КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, производству пробиотиков, биотехнологии и предназначен для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.

В настоящее время проблема дисбактериозов и кишечных дисфункций является актуальной, что обусловлено комплексом причин различного характера: ухудшение экологической ситуации, рост иммунодефицитных состояний, грубое нарушение микробиоценоза в результате антибактериальной, гормональной или лучевой терапии, а также различных отрицательных социальных факторов и т.д. По данным научных исследований более 90% населения страдает теми или иными формами дисбактериозов и кишечных дисфункций. Это в свою очередь влечет за собой целый спектр заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, работой иммунной системы, синтезом витаминов и незаменимых аминокислот, их всасыванием, а также поступлением в организм микро- и макроэлементов и т.д.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, дезинтаксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая (Б.А.Шендеров «Медицинская микробная экология и функциональное питание»).

Для нормализации микробиоценоза широкое распространение получили препараты живых бактериальных культур (пробиотики), а также продукты питания, содержащие живые бактериальные клетки (Б.А.Шендеров «Медицинская микробная экология и функциональное питание»).

Известен пробиотический препарат комплексного действия, включающий смесь живой биомассы бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 и рекомбинантных бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, находящихся в стабилизаторе.

Бактерии в препарате находятся в следующих титрах: В.subtilis 1×10⁹-10×10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора, В.licheniformis 1×10⁸-10×10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора.

В качестве стабилизатора можно использовать сыворотку крови, молоко, смесь сахарозы и желатины (RU №2159625, 27.11.2000).

Известен препарат - пробиотик в сухой иммобилизированной форме, который включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованных на указанном носителе. Клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой в виде порошка с размером частиц не более 0.1 мм, или в виде гранул размером 0.1-5.0 мм.

Препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки пробиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г.

В качестве бифидобактерий в сухом концентрате используют бактерии Bifidobacterium bifidum, № 1, № 971, или ЛВА-3, или В.longum 379, или В.adolescentis MC-42, или смесь бактериальных клеток указанных штаммов, взятых в равных весовых долях.

Препарат в качестве бактерий - пробиотиков дополнительно содержит сухую закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа АВ, соотношение которых с сухим концентратом бифидобактерий составляет 1:(8-9) соответственно (RU №2164801, 10.04.2001).

Недостатками данных препаратов является то, что пробиотические микроорганизмы выращиваются в виде монокультур, а не в виде консорциума, в которых микроорганизмы развиваются быстрее, наращивая более высокий суммарный титр к концу ферментации.

Кроме того, данный пробиотик имеет форму препарата и не применяется в виде закваски для получения продуктов питания.

За прототип предложенного изобретения выбран консорциум бактерий для приготовления кисломолочных продуктов, содержащий Propionibacterium subsp. shermanii, Acetobacter subsp. aceti, Lactococus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum. Использование консорциума позволяет достичь повышения пищевой, профилактической и лечебной ценности продукта. Консорциум отличается устойчивостью к сохранению своих компонентов в течение длительного времени (RU №2185436, 20.07.2002).

Достоинством данной закваски является устойчивость своих компонентов в течение длительного времени. Вместе с тем предложенный консорциум адаптирован к единственной среде культивирования - молоку, что сужает спектр его применения. Кроме того, микроорганизмы, входящие в состав консорциума, отличаются по своим пробиотическим характеристикам. Также к недостаткам стоит отнести непродолжительный срок хранения продукта, полученного с использованием данного консорциума.

Задачей настоящего изобретения является разработка консорциума микроорганизмов пробиотического действия, используемого для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.

Консорциум должен содержать безопасные, совместимые микроорганизмы, при совместном культивировании имеющие высокий суммарный титр, обеспечивающие устойчивость консорциума при длительном хранении и многократном пассировании.

При использовании заявленного консорциума как закваски в молочной промышленности, полученный продукт должен иметь хорошие вкусовые и органолептические свойства, содержать живые пробиотические микроорганизмы в высоком титре продолжительное время, а также обладать питательными свойствами и иметь продолжительный срок хранения.

Пробиотический препарат и биологически активная добавка должны содержать живые пробиотические микроорганизмы в высоком титре продолжительное время.

