"Способ получения комплекса липидов "фосфотим" из животного сырья" Советский патент 1993 года по МПК A61K35/26 A61K31/685 

Изобретение относится к фармацевтической и парфюмерно-косметической промышленности, а получаемый комплекс липидов может использоваться в медицине как иммунокоррегирующее средство, в косметике как компонент для регенерации клеток кожи.

В отличие от известного сущность предложенного способа заключается в следующем:

- в качестве сырья используют вилочко- вуф железу крупного рогатого скота, которую измельчают и гомогенизируют в физиологическом растворе;

| - отделяют жидкую фазу (центрифугируют) при этом образуется осадок и сусперна- тант с флотирующей липидной фракцией;

- из флотирующей фракции экстрагируют йзопропанолом комплекс липидов;

-отделяют жидкую фазу (декантация и центрифугирование);

-осаждают ацетоном комплекс биологически активных липидов;

-концентрируют (отгонка ацетона) и сушат конечный продукт.

Получаемый комплекс содержит: глице- риды 37-55%, холестерин 4-13% (в свободном и этерифицированном виде), свободные жирные кислоты 6-12% при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщеным 1:1. 14-40% плазмалогены, фосфолипиды 2-13% (фос- фатидилхолин, фосфати.дидэтэноламин , сфингомиелик, фосфатидилинозитол в соотношении 1:1:0,7:0,3).

Несмотря на разнообразие общепринятых источников сырья для получения липидов, вилочкоеэя железа, известная для специалистов как источник сырья для еыдеЫ О

ю

СО

ления иммуноспецифических белков, никогда для этих целей не использовалась. В настоящее время из указанной железы выделяют исключительно белковые препараты, обладающие иммунокоррегирующи- ми свойствами, например: вилозен (7), тималин (8), та-ктивин (9). При этом сырье используют недостаточно рентабельно, так как выход известных препаратов составляет всего 5-7% от веса исходного сырья.

Предложенное изобретение, не исключая выделения из БИЛОЧКОВОЙ железы указанных белковых препаратов, позволяет получать параллельно комплексы биологически активных липидов благодаря оптимальной утилизации фракций гомогенизированного сырья после центрифугирования: супернатант используют для выделения известных белкоаых препаратов (7, 8, 9), а флотирующую фракцию - для выделения нового комплекса биологически активных липидов.

Исследования состава полученного комплекса выявляют существенный имму- нокоррегирующий эффект.

Возможность осуществления нового способа, а также доказательства биологической активности комплекса липидов иллюстрируются примерами конкретного выполнения изобретения и испытания биологического действия конечного продукта.

Пример I. 10 кг вилочковой железы измельчают на мясорубке с диаметром фильеры 2 мм, гомогенизируют в 2 объемах физиологического раствора, центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин и температуре 4°С в рефрижераторной центрифуге. Из су- пернатанта выделяют препараты типа вилозен. Флотирующую фракцию супернатанта отбирают и экстрагируют в реакторе 7 объемами изопропанола в течение 3 ч при перемешивании и последующем отстаивании экстракта в течение 16ч и центрифугировании (3000 об/мин 30 мин, -4°С). Суспернатант декантируют и концентрируют путем вакуумной отгонки растворителя. Целевой продукт получают переосаждением 2 объемами ацетона при 4°С. Фильтрацией и сушкой. Выход конечного продукта составляет 4% от веса исходного сырья и 20% от влажного веса флотирующей липид- ной фракции.

Состав комплекса липидов: холестерин 6% в свободной и этерифицированной форме: свободные жирные кислоту 12% при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщенным 1:1, фосфолипиды 2% (фосфатидилхолин, фосфатидилэтанола- мин, сфингомиелин, фосфатидилинозитол

при соотношении 1:1:0,7:0,3), глицериды 45%, плазмалогены 35%. .

Пример 2. 10 кг вилочковой железы обрабатывают аналогично примеру 1 и получают флотирующую фракцию супернатанта, которую отбирают и экстрагируют в реакторе 5 объемами изопропалона в течение 3 часов при перемешивании и последующем отстаивании экстракта.

