СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВОГО АНАТОКСИНА Российский патент 2002 года по МПК A61K39/09 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения стрептококкового анатоксина для специфической профилактики заболеваний стрептококковой этиологии.

Известно, что в медицине профилактику пневмококковых инфекций, вызываемых Streptococcus, осуществляют с помощью вакцины, приготовленной из стрептококков, наиболее часто встречающихся при данном заболевании у людей /Коротяев А.И, Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для медицинских вузов. Санкт-Петербург: Специальная литература, 1998. С. 340-341/. Как известно, вакцины содержат в своем составе микробные клетки, ответственные за аллергизацию организма, в то время как анатоксины такими свойствами не обладают /Г.Рамон. 40 лет исследовательской работы. - М. : Медицина, 1964. С. 29-30/. В этой связи разработка экономически выгодного, технологически простого способа получения стрептококкового анатоксина, не индуцирующего дополнительную аллергизацию организма, позволила бы проводить целенаправленную иммунотерапию и иммунопрофилактику многочисленных заболеваний, в этиологии и патогенезе которых активное участие принимают стрептококки.

За прототип взята разработанная технология получения стрептококковой вакцины для профилактики стрептококкоза свиней /Панин А.Н. Стрептококкозы свиней. Автореферат дис. докт. вет. наук. Москва, 1992. С. 24-28/. Указанный способ получения стрептококковой вакцины предусматривает выращивание стрептококков на среде Хоттингера с добавлением 1% глюкозы до концентрации 4 млрд. микробных тел в 1 мл, детоксикацию 0,3-0,4% формалина, сорбцию вакцинного препарата на 3% геле гидрата окиси алюминия, добавляемой в количестве 20%, и декантирование 1/4-1/5 объема надосадочной жидкости.

Недостатками указанного способа получения стрептококковой вакцины являются нестандартность питательной среды, основу которой составляет гидролизат мясных отходов, слабое накопление биомассы, незначительная антигенная активность конечного продукта, требующая после сорбции вакцинного препарата на геле гидрата окиси алюминия проведения декантирования 1/4-1/5 части объема надосадочной жидкости.

Для устранения вышеперечисленных недостатков предлагается способ, включающий выращивание стрептококков на жидкой питательной среде, стерилизацию биомассы, детоксикацию формалином и сорбцию на геле гидрата окиси алюминия.

Новым является то, что при выращивании стрептококков используется питательная среда, содержащая следующие ингредиенты в г на 1 литр дистиллированной воды: лимонную кислоту 4,9-5,0; фосфорнокислого калия двухзамещенного 4,9-5,0; хлористого натрия 1,9-2,0; сернокислого магния 4,9-5,0; сернокислого железа 0,04-0,05; аспарагина 0,9-1,0; гликокола 0,9-1,0; глицерина 3,0-3,1. /Среда описана в заявке 98104551 "Среда для выращивания стрептококков", авт. Евглевская Е.П. и др., решение о выдаче патента от 27.01.2000/. Выращенную после окончания роста микробов биомассу подвергают стерилизации автоклавированием при 0,8-0,9 атмосфере в течение 35-40 мин, затем проводят детоксикацию формалином, после которой фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости. Полученный анатоксин пригоден для аэрозольного применения. Для парентерального применения анатоксин подвергают сорбции на геле гидрата окиси алюминия.

Использование вышеуказанной питательной среды обеспечивает хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяет при 4-5-кратном пассировании на ней микробов, при плотности посева 90-100 млн. микробных тел на 1 мл среды, стабилизировать рост и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10-12 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости.

Стерилизация автоклавированием, проводимая в режиме 0,8-0,9 атмосферы в течение 35-40 мин, позволяет не только убить биомассу стрептококков, но и способствует увеличению выхода токсина в культуральную жидкость, тем самым повышает ее биологическую активность, а следовательно, иммуногенные свойства конечного вакцинного препарата.

Для получения стрептококкового анатоксина детоксикацию культуральной жидкости проводят формалином, не отделяя ее от биомассы стрептококков, что позволяет экстрагировать дополнительное количество токсических веществ из микробной клетки. После проведения детоксикации фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости, а последнюю используют в качестве стрептококкового анатоксина.

