ЦЕРЕБРОЗИД-ЦЕРЕБРОЗИДСУЛЬФАТСОДЕРЖАЩИЙ ЛИПИДНЫЙ КОМПЛЕКС И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/30 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, косметологии и непосредственно к способам получения липидов из природного сырья, в частности цереброзидсодержащих липидных комплексов, применяемых в медицине и косметологии.

Цереброзиды - группа липидов, которых по своему строению относят как к гликолипидам, так и к сфинголипидам, поскольку они в своей структуре содержат и сахар, и сфингозин (ненасыщенный аминоспирт). Из опубликованных материалов известно, что сфинголипиды содержатся в мембранах растительных и животных клеток. Особенно богата ими нервная ткань и, в частности, мозг (Shapiro et al, "Stadies of Sphingolipids, YII, Synthesis and Configuration of Natural Sphingomielins" J. Am. Chem. Soc., V.84, P.1047-1050, 1962). Цереброзиды также содержатся в мембранах нервных клеток. К группе цереброзидов относится и цереброзидсульфат, обнаруженный в спинном и головном мозге млекопитающих, а также в незначительных количествах в почках и сетчатках глаза (F.F.Farooqu, /1982/ Adv. LipidRes. V.18, Р.626-631).

Как видно их вышеуказанного, сырьем для цереброзидов может быть выбрана растительная или животная ткань. Растительная ткань, в частности экстракт листьев растения Гинго Билоба, используется, например, в известном способе для получения экстракта данного растения, содержащего 30-40 мас.% гликолипидов (моногалактодиглицеридов и дигалактодиглицеридов) и 3-10 мас.% галактоцереброзида (ЕР 0731708, А 61 К 35/78, 2001). Животная ткань, преимущественно нервная ткань спинного и головного мозга животных, применяется и для получения других представителей класса цереброзидов, например нервона по способу, описанному в заявке на патент, основанному также на экстрактивном извлечения целевого продукта из исходного сырья - головного мозга свиней (RU 94012010 A1, А 61 К 35/30, 1996). Данный способ многостадиен и включает экстракцию животного сырья 2-3 объемами ацетона при 30-40°С в течение 10-12 часов, отделение экстракта и фильтрацию, осаждение охлажденного фильтрата 4-5 объемами этилового спирта при 6-10°С в течение 2-4 часов, экстракцию фильтрата 2-4 объемами серного эфира при 20-25°С в течение 4-6 часов, вакуумную отгонку растворителя, растворение остатка в пиридине при 50-60°С и выделение целевого продукта при охлаждении раствора при 0-2°С. Получаемый данным способом продукт подвергают дополнительной очистке промыванием его ацетоном при рН 3-4, растворением в метиловом спирте и перекристаллизацией из смеси равных объемов хлороформа и ацетона.

Экстракционный метод положен и в основу другого известного способа обработки головного мозга животных, но уже крупного рогатого скота /RU 2192265, А 61 К 35/30, 2002/. Данным способом получается не конкретный продукт, а липидный комплекс, включающий и цереброзиды. Данный способ включает стадию гомогенизации ткани мозга в охлажденном ацетоне, фильтрацию, суспендирование осадка в ацетоне, повторную фильтрацию, экстракцию осадка смесью хлороформа с этанолом и последующее осаждение фосфолипидов охлажденным ацетоном. Получаемый данным способом комплекс содержит, мас.%: холестерина - 16,6, цереброзидов - 16,6, фосфатидилэтаноламина - 16,6, фосфатидилхолина - 8,3, сфингомиелина - 8,3, фосфатидилсерина - 6,25, фосфатидилинозита - 6,25. Комплекс, получаемый данным способом, как сказано в описании, может быть использован для получения липосомных форм лекарственных препаратов. К недостаткам данного способа можно отнести длительность его осуществления (около 20 часов), использование значительных количеств ацетона, что делает процесс пожаро- и экологически опасным. Кроме того, продукт содержит сложную смесь глицеролипидов и сфинголипидов, но не содержит биологически активный цереброзид-сульфат, являющийся эффективным биологически активным веществом. Кроме того, присутствующие в известном составе глицерофосфолипиды содержат много ненасыщенных жирных кислот, которые делают смесь легко окисляемой, что ограничивает его применение в ряде прогрессивных областей медицины.

Для расширения ассортимента биологически активных липидных средств и повышения их эффективности создан новый биологически активный комплекс, получаемый из головного или спинного мозга свиньи, содержащий, мас.%: холестерин, триглицериды, ганглиозиды 6,0,-14,7, цереброзид 25,0-57,0, фосфатидилэтаноламин 7,2,-24,1, фосфатидилхолин и сфингомиелин 8,8-29,2, цереброзидсульфат 7,0-21,0.

