

2. Xeerchlager Y. , Wetzler P., Thiel K.- D et al.// Antiviral.Res.- 1982.- v. 2.- p. 255-265.

3. Баринский И.Ф., Грибенча С.В., Игнатьев Г.М. и др. //Вопр. вирусологии - 1985 - N 2 - с. 183-185.

4. Ершов Ф.И., Чижов Н.П., Тазулахова Э.Б. // Противовирусные средства (справочник), Санкт-Петербург - 1993 - УДК 616.988-085.281.8, с. 23-24.

4. Ершов Ф.И., Чижов Н.П., Тазулахова Э.Б. // Противовирусные средства (справочник), Санкт-Петербург - 1993 - УДК 616.988-085.281.8, с. 68-70.

6. Заявка на изобретение N 93002333/14 от 12.01.93 г. "Индуктор интерферона "Ридостин", A. 61 K 37/66.

7. Масычева В.И., Сазонов В.С., Морозова Е.Н. и др. Токсические свойства дсРНК вирусоподобных частиц дрожжей Saccharomyces cer.// Антибиотики и химиотерация - 1986, N 5, с. 374-378.

8. Международная заявка N 9426273, кл. A 61 K 31/44, опубл. 1995 г.

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается средств для лечения герпетических инфекций. Предложена новая противовирусная мазевая композиция на основе компонента отечественного препарата индуктора интерферона комплекса натриевых солей одно- , двуспиральных рибонуклеиновых кислот из Saccharomyces cerevisiae. Композиция может применяться с большей эффективностью для дерматологической обработки поражений, вызванных вирусом герпеса, обладает пролонгированным действием и безвредна для организма. 1 фиг., 4 табл.

Противовирусное средство на основе индуктора интерферона для наружного применения, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит эмульсионную основу, включающую вазелиновое масло, твин-80, эмульгатор Т-2, хлоргексидина биглюконат и дистиллированную воду, а в качестве индуктора интерферона - комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных рибонуклеиновых кислот из Saccharomyces cerevisial, причем он заключен в водную фазу основы при следующем содержании компонентов, мас.%:
Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК из Saccharomyces cerevisial - 0,15 - 0,5
Вазелиновое масло - 20
Твин-80 - 17
Эмульгатор Т-2 - 13
Хлоргексидина биглюконат - 0,04
Дистиллированная вода - До 100у