Пример осуществления способа. Для получения стрептококкового анатоксина использовали патогенную культуру Streptoccocus pneumonia, выращивание которой проводили в стандартных 2-x литровых биобутылях с объемом питательной среды 1 литр. Состав среды включал следующие ингредиенты в г из расчета на 10 л дистиллированной воды: лимонную кислоту 49-50,0; фосфорнокислого калия двухзамещенного 49-50,0; хлористого натрия 19-20,0; сернокислого железа 0,4-0,5; аспарагина 9-10,0; гликокола 9-10,0; глицерина 30-31,0 мл. Плотность посева стрептококков составила 100 млн. микробных тел на 1 мл среды. Выращивание стрептококков провели при 37^oС до конечной концентрации 12 млрд. микробных тел в 1 мл. Выращенную биомассу стрептококков подвергли стерилизации автоклавированием в режиме 0,8-0,9 атмосферы в течение 35-40 мин, после чего провели детоксикацию 0,3% концентрацией формалина при температуре 40-45^oС в течение 10 дней. Фильтрацией отделили биомассу от культуральной жидкости. Полученный нативный стрептококковый анатоксин использовали для аэрозольного применения. Для парентерального применения стрептококковый анатоксин подвергли сорбции на геле гидрата окиси алюминия из расчета 3 мг на 1 мл.

Оценку лечебной эффективности стрептококкового анатоксина провели на респираторно больных телятах 2-3-месячного возраста, которую для наглядности приводим в таблице.

Результаты применения стрептококкового анатоксина свидетельствовали о его выраженной лечебной эффективности при разных клинических формах проявления респираторного заболевания. При этом наибольший лечебный эффект был отмечен у телят 2-й группы, в которой у 3-х особей признаки респираторного заболевания прекратились на 4-5 день после начала применения анатоксина, еще у 5 в течение 7-8 дней и лишь у 2 остаточные признаки заболевания регистрировались более 10 дней.

Более низким по лечебной эффективности было применение стрептококкового анатоксина на телятах с хроническим течением бронхопневмонии, микробный пейзаж дыхательных путей которых после курса проведенного лечения был представлен у 4-х особей /30,0%/ - золотистым стафилококком; у 5 /41,7%/ - пастереллой мультоцида; еще у 3-х /25,0%/ - синегнойной палочкой; у 2-х /16,9%/ - протеем. Контрольные бактериологические исследования в отношении выделения пневмонийного стрептококка показали, что на 4-5 день после применения стрептококкового анатоксина ни в одном случае из носовых истечений данную форму микроорганизмов выделить не удалось. Это свидетельствовало о хорошо выраженном формировании локального иммунитета респираторного тракта больных телят в отношении пневмонийного стрептококка, что свидетельствовало о потенциальной возможности применения стрептококкового анатоксина для целей иммунотерапии респираторных заболеваний, в этиологии которых активное участие принимает данный вид микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает выращивание стрептококков на питательной среде, содержащей в г/л дистиллированной воды лимонную кислоту 4,9-5,0, фосфорно-кислый калий двухзамещенный 4,9-5,0, хлористый натрий 1,9-2,0, сернокислый магний 4,9-5,0, сернокислое железо 0,04-0,05, аспарагин 0,9-1,0, гликокол 0,9-1,0 и глицерин 3,0-3,1. Стерилизацию выращенной биомассы проводят автоклавированием при 0,8-0,9 атмосфере в течение 35-40 мин. Затем проводят детоксикацию, после чего фильтрацией отделяют биомассу. Анатоксин обладает хорошо выраженной лечебной эффективностью при разных клинических формах респираторного заболевания у телят. 1 табл.

Способ получения стрептококкового анатоксина, включающий выращивание стрептококков на жидкой питательной среде, стерилизацию биомассы, детоксикацию формалином, отличающийся тем, что выращивание стрептококков проводят на жидкой питательной среде, содержащей следующие ингредиенты, г/л дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0; фосфорно-кислый калий двухзамещенный 4,9-5,0; хлористый натрий 1,9-2,0; сернокислый магний 4,9-5,0; сернокислое железо 0,04-0,05; аспарагин 0,9-1,0; гликокол 0,9-1,0 и глицерин 3,0-3,1, стерилизацию выращенной биомассы проводят автоклавированием при 0,8-0,9 атмосфере в течение 35-40 мин, а после детоксикации фильтрацией отделяют биомассу.