Объектом изобретения также является новый способ получения цереброзид-цереброзидсульфатсодержащего липидного комплекса из головного или спинного мозга свиньи, который включает: обработку исходного сырья 1-1,5 объемами охлажденного ацетона из расчета на 1 массовую часть исходного сырья при перемешивании до образования гомогенного состояния, фильтрацию и обработку отфильтрованного осадка охлажденным ацетоном при тех же условиях, затем экстракцию этанолом при 20-30°С при использовании 2-4-х объемов этанола на 1 массовую часть отфильтрованного осадка и кристаллизацию из этанола. Способ может дополнительно включать повторную экстракцию этанолом отфильтрованного осадка сначала при 40-70°С при использовании также 2-4-х объемов этанола на 1 массовую часть отфильтрованного осадка. Перемешивание в охлажденном ацетоне проводится предпочтительно со скоростью 2000-3000 об/мин. Дополнительно получаемый кристаллический продукт подвергают перекристаллизации из этанола или промывают холодным ацетоном.

Существенной особенностью нового комплекса сложного состава является присутствие в нем наряду с цереброзидом и цереброзидсульфата, что повышает его эффективность как биологически активного средства по сравнению с известными аналогичными комплексами. Состав получаемого комплекса находится в прямой зависимости от способа его получения.

Выбор в качестве исходного сырья тканей головного или спинного мозга свиньи обоснован повышенным содержанием в них цереброзидов, а также содержанием в них биологически активного цереброзидсульфата, не обнаруженного в тканях других животных Важным признаком способа являются условия проведения гомогенизации сырья с применением экспериментально подобранных количеств охлажденного ацетона, что обеспечивает сначала максимальное обезвоживание сырья, а затем после фильтрации осадка и его повторной обработки охлажденным ацетоном - максимальное экстракционное отделение нейтральных липидов и холестерина.

Данный процесс в новом способе для гомогенизации необходимо проводить при перемешивании. Предпочтительной является скорость перемешивания, составляющая 2000-3000 об/мин, что позволяет значительно повысить эффективность процесса и сократить продолжительность этого этапа до 10 минут. Существенным признаком нового способа является применение в качестве экстрагента этанола в экспериментально подобранном количестве, составляющем 2-4 объема на 1 массовую часть отфильтрованного осадка. Благодаря комплексному использованию всех признаков нового способа удается получать продукт с повышенной биологической активностью, характеризуемый высоким содержанием цереброзида и цереброзидсульфата. Кроме того, новый способ экологически приемлем и технологически безопасен, поскольку в нем в качестве экстрагента используется экологически безопасный этанол, и, кроме того, используемый для гомогенизации ацетон применяется в малых количествах. Используемые в процессе чистые органические растворители подвергаются регенерации и рециклизации, что подчеркивает экономичность процесса и его экологическую безопасность. Особым достоинством способа является высокое содержание в комплексе основных компонентов: 25-57 мас.% цереброзида и 7-21 мас.% цереброзидсульфата.

Ниже изобретение иллюстрируется примерами 1-4.

Пример 1.

500 г свежезамороженного головного мозга свиньи размораживают, заливают ацетоном, имеющим температуру минус 20°С, в количестве 750 мл, что составляет 1,5 объема по отношению к исходному влажному сырью, гомогенизируют при перемешивании со скоростью 3000 об/мин, в течение 10 мин и отфильтровывают под вакуумом. После этого отфильтрованный осадок повторно заливают ацетоном, имеющим температуру минус 20°С в том же количестве /750 мл/ и гомогенизируют осадок перемешиванием в течение 20 мин и отфильтровывают под вакуумом. Ацетон сливают и утилизируют, а к отфильтрованным 125 г осадка приливают 500 мл этанола, что составляет 4 объема по отношению к осадку, и экстрагируют в течение 3 часов при температуре 30°С. Полученный спиртовой экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при +18°С в течение 24 часов до образования белого кристаллического осадка, который отфильтровывают. Получают 3 г кристаллического белого вещества, содержащего следующие компоненты, мас.%:, цереброзида - 25, цереброзидсульфата - 7,0, 29,2 - смеси фосфатидилхолина и сфингомиелина - 29,2, смеси холестерина, триглицеридов и ганглиозидов - 14,7, фосфатидилэтаноламина - 24,3.

Пример 2.