0 Надосадочную жидкость декантируют и центрифугируют при 0°С в течение 20 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, а растворитель удаляют вакуумной отгонкой. Целевой продукт получают

5 переосаждением липидов 5 объемами ацетона при 0°С, фильтрацией и сушкой. Выход конечного продукта составляет 6% от массы исходного сырья и 30% от влажной массы флотирующей фракции.

0 Состав комплекса, %: глицериды 55, холестерин 13 в свободной и этерифицированной форме, свободные жирные кислоты 8 при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщеным 1:1, фосфолипи5 ды10(фосфатидилхолин,

фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин. .. фосфатидилнозитол в соотношении 1:1:0,7:0,3), плазмалогены 14.

П р и м е р 3. 10 кг вилочковой железы

0 обрабатывают аналогично примеру 1 и получают флотирующую фракцию супернатанта, которую отбирают и экстрагируют в реакторе 10 объемами изопропанола в течение 3 часов при перемешивании и последу5 ющем отстаивании экстракта. Надосадочную жидкость декантируют, а растворитель удаляют вакуумной отгонкой. Целевой продукт получают переосаждением липидов 10 объемами ацетона при 0°С,

0 фильтрацией и сушкой. Выход конечного продукта составляет 7% от веса исходного сырья и 35% от влажного веса флотирующей фракции.

Состав комплексов, %: глицериды 37, хо5 лестерин 4 в свободной и этерифицированной форме, свободные жирные кислоты 6 при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщенным 1:1, фосфолипиды 13 (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин,

0 сфингомиелин, фосфатидилинозитол в соотношении 1:1:0,7:0,3). плазмалогены 40.

Пример 4. Активность полученного комплекса липидов фосфотим определяют в эксперименте in vitro параллельно с конт5 ролем - препаратом Вилозен (7). Лимфоциты тимуса мышей выделяют разволакиванием ткани пинцетами в среде RPM1-1640 (Комиссаренко С.В.. Уманский В.Ю., Дмитренко Н.П. Активность адено- зиндезаминазы и ферментов обмена AMP в

стимулированных КонА тимоцитах крыс. Иммунология, 1982, № 2. с.16-18). Среда содержит НЕРЕС (20 мМ), МаНСОз (1.5 мг/мл), пенициллин (50 Е/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и эмбриональную сыворотку крови (5%), рН среды доводят до 7.3-7,5% бикарбонатом натрия. Суспензию клеток фильтруют через капроновое сито и дважды центрифугируют по 10 мин при 8000 д. Жизнеспособность лимфоцитов определяют ме- годом витального окрашивания 0,1% раствором трипанового синего в изотоническом растворе NaCI. В полученной суспензии содержится не менее 99% живых ;клеток. Тимоциты культивируют в среде вы- целения при 37°С. концентрация составля- зт 1x10 клеток в 1 мл. Активацию тимоцитов вызывают преинкубацией клеток з течение 2 часов с полученным комплексом ипидов (0,05-0,3 мг/мл) и препаратом ви- озен (контроль) в таких же концентрациях последующей отмывкой инкубационной редой путем центрифугирования в течение О мин, при 800 д, после чего в культураль- ную среду инкубирующихся клеток опытной ti контрольной групп вносят конкавалин А ;о конечной концентрации 5 мкг/мл. Мече- ие ДНК производят в течение 2-часового гериода с Н-тимидином (6- Н-тимидин, 4 N кМ). Включение метки определяют через 72 ч от начала культивирования.

Включение меченого предшественника б, ДНК исследуемых тимоцитов определяют по радиоактивности кислотонерастворимо- г осадка клеток после их осаждения на бумажных фильтрах Whatman - ЗММ и п эомывании 6% ТХУ, Н20 и этиловым спир- тбм, высушивания эфиром. Радиоактив- н|эсть фильтров подсчитывают в сцинтилляционнрй жидкости ЖС-1.

