КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ АНАЛОГОВ МОЛОКА Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A23L33/135 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, в частности к пищевой биотехнологии, и представляет собой консорциум микроорганизмов Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecium и Lactiplantibacillus plantarum, предназначенный для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока.

Уровень техники

Молоко животных традиционно использовалось человеком, в том числе и для приготовления разнообразных кисломолочных продуктов. Предполагается, что первые кисломолочные продукты человек начал получать примерно тогда, когда перешел от собирательства к производству продуктов питания, и когда появились первые зачатки животноводства [Robinson R.K. et al. Dairy microbiology: Volume 1-The microbiology of milk. - Elsevier Applied Science Publishers Ltd., 1990. - №. Ed. 2]. Кисломолочные продукты, пожалуй, являются самыми разнообразными из всех ферментированных продуктов. Их производят во всем мире, и на сегодняшний день существует около 400 названий традиционных и коммерческих продуктов [Kurmann J.A., Rasic J.L., Kroger M. Encyclopedia of fermented fresh milk products: an international inventory of fermented milk, cream, buttermilk, whey, and related products. Springer Science & Business Media, 1992].

Вместе с тем кисломолочные продукты и их производственный цикл имеют и ряд недостатков. Так, например, доля производства молока в выбросах парниковых газов в мире составляет 2,2% [https://www.poynter.org/ifcn/]. Многие люди не могут переваривать и усваивать лактозу, в результате чего в брюшной полости появляются симптомы, приносящие дискомфорт человеку, такие как боль, вздутие, метеоризм, диарея. Аллергия на белок коровьего молока считается одной из самых распространенных в мире у детей и взрослых. У детей первого года жизни частота аллергии на молочный белок составляет 4,2%, у детей 2-5 лет - 3,75% [Клинические рекомендации Минздрава РФ «Аллергия к белкам коровьего молока у детей» МКБ 10: L20.8/L27.2/ К52.2 /Т78.1/78.4/78.8]. Также некоторые люди предпочитают избегать употребления молока по этическим или религиозным соображениям.

Растительные аналоги молока и ферментированные продукты на их основе лишены многих проблем животного молока, связанных с выбросами парниковых газов, пищевой непереносимостью, этическими и религиозными проблемами.

Известен способ получения продукта на растительной основе (патент РФ №2555528, приоритет 10.02.2014, опубл. 10.07.2015), где в качестве растительной составляющей используются семена люпина, а ферментация проводится двумя штаммами: Lactobacillus delbrueckii bulgahcus, и/или Streptococcus thermophilus. К недостаткам данного изобретения можно отнести двухкомпонентный микробный состав, что снижает ценность конечного продукта, так как увеличение микробного разнообразия повышает диетическую ценность готового продукта.

Известен способ получения кисломолочного продукта на основе соевого молока (патент РФ №2177691, приоритет 22.02.2000, опубл. 27.08.2000). В качестве стартовых культур используется жидкий концентрат лактобактерий, и/или молочнокислых стрептококков, и/или бифидобактерий, полученный на гидролизатно-соевой среде. Недостатком данного изобретения является отсутствие в качестве стартовых культур микроорганизмов из группы пищевых энтерококов, для которых показаны множественные положительные эффекты на здоровье человека [Xu W, Zou К, Zhan Y, Cai Y, Zhang Z, Tao X, Qiu L and Wei H Enterococcus faecium GEFA01 alleviates hypercholesterolemia by promoting reverse cholesterol transportation via modulating the gut microbiota-SCFA axis. Front. Nutr. 9:1020734 (2022)], что снижает ценность готового продукта.

Наиболее близким к заявляемому изобретением (прототипом) является способ получения функционального кисломолочного продукта на основе растительного материала (патент РФ №2784723, приоритет 03.09.2021, опубл. 29.11.2022). Способ предусматривает получение продукта на основе, которую получают путем измельчения орехов и семян масличных культур или шрота или жмыха орехов и семян масличных культур. В качестве заквасочных культур применяются монокультуры молочнокислых бактерий Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus или дрожжей Saccharomyces. К недостаткам изобретения можно отнести применение исключительно бинарной заквасочной ассоциации (приведено в пяти примерах реализации изобретения), то есть всего двух штаммов заквасочных культур, что снижает ценность конечного продукта по сравнению с продуктами, содержащими три и более микробных компонента, а также отсутствие в микробном составе группы пищевых энтерококков.

