ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTICASEIBACILLUS PARACASEI SUBSP. PARACASEI 1338 ВКМ B-3753D ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ И В КАЧЕСТВЕ ПРОБИОТИКА Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, пищевой промышленности и представляет собой новый бактериальный штамм Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D. Штамм активно размножается в питательной среде, что позволяет быстро получить производственную биомассу в короткие сроки культивирования (12-14 ч) и способен сквашивать молоко. Штамм характеризуется повышенной устойчивостью к воздействию среды желудка и кишечника (пепсина, трипсина и панкреатина), а также устойчив к воздействию лизоцима, устойчив к низким значениям рН (рН 2.0) и к солям желчных кислот (1.5%), штамм не обладает генами резистентности к антибиотикам. Штамм может быть использован для производства кисломолочных продуктов и в качестве пробиотика. Штамм может быть использован для производства кисломолочных продуктов, обладающих чистым кисломолочным вкусом и сбалансированной кислотностью, а также повышенными реологическими свойствами без добавления дополнительных компонентов, повышающих вязкость готового продукта.

Пробиотики оказывают свое благотворное воздействие посредством различных механизмов, включая снижение pH кишечника, уменьшение колонизации и инвазии патогенными организмами и изменение иммунного ответа хозяина. Применение антибиотиков, иммуносупрессивной терапии и облучения, среди других методов лечения, может вызывать изменения состава и оказывать влияние на микрофлору ЖКТ. Следовательно, введение полезных видов бактерий в желудочно-кишечный тракт может быть очень привлекательным вариантом для восстановления микробного равновесия и предотвращения заболеваний [1].

Пробиотики, определяемые как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу для здоровья хозяина», становятся все более популярными и востребованными на рынке. Однако слишком многие продукты, которые в настоящее время маркируются как пробиотики, не соответствуют определяющим характеристикам [2]. При этом в Российской Федерации в заквасках (в том числе прямого внесения) для кисломолочных продуктов используется ограниченный набор штаммов, произведенных как внутри страны, так и за ее пределами. В связи с этим введение новых штаммов в качестве заквасок для производства кисломолочных продуктов является важной задачей расширения микробного (штаммового) разнообразия в пищевом рационе человека.

В литературе сообщается о многих преимуществах штаммов L. paracasei [3, 4]. К ним относятся противомикробная и антибиопленочная активность; стимуляция иммунной системы; противовоспалительное, антиоксидантное, противоожирительное и антипролиферативное/проапоптотическое, улучшающее липидный обмен, гипохолестеринемическое и стрессмодулирующее действие; и улучшение кишечной бактериальной микробиоты.

Молочнокислая бактерия Lacticaseibacillus paracasei была обнаружена в различных традиционных ферментированных продуктах и отнесена к категории GRAS (Generally Regarded as Safe), что свидетельствует о международном признании безопасности и возможности безопасного применения в пищевой индустрии и в качестве пробиотика [5].

Задачей данного изобретения является получение нового штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D.

Предложены штамм Lactobacillus paracasei subsp. parasasei, штамм лактобациллы, пищевой продукт и натуропатический препарат, содержащие этот штамм (патент RU 2205871 C2, B61C 9/08 (2000.01), опубл. 1967 г.); штамм Lactobacillus paracasei, необходимый для получения продукции, содержит лактобактерии (патент RU 2465322 C2, C12N 1/20 (2006.01), опубл. 26.06.2012 г.); штамм бактерий Lactobacillus casei/paracasei - ВГНКИ 10.02.62 ДЕП, используемый для приготовления пробиотической добавки (патент RU 2465322 C2, C12N 1/20 (2006.01), опубл. 26.06.2012 г.), в последнем отсутствует информация о наличии/отсутствии генов антибиотикорезистентности.

Техническая проблема, решаемая новым бактериальным штаммом Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D, отличительной особенностью которого является повышенной устойчивостью к воздействию среды желудка и кишечника (пепсина, трипсина и панкреатина), а также устойчивость к воздействию лизоцима, низким значениям рН (рН 2.0) и солям желчных кислот (1.5%), штамм не обладает генами резистентности к антибиотикам. Штамм активно размножается в питательной среде, что позволяет быстро получить производственную биомассу в короткие сроки культивирования (12-14 ч) и способен сквашивать молоко. Штамм может быть использован для производства кисломолочных продуктов, характеризующихся чистым кисломолочным вкусом и сбалансированной кислотностью, а также повышенными реологическими свойствами без добавления дополнительных компонентов, повышающих вязкость готового продукта.

Штамм выделен из кисломолочного продукта – шубат (чал), приготовленного традиционным способом (естественное скисание верблюжьего молока без добавления заквасок и стартовых культур).

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР «ПУЩИНСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК» (ВКМ, Россия, 142290, Московская обл., Пущино, пр.Науки, 5, ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ B-3753D. Идентификация штамма была осуществлена на основании анализа последовательности гена 16S рРНК, а также его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки

Среда культивирования MRS агар, следующего состава (г/л): пептон из казеина 10,0; мясной экстракт 8,0; дрожжевой экстракт 4,0; глюкоза 20,0; фосфат калия двузамещенный 2,0; твин-80 1,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 2,0; ацетат натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат марганца 0,04; агар 14,0. Колонии бело-бежевые, круглые, матовые с ровным краем, выпуклым профилем, диаметром от 1-3 мм, имеющие однородную структуру и мягкую консистенцию.