Включение меченого тимидина в ДНК клеток, преинкубированных с 0,05 мг/мл нового липидного комплекса, в 3 раза выше, чем в тимоцитах, преинкубированных с 0,05 вилозена (контроль),

Пример 5. Испытания иммунной активности полученного комплекса липидов фосфотим проводят in vitro на лимфоцита крови 20 больных (10 ревматоидным артритом, 10 осложненной травмой лозвоночника с повреждениями спинного мозга).

В опытах in vitro оценивают влияние прэинкубации нового комплекса с лимфоцитами периферической крови, выделенными в гэадиенте плотности фиколл-верогрэфия, на процессы тотального спонтанного ро- зе1 кообразования (Тт-РО) лимфоцитами бо/ ьных с эритроцитами барана, являющиеся маркером Т-лимфоцитов (M.Gondal и

соавт. 1972) и активного спонтанного ро- зеткообразования (Та-РО), являющиеся маркером дифференцирующейся субполя- ции Т-лимфоцитов (H.MIne. N.Kenichl 1978, G.Bertogllo 1976). Для исследований отбирают лимфоциты лиц, у которых содержание Та-РО в периферической крови менее 20%, т.е. имеющие дефект в процессе созревания лимфоцитов. Преинкубацию проводят в течение 2 ч с последующим отмыванием лимфоцитов 10мл среды 199.

Реакцию Тт-РО проводят по методике MJendal (1972) в модификации Петрова (1978), а Та-РО по методу J.Wybran, N.N.Fundenberg (1973). Конечная концентрация в инкубационной среде нового комплекса 0,05 мг/мл.

Количество лимфоцитов, формирующих Та-РО, повышается после преинкубации их с новым липидным комплексом в группе больных с ревматоидным артритом на 82% и наблюдается у всех 10 обследованных лиц этой группы. Более отчетливо стимулирующее влияние (на 12% - р 0,01) в группе больных с травмой позвоночника, осложненной повреждением спинного мозга.

Аналогичные тенденции, хотя и менее выраженные, отмечаются под влиянием но- зого липидного комплекса на Тт-РО. Новый комплекс повышает на 5,6% способность лимфоцитов больных ревматоидным артритом людей к образованию тотальных розеток. У лимфоцитов больных с травмой позвоночника, осложненной повреждением спинного мозга, активация нового комплекса более значительна и составляет 7.8% (р 0,01).

Факт более значительного влияния нового комплекса на процесс Та-РО по сравнению с Тт-РО позволяет предположить воздействие, прежде всего, на предшественники клеток, популяцию Т-лимфоцитов. поверхностные маркеры которых выявляются в реакции Та-РО. т.е. клеток на стадии дифференциации. :

Таким образом, новый комплекс, очевидно, активирует созревание Т-лимфоцитов, особенно в условиях их дефицита при таких сложных патологиях как ревматоидный артрит и травма позвоночника, осложненная повреждением спинного мозга.

Формула изобретения Способ получения комплекса липидов фосфотим из животного сырья, включающий измельчение сырья, экстракцию органическим растворителем, отделение супернатанта, содержащего целевой продукт, центрифугированием с последующим его концентрированием, отгонкой, о т л и ч

а ю щи и с я тем, что в качестве сырьяцию суспернатанта экстрагируют изопропаиспользуют вилочковую железу крупногонолом в соотношении 1:5-10, снова центрирогатого скота, после измельчения сырьефугируют, а целевой продукт после отгонки

гомогенизируют в физиологическом раство-обрабатывают ацетоном в соотношении

ре, центрифугируют, флотирующую фрак-5 1:2-10,

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, получав мый комплекс липидов может использоваться в медицине как иммунокоррегирующее средство. Сущность изобретения: в качестве сырья используют вилочковую железу крупного рогатого скота, которую измельчают, гомогенизируют в физиологическом растворе, центрифугируют, из флотирующей липидной фракции суспернатанта путем экстракции йзопропанолом в соотношении 1:{5-10). выделяют комплекс липидов, центрифугируют, из супернатэнта после переосаждения ацетоном в соотношении 1:(2-10) получают целевой продукт.