СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНА Pseudomonas aeruginosa Российский патент 2006 года по МПК C12P21/00 C12N1/20 C12R1/385 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения анатоксина синегнойной палочки для специфической терапии и профилактики инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa.

Известно, что в медицине, при получении анатоксина синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), для выращивания микробов используют бульон Мартена (Бродинова H.С, Левдикова Г.А., Мороз А.Ф. Получение различных вариантов анатоксина Pseudomonas aemginosa и их характеристика //ж. Микробиология, эпидемиология, иммунология, 1987, №3, с.6-17).

Указанный способ получения анатоксина синегнойной палочки предусматривает выращивание токсичных штаммов Pseudomonas aeruginosa на бульоне Мартена, содержащем 1% глицерина и 0,05% глутамата натрия в течение 18 часов при 32°С в условиях аэрации. Далее используют супернатант, полученный после центрифугирования культуры, насыщения ее 60% сульфатом аммония при 60°С с последующей гельфильтрацией на колонке с сефадексом.

Недостатком указанного способа получения анатоксина синегнойной палочки является: нестандартность питательной среды, основу которой составляет мясная вода и пептон; необходимость обеспечения условий аэрации; относительно незначительное накопление биомассы, требующей концентрации путем центрифугирования; слабая антигенная активность токсичного продукта, требующая насыщения ее сульфатом аммония и проведения гельфильтрации на колонке с сефадексом.

Для устранения вышеперечисленных недостатков предлагается способ, включающий выращивание синегнойной палочки на жидкой синтетической питательной среде, стерилизацию биомассы, детоксикацию формалином и сорбцию на геле гидрата окиси алюминия.

Новым является то, что при выращивании синегнойной палочки используют питательную среду, содержащую следующие инградиенты в г на 1 литр дистиллированной воды: лимонную кислоту - 4,9-5,0; хлористый натрий - 0,9-1,0; сернокислый магний - 4,9-5,0; сернокислое железо - 0,04-0,05; аспарагин - 0,9-1,0; глюкозу - 0,9-1,0; глицерин - 2,9-3,0 мл. После окончания роста микробов биомассу подвергают стерилизации автоклавированием при 0,6-0,7 атм в течение 45-50 минут, затем проводят детоксикацию 0,3-0,4% формалином, в течение 7-8 дней при температуре 44-45°С, после чего фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости. Полученный анатоксин пригоден для наружного применения. Для парентерального применения анатоксин подвергают сорбции на геле гидрата окиси алюминия.

Использование вышеуказанной питательной среды, после 2-3-кратного пассирования на ней микробов, при плотности посева 90-100 млн микробных тел на 1 мл среды, позволяет обеспечить максимальное накопление биомассы синегнойной палочки до 14-15 млрд микробных тел в 1 мл культуральной жидкости.

Стерилизация автоклавированием, проводимая в щадящем режиме 0,6-0,7 атм в течение 45-50 мин, позволяет не только убить биомассу синегнойной палочки, но и способствует увеличению выхода токсина в культуральную жидкость, тем самым повышает ее биологическую активность и иммуногенные свойства конечного вакцинного препарата.

Для получения анатоксина детоксикацию культуральной жидкости Pseudomonas aeruginosa проводят формалином, не отделяя ее от биомассы синегнойной палочки, что позволяет экстрагировать дополнительное количество токсических веществ из микробной клетки. После проведения детоксикации, фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости, а последнюю используют в качестве анатоксина синегнойной палочки.

Пример осуществления способа

Для получения анатоксина синегнойной палочки использовали патогенный штамм Pseudomonas aeruginosa, выращивание которого проводили в стандартных 2-х литровых биобутылях с объемом питательной среды 1 литр. Состав среды включал следующие ингредиенты в г из расчета на 10 литров дистиллированной воды: лимонную кислоту 49-50,0; фосфорно-кислый калий двухзамещенный 49-50,0; сернокислый магний 49-50,0; хлористый натрий 9-10,0; сернокислое железо 0,4-0,5; аспарагин 9-10,0; глюкоза 9-10,0; глицерин 29,0-30,0 мл. Исходную рН устанавливали в пределах 7,0. Плотность посева синегнойной палочки составила 90-100 млн микробных тел на 1 мл среды. Выращивание синегнойной палочки провели при 37°С до конечной концентрации 14-15 млрд микробных тел в 1 мл. Выращенную биомассу синегнойной палочки подвергли стерилизации автоклавированием в режиме 0,6-0,7 атмосферы в течение 45-50 минут, после чего провели детоксикацию 0,4% формалином при температуре 44-45°С, в течение 7 дней, ежедневно встряхивая содержимое. Фильтрацией отделили биомассу от культуральной жидкости. Полученный нативный анатоксин синегнойной палочки подвергли сорбции на геле гидрата окиси алюминия из расчета 3 мг на 1 мл.

