Способ выделения сфингомиелина Советский патент 1985 года по МПК C07F9/10 

1 Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именно к усовершенствованному способу в вделения сфингоьетелина, который находит широкое применение в изучении структуры и функции мембран в медицинских исследованиях, в частности, при изучении патологии головного мозга j Известен способ вьзделения сфингомиеяин.2 из говяжьего мозга путем экстракдаш из него липидов последовате,яьно ацетоном, этанолом, петро лейнш эфиром, двухкратным переосаждением в дйэтияовом эфире с последз/то щим исцелением неочищенного сфингогш елина растворения фракции сфинго.пашнд кв в смеси хлороформг метанаи (98:2), очисткой на колонке с окисью алюминия с последующим мяг КИМ ще.(ючнь&4 гидролизом сфингомиелиновой фракции и ее нейтрализацией, растворением высувенного остатка в смеси яетролейного зфира и метанола осаждением ацетонрм и .очисткой на ко лонке с силшкагелем. Из 500 г мозга получают 1 г сфинго телина, чт составяяет от исходного субстрата ГЛ . Однако этот способ трудоемкий и длительн 1(}, а выход сфингомиелина низкий. Известен также способ ввделения сфингомиелина, эаключакщгйся в экс тракции лшшдов плазш крови последовательно ацетоном, этанолом, смесью хлороформ-метанол (2:1), разделении их на двух силикагелевых колонках, последующем мягком щелочном гидролизе сф;ннгомиелинрвой фракгщи и дополнительны очистке на колонке с сшшкагелем. Из t5 л крови (650 г плазмы) получают 940 мг сфингомиелина что со гтавляёт 0,14Z от исходного субстрата 2 Однако этот способ технологически сложен, так как требует длительной экстракции кипящими растворителями (24 ч ацетоном и 36-48 этанолом), использования двух колонок с силикагелем для получения неочищенного сфинго1чиелина из .комбинированного этанольно-ацетонового экстракта и из хлороформ-метанольного экстракта и дополнительной очистки грязного сфингомиелина на колонке -с силикагелем. Выход сфингомиелина низкий. 752 Наиболее близким к, изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения сфингомиелина, заключающийся в четырехкратной экстракции липидов из говяжьих почек смесью хл9роформ-метанол (2:1), проведении мягкого щелочного -гидролиза их, нейтрализации, последующем отделении жирных кислот и холестб;рина от липидов, устойчивых к щелочному гидролизу, колоночной хроматографией на силикагеле, колоночной хроматографии фракции сфинголипидов на ДЭАЭ-целлюл.озе с последующим разде лением нейтральной и кислой е4 1нголипидных фракций колоночной хроматогра(|ией на силикагеле. Выход сфинго- миелина 96,5% от исходного содержания сфингомиелина в субстрате З. Однако известный способ характеризуется большой длительностью, сложностью технологии, так как требуется двухкратная очистка продуктов на колонке с силикагелем и с ДЕАЕ-целлюлозной, а также недостаточно высоким выходом целевого продукта. Целью изобретения является упрощение технологии процесса и повышение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения сфингомиелина из сырья животного проис хождения,экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1:1 с добавлением 15-25 об.% воды от объема смеси, полученный лйпидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавленной соляной кислотой, щелочному гидролизу разбавленньм раствором щелочи с последующей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении (4-5): :(5-6) и сфингомиелина -.смесью хлороформ-мета цол при их объемном соотношении 2:8. Контроль за составом липидного экстракта, составом фракций, элюиру-. емых с колонки, и проверку чистоты полученного целевого продукта осу- . ществляют с помощью микротонкослойной хроматографии на силикагеле и микроаналитических процедур. Для этой цели используют однои двумерную хроматографию: 1 - сиетема хлороформ-мётанол-аммиак 65:25: на пластинке обнаружено одно 2- хлороформ-метаНол-25%-ньй аммиак 65:25:5 первое направление, хлороформ-ацетон-метанол - уксусная кислота (ледяная) - вода 30:40:10:10:5 второе направление. Двухмерная ТСХ показывает одно пятно, обнаруживающее Р-положительную реакцию на молибдатный реактив, холин-прложительную реакцию на реактив Драгендорфа. Жирные кислоты: 16:0 (18,3), 17:0 (1,2), f8:0(9,7),18:1(0,4j;t9; (0,6), 20:0 (5,9), 20:1 (0.2), 21:0 СО,7), 22:0 (34,1), 22:1 (1,4), 23,0 (5,5), 23:1 (0,6)., 24:0 (14,5), 24:1 (). Мол. вес 810. Фосфора 3,76% (теоретическое 3,8%). Фосфор-холинсфингозин-жирная кислота 0,98:1:1 03 :0,96 практическое значение (1:1:1: теоретическое). . . П р и м е р 1. Получение сфингомиелина из почек свиньи. 1. Получение экстракта. 