Клетки неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Граму, не образуют пигмент, каталазо- и оксидазонегативны. Палочковидная форма клеток, клетки одиночно или в виде коротких цепочек. Отношение к кислороду - факультативный анаэроб.

Штамм способен ферментировать галактозу, лактозу, мальтозу, а также арабинозу и сахарозу. Штамм растет при температуре от 15 до 45°С, оптимум 37°С.

Культивирование и хранение.

Штамм Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D в лабораторных условиях поддерживают двумя способами:

1. пересевами 1 раз в 10-20 суток, культивирование при 37°С на плотной питательной среде MRS в течение 2 суток, хранение при +4°С;

2. пассажами 1 раз в 10-15 суток в стерильном обезжиренном молоке, путем внесения 5% инокулята (продукт, полученный при культивировании штамма в обезжиренном молоке). Культивирование до формирования сгустка при 37°С, хранение при +4°С.

Штамм также может храниться при +4±2°C в лиофилизированном состоянии с использованием сухого обезжиренного молока в качестве защитной среды.

Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D.

Штамм выделен из кисломолочного продукта – шубат (чал), приготовленной традиционным способом (естественное скисание верблюжьего молока без добавления заквасок и стартовых культур). Район происхождения кисломолочного продукта – Кош-Агачский район, Республика Алтай, частное подсобное хозяйство. Образец традиционного кисломолочного продукта (шубат), объемом 200 мл был транспортирован в лабораторию при температуре +5±2°С. Выделение штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D проводилось путем посева десятикратных разведений продукта на плотную среду MRS. Культивирование при температуре +37°С в течение 2 суток. Колонии пересевали не менее 3-5 раз на плотной среде MRS с контролем чистоты культуры с помощью микроскопии, далее полученную чистую культуру идентифицировали на основании анализа последовательности гена 16S рРНК, а также на основе культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик.

Пример 2. Использование штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов содержащих лактобактерий.

Штамм культивируют 12-14 ч при 30-37°С до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 108 кл/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выращенную биомассу содержат в пищевых ингредиентах (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, смешивают и разливают в емкостях. В результате получают продукт с концентрацией живых лактобактерий не менее 106 кл/мл.

Пример 3. Получение кисломолочного продукта с использованием штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D.

Штамм культивируют 12-14 ч при 30-37°С до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 108 кл/мл.

Полученную биомассу штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D в концентрации до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Способ коллекционного (долговременного) хранения штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D.

Штамм Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D выращивают в обезжиренном молоке путем внесения 5% инокулята (продукт, полу-ченный при культивировании штамма в обезжиренном молоке) и культивирования в течение 6-8 часов при температуре +32±4°С. Далее полученную микробную биомассу в молоке замораживают и обезвоживают методом лиофилизации в стеклянных флаконах или в стеклянных ампулах. Хранение флаконов или ампул проводят при температуре +5±2°C

Таким образом, получен штамм, отличительной особенностью которого является повышенная устойчивость к воздействию среды желудка и кишечника (пепсина, трипсина и панкреатина), а также устойчивость к воздействию лизоцима и низким значениям рН (рН 2.0), а также к солям желчных кислот (1.5%). Штамм не обладает генами резистентности к антибиотикам. Штамм активно размножается в питательной среде, что позволяет быстро получить производственную биомассу в короткие сроки культивирования (12-14 ч) и способен сквашивать молоко. Штамм может быть использован для производства кисломолочных продуктов и в качестве пробиотика. Штамм может быть использован для производства кисломолочных продуктов, обладающих чистым кисломолочным вкусом и сбалансированной кислотностью, а также повышенными реологическими свойствами без добавления дополнительных компонентов, повышающих вязкость готового продукта.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Nancy Toedter Williams Probiotics // Am J Health Syst Pharm, – 2010, – 67(6), 449-58.

2. Scarlett Puebla-Barragan et al. Probiotics in cosmetic and personal care products: Trends and Challenges // Molecules, – 2021, – 26(5), – 1249.

3. Hill D., Sugrue I., Tobin C., Hill C., Stanton C., Ross R.P. The Lactobacillus casei Group: History and Health Related Applications. Front. Microbiol. 2018; 9: 2107.

4. Jones R.M. The Microbiota in Gastrointestinal Pathophysiology: Implications for Human Health, Prebiotics, Probiotics, and Dysbiosis. Academic Press; Cam-bridge, MA, USA: 2017. The Use of Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei in Clinical Trials for the Improvement of Human Health; pp. 99–108.

5. Wessels S., Axelsson L., Hansen E., De Vuyst L., Laulund S., Lähteenmäki L., Lindgren S., Mollet B., Salminen S., von Wright A. The lactic acid bacteria, the food chain, and their regulation. Trends in Food Science and Technology, 2004, vol. 15, no. 10, pp. 498–505.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D. Штамм может быть использован для производства кисломолочных продуктов и в качестве пробиотика. 4 пр.

Штамм бактерий Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 1338 ВКМ B-3753D для производства кисломолочных продуктов и в качестве пробиотика.