Оценку иммуногенных свойств анатоксина провели по протективному эффекту в эксперименте на белых мышах массой 18-20 г. Для заражения мышей использовали гомологичный и гетерологичные вакцинному штаммы Pseudomonas aeruginosa. Заражающая доза микробов составляла 1 млрд микробных тел, обеспечивающая 100% гибель контрольных мышей на 1-2 сутки после внутрибрюшинного их заражения.

Результаты изучения протективных свойств анатоксина Pseudomonas aeruginosa для наглядности приведены в таблице.

ТаблицаОценка протективного эффекта анатоксина синегнойной палочки при заражении белых мышей при гомологичном вакцинному и гетерогенными штаммами Pseudomonas aeruginosa№ п/п (n=7)Порядок применения анатоксина синегнойной палочкиШтамм Pseudomonas aeruginosa, взятый для зараженияВыживаемость мышей в разные сроки заражения после иммунизации (выжило/пало)Через 7 днейЧерез 21 день1.Однократно, в дозе 0,5 мл подкожноГомологичный8/0-2.То жеГомологичный-6/23.То жеГетерологичный6/2-4.То жеГетерологичный-5/35.Двукратное интервалом в 7 дней в дозе 0,3+0,3 млГомологичный8/0-6.То жеГомологичный-7/17.То жеГетерологичный7/1-8.То жеГетерологичный-6/2

Срок наблюдения 10 дней.

Контрольное взвешивание животных на 5 и 7 день после иммунизации не выявило тенденции снижения их веса, что свидетельствовало о безвредности анатоксина. В отношении протективного эффекта получены следующие данные: при однократной иммунизации и последующем на 7 и 21 день заражении гомологичным вакцинному штаммом Pseudomonas aeruginosa белых мышей протективный эффект составил соответственно 100 (1 группа) и 75% (2 группа); а при двукратной иммунизации - 100 (5 группа) и 87,5% (6 группа).

Несколько хуже, что и следовало ожидать, были результаты протективного эффекта анатоксина синегнойной палочки при заражении гетерологичным вакцинному штаммом Pseudomonas aeruginosa. Тем не менее протективный эффект составил: при однократной иммунизации и заражении на 7 день - 75% (3 группа), против 87,5% (7 группа) при двукратной иммунизации; при заражении на 21 день после однократной иммунизации протективный эффект составил 82,5 (4 группа), против 75% (8 группа) после двукратной иммунизации.

Проведенные опыты свидетельствуют о формировании хорошо выраженного протективного эффекта как против гомологичных, так и гетерологичных штаммов Pseudomonas aeruginosa. При этом защитный эффект во многом определяется дробностью применения анатоксина. Наличие степени защищенности в среднем более 70% - отвечает требованиям, предъявляемым к убитым вакцинам и анатоксинам.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения анатоксина синегнойной палочки для специфической терапии и профилактики инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка). Способ предусматривает выращивание микробов в жидкой питательной среде, содержащей следующие инградиенты на 1 литр дистиллированной воды: лимонную кислоту - 4,9-5,0; хлористый натрий - 0,9-1,0; сернокислый магний - 4,9-5,0; сернокислое железо - 0,04-0,05; аспарагин - 0,9-1,0; глюкозу - 0,9-1,0; глицерин - 2,9-3,0 мл, до конечной концентрации синегнойной палочки 14-15 млрд микробных тел в 1 мл. Далее полученную культуральную жидкость, содержащую биомассу, подвергают стерилизации автоклавированием при 0,6-0,7 атм в течение 45-50 минут, затем подвергают детоксикации формалином, отделяют фильтрацией культуральную жидкость, содержащую анатоксин, от биомассы и сорбируют ее на геле гидроокиси алюминия. Использование изобретения позволяет повысить антигенную активность токсического продукта, а также стандартизировать условия выращивания продуцента. 1 табл.

Способ получения анатоксина Pseudomonas aeruginosa, включающий выращивание синегнойной палочки в жидкой питательной среде, детоксикацию формалином, фильтрацию и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что выращивание осуществляют в питательной среде, содержащей в 1 л дистиллированной воды лимонную кислоту 4,9-5,0 г, хлористый натрий 0,9-1,0 г, сернокислый магний 4,9-5,0 г, сернокислое железо 0,04-0,05 г, аспарагин 0,9-1,0 г, глюкозу 0,9-1,0 г, глицерин 2,9-3,0 мл, до конечной концентрации синегнойной палочки 14-15 млрд. микробных тел в 1 мл, полученную культуральную жидкость, содержащую биомассу, подвергают стерилизации автоклавированием при 0,6-0,7 атм в течение 45-50 мин, затем подвергают детоксикации формалином, отделяют культуральную жидкость, содержащую анатоксин, от биомассы и сорбируют на геле гидроокиси алюминия.