Технической проблемой, на которую направлено изобретение, является создание консорциума микроорганизмов Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecium и Lactiplantibacillus plantarum, предназначенный для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является консорциум штаммов Leuconostoc mesenteroides S6, Enterococcus faecium S24 и Lactiplantibacillus plantarum S17, культивируемых в растительном заменителе молока с целью получения ферментированного пищевого продукта. Отличительной особенностью разработанного консорциума является функциональная нагрузка штаммов в составе микробной ассоциации. Lactiplantibacillus plantarum S17 является первостепенным кислотообразователем, формирующим кислотность конечного продукта. Leuconostoc mesenteroides S6 продуцирует внеклеточные полисахариды, благодаря которым формируется консистенция готового продукта. Enterococcus faecium S24 является пробиотической составляющей ферментированного пищевого продукта. Таким образом, в отличие аналогов, представленный микробный консорциум позволяет получить конечный продукт с дополнительными потребительскими характеристиками (вкусовыми, органолептическими, пробиотическими).

Технический результат достигается консорциумом микроорганизмов, включающим Leuconostoc mesenteroides штамм S6 ВКПМ В-14356, Enterococcus faecium штамм S24 ВКПМ В-14357 и Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 ВКПМ В-14355, предназначенные для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока, используемых в соотношении 1:1:1 с допустимой величиной отклонения каждого штамма от указанного значения до 20%.

Технический результат также достигается препаратом для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока, содержащим лиофильно высушенную биомассу штаммов Leuconostoc mesenteroides штамм S6 ВКПМ В-14356, Enterococcus faecium штамм S24 ВКПМ В-14357 и Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 ВКПМ В-14355, взятых в соотношении 1:1:1 с допустимой величиной отклонения каждого штамма от указанного значения до 20% и наполнитель. При этом в качестве наполнителя используют сухое обезжиренное молоко.

Соотношение штаммов указано при сопоставимом содержании КОЕ/г.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующим иллюстративным материалом.

На фиг. 1 представлена фотография колонии L. mesentroides S6 и L. plantarum S17 на среде с добавлением сорбитола и ванкомицина.

На фиг. 2 представлена фотография колонии Е. faecium S24 на среде MRS без глюкозы.

На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий динамику увеличения числа жизнеспособных клеток микроорганизмов при совместном культивировании (в n раз).

Осуществление изобретения

Происхождение штаммов. Штаммы выделены из овощей, ферментированных традиционным способом в домашних условиях:

- Leuconostoc mesenteroides штамм S6 выделен из квашенной капусты;

- Enterococcus faecium штамм S24 выделен из соленых помидоров;

- Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 выделен из соленых кабачков.

Штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под следующими регистрационными номерами:

- Leuconostoc mesenteroides штамм S6 ВКПМ В-14356;

- Enterococcus faecium штамм S24 ВКПМ В-14357;

- Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 ВКПМ В-14355.

Идентификация штаммов была осуществлена на основании анализа последовательности гена 16S рРНК, а также их культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик.

Полученные штаммы характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки штаммов:

1) Enterococcus faecium штамм S24 ВКПМ В-14357.

Профиль колонии выпуклый, край ровный, гладкий, форма правильная округлая. Поверхность гладкая, блестящая, цвет кремово-белый. Структура однородная, консистенция мягкая, не тягучая, колония легко снимается со среды петлей. Диаметр колоний 1-2 мм. Клетки неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Граму. Факультативный анаэроб. Каталазоотрицателен.

2) Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 ВКПМ В-14355.

Профиль колонии выпуклый, край ровный, гладкий, форма правильная округлая. Поверхность гладкая, колония блестящая, цвет от кремово-белого у мелких колоний до светло-желтого у крупных. Структура однородная, консистенция мягкая, не тягучая, колония легко снимается со среды петлей. Диаметр колоний 2-4 мм. Клетки неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Граму. Факультативный анаэроб. Каталазоотрицателен.

3) Leuconostoc mesenteroides штамм S6 ВКПМ В-14356.

Профиль колонии выпуклый, край ровный, гладкий, форма правильная округлая. Поверхность гладкая, колония блестящая, цвет белый, по краям более прозрачный. Структура однородная, консистенция мягкая, колонии тягучие, при снятии колонии со среды тянется слизистая нить. Диаметр колоний 3-4 мм. Клетки неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Граму. Факультативный анаэроб. Каталазоотрицателен.