Поставленная задача решается описываемым консорциумом микроорганизмов пробиотического действия, содержащим Enterococcus durans штамм RSH (VKPM В-8717) и Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides штамм RSH (VKPM B-8716), используемым для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.

Микроорганизмы были выделены из традиционных молочных продуктов домашнего приготовления: Е.durans из сыра типа «Адыгейский»; L.mesenteroides из простокваши. В дальнейшем микроорганизмы были идентифицированы методом 16S РНК и депонированы в международную коллекцию микроорганизмов - ВКПМ.

Такими международными организациями как IDF (International Dairy Federation) (http://www.fil-idf.org) и EFFCA (European Food and Fed Cultures Association) (http://www.effca.com) E.durans и L.mesenteroides признаны безопасными и безвредными.

L.mesenteroides с 1903 года применяется в качестве компонента заквасок в молочной промышленности (International Dairy Federation, IDF, 1997 Dairy Starter Cultures of Lactic Acid Bacteria (LAB) Standard of Identity. IDF Bulletin 149A), (Robinson R., Batt C., Patel P., Encyclopedia of Food Microbiology // Academic Press, London, 1999).

Показано, что L.mesenteroides продуцирует бактериоцины, которые рассматриваются как современная альтернатива антибиотикам по причине селективного подавления роста патогенной микрофлоры, не оказывая отрицательного воздействия на представителей нормофлоры (Stiles M. E.Bacteriocins produced by Leuconostoc species // J. Dairy Sci. 1994. V 77, №9. P.2718-2724).

Также показано, что L.mesenteroides синтезирует внеклеточные полисахариды (декстран и др.), которые формируют реологию и органолептические свойства пищевого продукта (Yang Z. Antimicrobial compounds and extracellular polysaccharides prodused by lactic acid bacteria. Structures and properties //HELSINKI, 2000).

Также L.mesenteroides обнаружен в фекалиях здорового человека (Jens Walter, Christian Hertel, Gerald W.Tannock, Claudia M.Lis, Karen Munro, and Walter P.Hammes. Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella Species in Human Feces by Using Group-Specific PCR Primers and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Applied and Environmental Microbiology, v.67. №6, p.2578-2585, 2001), что свидетельствует о его способности приживаться в желудочно-кишечном тракте. Это является одним из важнейших критериев по отбору пробиотических микроорганизмов.

К недостаткам применения L.mesenteroides следует отнести его недостаточный рост в среде в виде монокультуры. Также L.mesenteroides нуждается в сопутствующем микроорганизме - продуценте молочной кислоты (Ronald С.Deis, Food Product Design New Directions for Cultured Dairy Products March 2000).

Известно, что Е.durans с 1982 года применяется в молочной промышленности в качестве компонента заквасок, а так же как пробиотик в медицине (Rocha J.M., Malcata F.X., On the microbiological profile of traditional Portuguese sourdough. J. Food Prot. 62(12):1416-29, 1999).

Также показано, что Е.durans no ряду показателей (устойчивость к желчи и кислотному шоку, in vitro ассимиляция холестерина) превосходит известные пробиотические микроорганизмы (Dora I.A. Pereira and Glenn R. Gibson Cholesterol Assimilation by Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria Isolated from the Human Gut // Applied and Environmental Microbiology, Vol.68, №9, p.4689-4693, 2002).

К недостаткам применения Е.durans как пробиотика следует отнести его недостаточный рост в среде в виде монокультуры.

Нами было установлено, что при совместном культивировании описанных выше микроорганизмов их недостатки компенсируются и проявляется синергический эффект.

Также проводилась адаптация полученного консорциума к различным средам культивирования.

В процессе длительной селекционной работы нами был получен консорциум микроорганизмов, обладающий следующими микробиологическими показателями:

1. При росте в среде на молочной основе имеет высокий суммарный титр (не менее 10⁸ КОЕ/г).

2. При пассировании в среде на молочной основе консорциум способен сохранять свои свойства не менее 100 пассажей.

3. Консорциум, выращенный в среде на молочной основе, устойчив при длительном хранении без снижения активности (при температуре 4±2°С не менее 30 суток при температуре минус 30±5°С не менее 12 месяцев).

