СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ ESCHERICHIA Российский патент 2006 года по МПК C12N1/21 C12P13/08 C12R1/19 

Область техники.

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот методом ферментации, более конкретно, к гену, полученному из Escherichia coli, который положительно влияет на результаты ферментации. Указанный ген вызывает увеличение продукции L-аминокислот, и в частности, например, продукции L-треонина.

Предшествующий уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, выложенную патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; европейский патент 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ 0114525 А1, европейская заявка 301572 А2, патент США 5661012), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).

Для создания штамма ВКПМ В-3996 несколько мутаций и плазмида, описанная ниже, были введены в родительский штамм Е.coli К-12 (ВКПМ В-7). Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что является очень эффективным при продукции треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигало 85 г/л.

Ранее авторы настоящего изобретения получили исходя из Е.coli K12 мутант, содержащий мутацию thrR (упоминаемый здесь и далее как rhtA23), придающую устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной питательной среде (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Фенотипически мутация выражается в повышении продукции L-треонина (патент СССР №974817), гомосерина, и глутамата (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991, Европейская патентная заявка 1013765А) соответствующим штаммом-продуцентом Е.coli, таким как штамм ВКПМ-3996. Более того, авторы настоящего изобретения показали, что ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli, рядом с опероном glnHPQ, кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, и что ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181), расположенной между генами рехВ и ompX. Участок, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; Европейская патентная заявка 1013765).

В условиях, когда главный путь биосинтеза треонина изучен и в значительной степени оптимизирован, дальнейшее улучшение штамма - продуцента треонина может быть постигнуто путем повышения в бактерии количества дальних предшественников треонина, таких как аспартат.

Известно, что аспартат является донором углерода для синтеза аминокислот семейства аспартата (треонин, метионин, лизин) и диаминопимелата - одного из составляющих элементов клеточной стенки бактерий. Эти синтезы осуществляются в сложных метаболических путях с несколькими точками разветвления и чрезвычайно чувствительными схемами регуляции.

В точке ветвления аспартата, полуальдегида аспартата, гомосерина столько изозимов, сколько и аминокислот, получающихся из этого биосинтетического этапа. Аспартокиназа-гомосериндегидрогеназа I, кодируемая частью оперона thrABC, осуществляет первую и третью реакции биосинтеза треонина. Треонин и изолейцин регулируют экспрессию аспартокиназа-гомосериндегидрогеназы I, а треонин ингибирует обе активности, катализирующие вышеупомянутые реакции (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Ген asd кодирует аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу (Asd; EC 1.2.1.11), являющуюся ключевым ферментом путей биосинтеза лизина, метионина, треонина и диаминопимелата. Аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназа обратимо превращает L-аспартил-4-Р в L-аспартатполуальдегид, восстанавливая при этом НАДФ. Показан эффект влияния амплификации гена asd на продукцию L-лизина, аминокислот семейства аспартата, в штамме Е.coli (патент США 6040160). Также показано, что аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназа может положительно влиять на продукцию L-лизина, L-треонина и L-изолейцина у коринеформных бактерий (Европейская патентная заявка 0219027).

Однако к настоящему времени нет сообщений об использовании бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, с увеличенной активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы для производства L-треонина.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов продуцентов L-треонина и предоставление способа получения L-треонина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что ген asd, кодирующий аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу, клонированный в низкокопийный вектор, может увеличивать продукцию треонина. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Целью настоящего изобретения является создание бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, продуцента L-треонина, при этом указанная бактерия модифицирована с целью повышения активности аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы повышена за счет увеличения экспрессии гена, кодирующего аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы повышена за счет увеличения числа копий гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген,

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой ген аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой указанный ген аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы кодирует один из белков группы, включающей в себя:

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2; и

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой ген аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы содержит следующую ДНК (а) или (b):

(a) ДНК, которая представлена последовательностью нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1; и

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным на основании указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С в течение 15 минут, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0,1% SDS.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где указанная бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу; и

- гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где указанная бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA.

Также целью настоящего изобретения является создание способа получения L-треонина, включающего описанные выше стадии выращивания бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде; и выделения L-треонина из культуральной жидкости.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Согласно настоящему изобретению «бактерия - продуцент треонина» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-треонина в питательной среде в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-треонина может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия - продуцент L-треонина» также означает бактерию, которая способна к продукции L-треонина и вызывает накопление L-треонина в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli К-12.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в их число согласно настоящему изобретению.

Термин «активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы» означает активность по катализу реакции обратимого субстрат-зависимого восстановления НАДФ в присутствии фосфата или арсената. Активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы может быть измерена с помощью метода, описанного, например, у Preiss, J. et al. (Curr. Microbiol., 7: 263-268 (1982)).

Термин «модифицирована с целью увеличения активности аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы» означает то, что удельная активность становится выше, чем у немодифицированного штамма, например природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы увеличена и так далее. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-треонина.

Увеличение активности аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы в клетке бактерии может быть достигнуто путем увеличения экспрессируемого количества гена, кодирующего аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу. В качестве гена, кодирующего аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу, может быть использован любой такой ген, выделенный из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, а также гены, выделенные из бактерий других видов, таких как коринеформные бактерии. Наиболее предпочтительными из них являются гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.