Культивирование и хранение.

Культивирование штаммов осуществляют на плотной питательной среде MRS (HiMedia, Индия), следующего состава (г/л): протеозопептон - 10,00, мясной экстракт - 10,00, дрожжевой экстракт - 5,00, глюкоза - 20,00, твин-80 - 1,00, аммония цитрат - 2,00, натрия ацетат - 5,00, магния сульфат - 0,10, марганца сульфат - 0,05, натрия гидрофосфат - 2,00, агар-агар - 12,00, дистиллированная вода. Режим стерилизации: 0,5 ати 30 мин.

Культивирование проводят в анаэробных условиях при 30°С в течение 48 часов. Для создания анаэробных условий используют систему GAS PACK 150 (Becton Dickinson, США). Для оценки наличия кислорода в системе используют Anaerobe Indicator Test (Thermo Scientific, США).

Для целей долговременного хранения штаммы L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17 выращивают в жидкой питательной среде MRS. Культивирование проводят при температуре +30°С на орбитальном шейкере, либо в ферментерах различного объема в течение 48 часов до конечного количества жизнеспособных клеток микроорганизмов не менее 109 КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную суспензию замораживают и обезвоживают методом лиофилизации в стеклянных флаконах или стеклянных ампулах, которые после запаивают. Хранение флаконов или ампул проводят при температуре 6±2°С.

Пример 1. Способ выделения и культивирования Leuconostoc mesenteroides штамм S6, Enterococcus faecium штамм S24, Lactiplantibacillus plantarum штамм S17

Штаммы выделены из овощей, ферментированных традиционным способом в домашних условиях:

- Leuconostoc mesenteroides штамм S6 выделен из квашенной капусты, г. Подольск, Московская область;

- Enterococcus faecium штамм S24 выделен из соленых помидоров, г. Подольск, Московская область;

- Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 выделен из соленых кабачков, г. Подольск, Московская область.

Для выделения чистых культур микроорганизмов проводили посев образов на агаризованную среду MRS методом десятикратных разведений. Для соленых помидоров и кабачков в качестве посевного материала выступал рассол, для квашеной капусты жидкость, выделившаяся в ходе заквашивания. Культивирование проводили в анаэробных условиях при 30°С в течение 48 часов.

Пример 2. Способ оценки титруемой кислотности при ферментации кокосового молока штаммами Leuconostoc mesenteroides штамм S6, Enterococcus faecium штамм S24, Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 при 30 и 37°С

Для определения оптимальной температуры и срока ферментации продукта проводили культивирование штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17 в кокосовом молоке, в течение двух суток культивирования при двух различных температурах: 30 и 37°С. Штаммы вносили в кокосовое молоко в соотношении 1:1:1, при этом количество каждого штамма составляло 1*10⁵КОЕ/г. Как видно из таблицы 1, для всех штаммов более высокая кислотность достигается при культивировании в течение 48 часов. Для штаммов Е. faecium S24 и L. plantarum S17 более высокая кислотность была достигнута при температуре ферментации 37°С, а для штамма L. mesenteroides S6 при температуре 30°С (таблица 1).

Пример 2. Способ оценки динамической вязкости для штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17.

Для оценки динамической вязкости конечного продукта ферментации проводили культивирование штаммов в кокосовом молоке при температуре 30 и 37°С. Для измерения вязкости образцов по Геплеру использовали вискозиметр с падающим шариком НААКЕ Falling Ball Viscometer С (Thermo Scientific, США). Измеряли время, которое необходимо шарику, чтобы пройти определенное расстояние в трубке, заполненной исследуемой жидкостью. Во время измерений с помощью водяной бани поддерживали постоянную температуру жидкости, равную 22°С. Использовали шарик из никелевого сплава плотностью 8,1 г/см³, диаметром 15,2±0,1 мм и индивидуальной константной 0,7 мПа×с×см³/г×с. Расчет динамической вязкости (г^, мПа×с) вели по формуле: η=К(ρ₁-ρ₂)×t, где K - индивидуальная константа шарика (мПа×с×см³/г×с), ρ₁ плотность шарика (г/см³), ρ₂ - плотность образца при температуре измерения (г/см³), t - время падение шарика (с). Как видно из таблицы 2, для штамма Е. faecium S24 более высокая вязкость достигнута при культивировании при температуре 37°С, а для штаммов L. mesenteroides S6 и L. plantarum S17 при температуре 30°С

Пример 3. Способ оценки численности штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum SI7 при ферментации кокосовом молоке.