При использовании в качестве закваски заявленного консорциума получен кисломолочный продукт, который имеет хороший вкус и органолептические показатели, а также продолжительный срок хранения (не менее 30 суток). В течение всего срока хранения в продукте сохраняются живые микроорганизмы в высоком титре (не менее 10⁸ КОЕ/г).

Пробиотический препарат и биологически активная добавка, полученные на основе заявленного консорциума, содержат живые микроорганизмы в высоком титре продолжительное время (не менее 12 месяцев).

Заявленный консорциум может применяться в качестве стартовой культуры в технологическом процессе изготовления соевых и др. ферментированных продуктов.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в состав консорциума:

Е.durans:

Клетки, сферические в парах или цепочках. Неподвижные. Грамположительные. Хемоорганотрофы. Метаболизм бродильный, преобладающий конечный продукт при сбраживании глюкозы, - правовращающая молочная кислота. Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 32-37°С.

L.mesenteroides:

Клетки, чечевицеобразные в парах или цепочках. Неподвижные. Грамположительные. Хемоорганотрофы, требующие богатых сред. Образует полисахаридную слизь из сахарозы. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура культивирования 30-35°С.

Примеры использования консорциума.

Получение молочного продукта.

Продукт готовится в два этапа:

1. Приготовление закваски.

100 мл заявленного консорциума вносится в 1 литр обезжиренного стерильного коровьего молока при температуре 32±2°С. Далее термостатируется при заданной температуре в течение 4-5 часов. Далее хранится при температуре 4±2°С. Полученная закваска сохраняет свою биологическую активность в течение не менее 30 суток.

2. Приготовление продукта.

В 20 литров пастеризованного коровьего молока с массовой долей жира 3.2% вносится 1 литр полученной закваски при температуре 34°С. Далее термостатируется при 32±2°С в течение 4-5 часов. Полученный продукт, охлажденный до температуры 4±2°С, сохраняет свою пищевую ценность и биологическую активность не менее 30 суток.

Получение пробиотического препарата.

Получение пробиотического препарата осуществляется в два этапа:

1. Приготовление жидкой биомассы симбиотического консорциума.

100 мл заявленного консорциума вносится в 1 литр обезжиренного стерильного коровьего молока при температуре 32±2°С. Далее термостатируется при заданной температуре в течение 4-5 часов. Далее хранится при температуре 4±2°С.

2. Получение пробиотического препарата.

Пробиотический препарат получают путем обезвоживания полученной биомассы (с внесенной защитной средой) низкотемпературным распылительным или лиофильным способом высушивания до остаточной влажности 3-5%. Далее сухая биомасса капсулируется или таблетируется. Пробиотический препарат герметично упакованный сохраняет свои пробиотические свойства, а микроорганизмы, входящие в состав препарата, - биологическую активность не менее 12 месяцев.

Получение биологически активной добавки (БАД).

Получение БАД осуществляется в два этапа:

1. Приготовление жидкой биомассы симбиотического консорциума.

100 мл заявленного консорциума вносится в 1 литр обезжиренного стерильного коровьего молока при температуре 32±2°С. Далее термостатируется при заданной температуре в течение 4-5 часов. Далее хранится при температуре 4±2°С.

2. Получение БАД.

БАД получают путем обезвоживания полученной биомассы (с внесенной защитной средой) низкотемпературным распылительным или лиофильным способом высушивания до остаточной влажности 3-5%. Далее сухая биомасса смешивается с пробиотиком табл.1, капсулируется или таблетируется. БАД, герметично упакованный, сохраняет свои пробиотические свойства, а микроорганизмы, входящие в состав препарата, - биологическую активность не менее 12 месяцев.

Получение соевого ферментированного продукта.

Продукт готовится в два этапа:

1. Приготовление закваски.

100 мл заявленного консорциума вносится в 1 литр обезжиренного стерильного коровьего молока при температуре 32±2°С. Далее термостатируется при заданной температуре в течение 4-5 часов. Далее хранится при температуре 4±2°С. Полученная закваска сохраняет свою биологическую активность в течение не менее 30 суток.