270 г све жезамороженных свиных почек измель,чают на мясорубке. Трижды экстрагиру |смесью хлороформ-метанол 1:1 при со отношении ткань-растворитель 1:5, |Гомогенизируют 3 мин, добавлюят 120% воды и вновь гомогенизируют 3мин, фильтруют на воронке Бюхнера или центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Объединенные экстракты разделяют на делительной воронке. Водный слой отбрасывают. . Хлороформ-метанольный слой упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 50 С. Из 270 г свиных :почек получают 6,48 г общих липидов, из них фосфолипидов 86%. В состав : фосфолипидов входят, %: сфингомиелин 19,7; фосфатидилхолин 27,4; фосфатидилэтаноламин 22,4; фосфатидилсерин 9,2j фосфатидилинозит 8,3; дифосфатидипглицерин 9,1; дифосфатидилинозит 1,8; дизофосфатидилзтаноламин 1,4; лизофосфатидилхолин t,3. Добавка воды 15-25% не влияет на выход конечного продукта. Снижени до 13% приводит к отсутствию расслоения в системе, увеличение свыше 25% ведет к уменьшению выхода конечного продукта. Получение экстракта. 270 г свеже Замороженных свинных почек обрабатывают по примеру 1,1, но для экстрак-, ции используют систему хпороформ-метанол 2:1. Выход общих липидов 6,32 г, из них фосфолипидов 84%. В составе фосфолипидов 15,9% сфингомиэлина. По сравнению с примером 1,1 содержание.сфингомиэлина в экстракте на 23% меньше. 270 г свежезамороженных свинных почек обрабатывают по примеру 1,1 но для экстракции используют систему хлороформ метанол 1:2. Выход общих липидов 6,35 г, из них фосфолипвдов 80%. В составе фосфолипидов 17,.1% сфингомиелина. По сравнению с примером 1.Т содержание сфингомиелина в экстракте на 18% меньше. 2. Получение сфингомиелиновой фракции. К общему липидному экстракту добавляют 1 н. НС1 в метаноле (на 6,48 г общего липидного эк.стракта 9 мл 1 н, НС1 в метаноле) -и инК5 ируют 30-40 мин при 37-40°С, нейтрализуют 1 н. NaOH в метаноле, добавляют 1 н. NaOH в метаноле. (на 6,48 г исходного липидного экстракта 80 мл 1н. NaOH в метаноле) и инкубируют 30-40 мин при 37-40 С.К гидролизату добавляют 2 объёма хлороформй и 1/5 ч дистиллированной воды. После разделения фаз верхнюю водную фазу отбрасывают, нижнюю хлороформную фазу проверяют на нейтральную реакцию и упаривают досуха на роторном испарителе. В случае необходимости отмывку водой повторяют до получения нейтральной реакции. Выход фракции 5,90 г. Фракция готова к нанесению на колонку. Вьщеление сфингомиелина. Для разделения 5,9 г липидов используют 180 г неактивированного силикагеля марки Л 40/100. Отношение силикагеля к загружаемой фракции липидов 30:1. Силикагель суспендируют в системе хлороформ-метанол (5:5) и загружают в колонку диаметром 4 см и высотой адсорбционного столба 28 см, т.е. отношение диа.метра к высоте 1:7, объем колонки 300 мл. На верх кладут бумажный фильтр. Фракцию липидов в 100 мл смеси хлороформ-метанол (5:5) вносят в колонку и начинают процесс элюирования. Для злюирования используют: 2,1 олоночных объемов (0,63 л) смеси лороформ-метанол 5:5, вымывают холетерин; 4,5 колоночных объемов If,35 л) смеси хлороформ-метанол элюируют метиловые эфиры жирных кислот и цереброзиды; 12 колоночных объ мов (3,6 л) смеси хлороформ-метанол 2:8, вымывают с шнгомиелин, выход пр дукта 995 МР с чистотой 99%, что соответствует 99,5% от исходного количества с нгомиелина в свиных почках и 0,37% от исходного количества субстрата. П р и м е р 2. Экстракт получают по примеру 1. & щеление сфингомиелино вой фракции проводят по примеру 1. Вццепение сфингомиелина. Подготовку колонки ведут по-примеру 1. Дпя элюции используют 5 колоночных объемов ( л) смеси хлороформ-метанол 5:5, 3,5 колоночных объемов Л,65 л) смеси хлороформ-метанол 4:6, 12,5 колоночных объемов (3,75 л) смеси хло роформ-метанол 3:7 - вымывают сфингомиелин. Выход с тнгомиелина 900 мг, чистота 93%. П р и м е р 3. Экстракт получают : по примеру 1. Вьаделение сфингомиелииовой фракции проводят по примеру 1. Вьщеление сфингоми«глина. ПодгоТоВ ку колонки ведут по примеру 1. Для элюирования используют 5,5 колоночных объемов (1,65 л) смеси хлороформ «етанол 5:5. 10 колоночных объемов (3,0 л) смеси хлороформ-метанол 3:7, 4,5 колоночных объемов (1,35 л) смеси хлороформ-метанол 2:8. Выход сфингомиелина 1 г, чистота 85%, загрязнен цереброзидами. Использование предлагаемого способа тюлзгчения сфингомиелина по сравнению с известным позволяет повысить выход целевого продукта до 99,5%, а также быстро, просто и без больших потерь получить хроматографически чистый продукт за счет удаления плазмалогенов при мягком кислотном гидролизе и дальнейшего вьщеления сфингомиелина на единственной колонке с силикагелем путем элюирования примесей смесью хлороформ-метанол (4-5):(5-6). и сфингомиелина - смесью хлороформ-метанол (2:8). Сфингомиелин, полученный по гфедлагаемому способу, значительно дешевле (в 21 раз) чем по известному.

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ СФИНГОМИЕЛИНА из сырья животного происхождения, включающий экстракцию липидов смесью хлороформ-метанол, щелочной гидролиз липидного экстракта, и очистку сфингомиелина на колонке с силикагелем, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса и повышения выхода целевого продукта, экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1:1 с добавлением 15-25 ьб.% воды от объема смеси, полученный липидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавв ленной соляной кислотой, щелочному гидролизу разбавленным раствором щелочи с последукицей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформметанол при их объемном соотношении