Для оценки увеличения численности штаммов проводили культивирование при температуре 30 и 37°С в кокосовом молоке в качестве субстрата (таблица 3). Для штаммов Е. faecium S24 и L. plantarum S17 существенных различий в увеличении количества жизнеспособных клеток в зависимости от температуры не показано, вместе с тем для штамма L. mesenteroides S6 культивирование при более низкой температуре показало большее в десять раз увеличение количества жизнеспособных клеток по сравнению с культивированием при температуре 37°С (таблица 3).

Пример 4. Способ оценки численности штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17 при совместном культивировании.

Для учета численности микроорганизмов при совместном культивировании использовались две среды: модифицированная среда MRS (с добавлением сорбитола вместо глюкозы и антибиотика ванкомицина) и среда MRS с исключением из нее глюкозы. Колонии на данных средах имели характерный вид (фиг. 1 и 2), что позволяло проводить оценку количества жизнеспособных клеток каждого штамма в жидких продуктах при совместном культивировании путем высева десятикратных разведений на плотные среды.

Пример 5. Способ совместного культивирования штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17 в кокосовом молоке с целью получения растительного ферментированного продукта.

На фиг. 3 представлена динамика численности штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17 при совместном культивировании в кокосовом молоке в течение 48 часов. Как видно из графика, у штаммов Е. faecium S24 и L. plantarum S17 в первые 10 часов культивирования значительно вырастает количество жизнеспособных клеток, а для штамма L. mesenteroides S6 прироста не происходит. Однако в последующие часы ферментации L. mesenteroides S6 демонстрирует дальнейшее увеличение численности клеток, а штаммы Е. faecium S24 и L. plantarum SI7, напротив, далее не растут.

В результате культивирования кокосового молока заявленным консорциумом микроорганизмов получен ферментированный продукт с приятным кисломолочным вкусом и органолептической структурой питьевого кисломолочного продукта.

Пример 6. Способ коллекционного (долговременного) хранения штаммов L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17.

Для целей коллекционного (долговременного) хранения штаммы L. mesenteroides S6, Е. faecium S24 и L. plantarum S17 выращивают в жидкой питательной среде MRS. Культивирование проводят при температуре +30°С на орбитальном шейкере, либо в ферментерах различного объема в течение 48 часов до конечного количества жизнеспособных клеток микроорганизмов не менее 10⁹ КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную суспензию замораживают и обезвоживают методом лиофилизации в стеклянных флаконах или запаянных стеклянных ампулах. Хранение флаконов или ампул проводят при температуре 6±2°С.

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, в частности к пищевой биотехнологии. Предложен консорциум микроорганизмов Leuconostoc mesenteroides штамм S6, Enterococcus faecium штамм S24 и Lactiplantibacillus plantarum штамм S17, предназначенный для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока, используемый в соотношении 1:1:1. Предложен препарат для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока, содержащий консорциум. Изобретение позволяет получать ферментированные продукты на основе растительных аналогов молока. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 6 пр.

1. Консорциум микроорганизмов, включающий Leuconostoc mesenteroides штамм S6 ВКПМ В-14356, Enterococcus faecium штамм S24 ВКПМ В-14357 и Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 ВКПМ В-14355, предназначенный для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока, используемый в соотношении 1:1:1 с допустимой величиной отклонения каждого штамма от указанного значения до 20%.

2. Препарат для изготовления ферментированных продуктов на основе растительных аналогов молока, характеризующийся тем, что содержит лиофильно высушенную биомассу штаммов Leuconostoc mesenteroides штамм S6 ВКПМ В-14356, Enterococcus faecium штамм S24 ВКПМ В-14357 и Lactiplantibacillus plantarum штамм S17 ВКПМ В-14355, взятых в соотношении 1:1:1 с допустимой величиной отклонения каждого штамма от указанного значения до 20%, и наполнитель.

3. Препарат по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве наполнителя используют сухое обезжиренное молоко.