500 г свежезамороженного головного мозга свиньи размораживают и двукратно гомогенизируют в 500 мл ацетона при температуре минус 15°С аналогично примеру 1. Затем 100 г полученного осадка о мозговой ткани дважды подвергают экстракции спиртом. При этом первую экстракцию осуществляют при температуре 25°C, для чего к осадку добавляют 300 мл этанола, что составляет 3 объема по отношению к осадку, взятому для спиртовой экстракции, и перемешивают в течение двух часов. После экстракции спиртовой экстракт отделяют от отфильтрованного осадка и утилизируют, а отфильтрованный осадок снова смешивают с 200 мл этанола, что составляет 2 объема по отношению к осадку, полученному после последней ацетоновой гомогенизации. Экстракцию проводят при температуре 60°С в течение 2 часов, после чего отделяют спиртовой экстракт от оставшейся твердой массы методом фильтрации. Конечный спиртовой экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при температуре 20°С в течение 24 часов до образования кристаллического осадка, который отделяют от маточника фильтрацией. Получают 2 г кристаллического белого вещества, содержащего следующие компоненты, мас.%: цереброзида - 37, цереброзидсульфата - 9,0, смеси холестерина, триглицеридов, танглиозидов - 6,9, фосфатидилэтаноламина - 24,1, смеси сфингомиелина и фосфатидилхолина - 23.

Пример 3.

500 г свежезамороженного головного мозга свиньи размораживают и подвергают двухстадийной гомогенизации ацетоном по способу, описанному в примере 1. 100 г полученного осадка мозговой ткани подвергают двухстадийной экстракции этанолом аналогично примеру 2. Отделяют спиртовой экстракт от твердого остатка методом фильтрации. Экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при температуре 20°С в течение 24 часов до образования кристаллического белого осадка. Кристаллический осадок отфильтровывают от маточника и подвергают перекристаллизации из этилового спирта. К полученным 2 г кристаллического вещества добавляют 50 г этанола и перемешивают при температуре 40°С в течение 1 часа. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат под вакуумом. Получают 1,5 г кристаллического вещества, содержащего следующие компоненты, мас.%: цереброзида - 57, цереброзидсульфата - 21, смеси холестерина, тригликозидов и танглиозидов - 6,0, фосфатидилэтаноламина - 7,2, смеси фосфатидилхолина и сфингомиелина - 8,8.

Пример 4.

500 г свежезамороженного спинного мозга свиньи размораживают и подвергают двухстадийной гомогенизации ацетоном, затем фильтрации аналогично способу, описанному в примере 1. Затем 100 г осадка мозговой ткани подвергают одностадийной экстракции этанолом по способу, описанному также в примере 1. Затем отделяют спиртовой экстракт от твердого остатка мозговой ткани методом фильтрации. Экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при 20°С в течение 24 часов до получения кристаллического осадка. Кристаллический осадок отделяют от маточника и проводят перекристаллизацию из ацетона. К 2 г кристаллического вещества добавляют 30 г ацетона при температуре минус 20°С и перемешивают в течение 1 часа. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат под вакуумом. Получают 1,6 г вещества, следующего состава, мас.%: цереброзида - 46, цереброзидсульфата - 15, холестерина, триглицеридов и ганглиозидов - 7,5, фосфатидилэтаноламина - 22,5, фосфатидилхолина и сфингомиелина - 9,0.

Группа изобретений относится к медицине, биотехнологии, косметологии и может быть использована в технологии получения липидных комплексов, в частности цереброзид-цереброзидсульфатсодержащих, которые могут быть применены при производстве различных форм лекарственных препаратов и косметических средств. Цереброзид-цереброзидсульфатсодержащий липидный комплекс содержит, мас.%: холестерин, триглицериды и ганглиозиды - 6,0-14,7, цереброзид - 25,0-57,0, фосфатидилэтаноламин - 7,2-24,1, фосфатидилхолин и сфингомиелины - 8,8-29,2, цереброзидсульфат - 7,0-21,0. Способ получения цереброзид-цереброзидсульфатсодержащего липидного комплекса включает гомогенизацию спинного или головного мозга животных в охлажденном ацетоне, фильтрацию, перемешивании до гомогенного состояния, фильтрацией, повторную обработку отфильтрованного осадка ацетоном из расчета 1,0-1,5 объемов ацетона на 1 обрабатываемого сырья, одно- или двухстадийную экстракцию отфильтрованного осадка этанолом, сначала при 20-30°С, а затем, при наличии второй стадии, при 40-70°С и последующей кристаллизацией и/или перекристаллизацией из этанола и/или промывкой холодным ацетоном. Способ обеспечивает получение липидного комплекса с повышенной биологической активностью. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

1. Цереброзид-цереброзидсульфатсодержащий липидный комплекс, получаемый из головного или спинного мозга свиньи, характеризуемый содержанием холестерина, триглицеридов, ганглиозидов, цереброзида, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, сфингомиелина, цереброзидсульфата в следующем весовом соотношении, мас.%:

Холестерин, триглицериды ганглиозиды6,0-14,7Цереброзид 25,0-57,0Фосфатидилэтаноламин7,2-24,1Фосфатидилхолин, сфингомиелин8,8-29,2Цереброзидсульфат7,0-21,0