Таблица 1.ПробиотикПриродаХимическая структураПримечаниеКсилит, сорбитЕстественный источникПяти- и шестиатомные алифатические спиртыНедеградируемые ферментами организма хозяинаЛактулозаИскусственно синтезирован1-4-β-галактозидофруктозаПолучают из лактозы методом изомеризации в щелочной средеФруктооли госахорид (FOS)ТожеСмесь три-, тетра- и пентасахаридов глюкозы и фруктозыСинтез осуществляется путем энзиматического превращения сахарозыИнулинЕстественный источникПолисахарид, образованный остатками фруктозыПрисутствует в клетках многих растений (артишок, корни одуванчика, клубни топинамбура, петрушка, фасоль)Пищевые волокна (пектины, целлюлоза, отруби)ТожеПолисахариды, имеющие структуру, не расщепляемую ферментами организма хозяинаМогут быть водорастворимые (пектины), нерастворимые (целлюлоза), смешанного типа (отруби)

2. Приготовление соевого ферментированного продукта.

В 20 литров пастеризованного соевого молока вносится 1 литр полученной закваски при температуре 34°С. Далее термостатируется при 32±2°С в течение 4-5 часов. Полученный продукт, охлажденный до температуры 4±2°С, сохраняет свою пищевую ценность и биологическую активность не менее 30 суток.

Таким образом, существенным преимуществом заявленного консорциума является следующее:

1. Стабильность соотношения культур, входящих в состав консорциума, при многократном пассировании.

2. Высокий титр микроорганизмов, входящих в состав консорциума (не менее 10⁸ КОЕ/г).

3. Использование консорциума при получении молочных продуктов позволяет добиться повышенных органолептических и реологических свойств продукта наряду с высокими питательными свойствами.

4. Молочный продукт, полученный при использовании консорциума, обладает повышенным сроком годности (не менее 30 суток).

5. Продукт содержит живые пробиотические микроорганизмы в высоком титре (не менее 10⁸ КОЕ/г) продолжительное время (не менее 30 суток).

6. Сухой пробиотический препарат сохраняет живые микроорганизмы продолжительное время (не менее 12 месяцев).

7. Заявленный консорциум может применяться в качестве стартовой культуры в технологическом процессе изготовления соевых и др. ферментированных продуктов.

8. Использование консорциума для получения продуктов питания, пробиотических препаратов и БАД.

Список используемой литературы

1. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М., 1998.

2. Dora I.A. Pereira and Glenn R. Gibson Cholesterol Assimilation by Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria Isolated from the Human Gut // Applied and Environmental Microbiology, vol.68, №9, p.4689-4693, 2002.

3. International Dairy Federation, IDF, 1997 Dairy Starter Cultures of Lactic Acid Bacteria (LAB) Standard of Identity. IDF Bulletin 149A.

4. Jens Walter, Christian Hertel, Gerald W.Tannock, Claudia M.Lis, Karen Munro, and Walter P.Hammes. Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella Species in Human Feces by Using Group-Specific PCR Primers and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Applied and Environmental Microbiology, v.67. №6. p.2578-2585, 2001.

5. Robinson R., Batt С., Patel P., Encyclopedia of Food Microbiology // Academic Press, London, 1999.

6. Rocha J.M., Malcata F.X., On the microbiological profile of traditional Portuguese sourdough. J. Food Prot. 62(12):1416-29, 1999).

7. Ronald C. Deis, Food Product Design New Directions for Cultured Dairy Products March 2000.

8. Stiles M.E. Bacteriocins produced by Leuconostoc species // J. Dairy Sci. 1994. V 77, №9. P.2718-2724.

9. Yang Z. Antimicrobial compounds and extracellular polysaccharides prodused by lactic acid bacteria. Structures and properties // HELSINKI, 2000.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству заквасок, пробиотиков, биологически активных добавок, продуктов питания. Консорциум содержит Enterococcus durans штамм RSH (VKPM В-8717) и Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides штамм RSH (VKPM B-8716). Изобретение позволяет получить консорциум с устойчивым соотношением культур, высокий титр микроорганизмов, повысить органолептические и реологические свойства получаемых продуктов, повысить срок годности получаемого продукта. 1 табл.

Консорциум микроорганизмов пробиотического действия, содержащий Enterococcus durans штамм RSH (VKPM В-8717) и Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides штамм RSH (VKPM B-8716), используемый для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.