В качестве гена, кодирующего аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу из Escherichia coli, известен ген asd (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131307). Следовательно, ген asd может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al. Trends Genet, 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, приготовленных на основании последовательности нуклеотидов указанного гена. Гены, кодирующие аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу, из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Примером гена asd из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (А) и (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2; или

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

Количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). Это происходит из-за того, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и различия в таких аминокислотах не вызывают значительных изменений в трехмерной структуре белка и его активности. Поэтому белком (В) может быть белок, имеющий гомологию не меньше, чем 30-50%, предпочтительно 50-70% по отношению ко всем аминокислотным остаткам, составляющим аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу, и обладающий активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как описанная выше аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназа, может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу (SEQ ID NO: 1), например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в определенных местах содержат делеции, замены, вставки или добавки. ДНК, модифицированная, как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработками с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ излучения или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназа, может быть получена путем экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации, в подходящей клетке, и изучения активности любого экспрессируемого продукта. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназа, также может быть получена путем выделения ДНК из геномной ДНК, кодирующей аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу, содержащую мутации, или из клетки, содержащей ее, и которая гибридизуется с зондом с нуклеотидной последовательностью, включающей, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Списке последовательностей как последовательность 1 (SEQ ID NO: 1), в жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Трудно четко описать такие условия в каких-либо численных выражениях. Однако, например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие меньшей гомологией, не гибридизуются друг с другом. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга и, как правило, от рекомендаций изготовителя. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.

В качестве зонда может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0,1% SDS.

Делеции, замены, вставки или добавки нуклеотидов, описанные выше, также включают мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, ввиду индивидуальной разницы или видовых и родовых различий в бактериях, содержащих аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу.

«Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок», означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами. Трансформация указанной ДНК приводит к увеличению экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.

К методам увеличения экспрессии гена относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий этого гена. Для этой цели предпочтительно использовать низкокопийные векторы. Примерами низкокопийных векторов являются векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Используемый здесь термин «низкокопийный вектор» используется для векторов, количество которых не превышает 5 копий на клетку. В качестве метода трансформации может быть использован любой описанный к настоящему времени метод. Например, может быть использован метод обработки клеток-реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli К-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

Кроме того, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосомы бактерии, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и подобными им методами. Например, один раунд Mu интеграции позволяет встроить в бактериальную хромосому до трех копий интегрируемого гена.

Также увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может комбинироваться с увеличением числа копий гена.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Как описано выше, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении -1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, транспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быт осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO00/18935 или патентной заявке Японии №1-215280.

Увеличение числа копий гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы может быть достигнуто путем введения множественного числа копий гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множественного числа копий гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы в хромосомную ДНК бактерии применяется гомологичная рекомбинация с использованием последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК, в качестве мишеней. В качестве последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК в нескольких копиях, могут использоваться повторяющиеся фрагменты ДНК, а также инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Также, как это описано в патентной заявке Японии №1-109985, возможно ввести ген аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы в транспозон для последующей трансформации с введением множества копий указанного гена в хромосомную ДНК.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-треонина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-треонина.

В качестве родительского штамма, в которым активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы, кодируемой геном asd, будет повышена, могут быть использованы штаммы - продуценты треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих геном в дополнение к гену asd:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу.

Также предпочтительно, чтобы в дополнение к увеличению экспрессии гена asd указанная бактерия была модифицирована путем увеличения экспрессии гена rhtA, кодирующего, как предполагается, трансмембранный белок. Наиболее предпочтительное выражение настоящего изобретения заключается в бактерии с увеличенной экспрессией гена asd, мутантного гена thrA, генов thrB, thrC и rhtA.

Способ получения L-треонина согласно настоящему изобретению включает стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде и выделения L-треонина из культуральной жидкости. Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-треонина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-треонин может быть выделен и очищен методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Примеры

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие Примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения.

Пример 1: Клонирование гена asd из Е.coli в вектор рМ.

Ген asd был клонирован из хромосомной ДНК штамма Е.coli (K12 Mu cts62 Mud5005) (ВКПМ В-6804). Сначала в штамме Е.coli (K12 Mu cts62 Mud5005) (ВКПМ В-6804) был индуцирован фаг мини-Mu. Далее, библиотеку полученных производных плазмиды pMud5005, содержащих части хромосомы вышеупомянутого штамма, использовали для трансформации asd штамма SH 309. Штамм SH 309 (ВКПМ В-3899) имеет следующий фенотип: F^- araD139 rpsL150 deoC1 ptsF25 relA1 feb5301 rbsR ugpA704::Tn10 Del (argF - lac) U169 Del (mal - asd) Tet^R Str^R. asd штамм SH 309 не способен расти на L-среде, для роста ему требуется добавка диаминопимелиновой кислоты (DAPA). Клоны SH 309 asd⁺, содержащие плазмиду pMud5005-asd, были отобраны на L-среде. Была выделена плазмида pMud5005-asd, и BamHI-PstI ДНК фрагмент этой плазмиды (1646 п.о.), содержащий ген asd, был переклонирован на плазмиду pMW119, предварительно модифицированную путем замены промотора Р_lac на промотор P_R. Таким образом, была сконструирована плазмида pMW-asd, содержащая ген asd под контролем промотора P_R. Полученная плазмида pMW-asd совместима с плазмидой pVIC40 (репликон pRSF1010), поэтому обе плазмиды, pVIC40 и pMW-asd, могут одновременно экспрессироваться в бактериальной клетке.

Стрептомицин-устойчивый штамм Е.coli strain B-3996, продуцент треонина, был трансформирован полученной плазмидой pMW-asd. Таким образом, был получен штамм В-3996(pMW-asd).

Пример 2.Влияние амплификации гена asd на продукцию треонина.

Два штамма Е.coli B-3996 и B-3996(pMW-asd) выращивались в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащих стрептомицин (100 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл). Для получения посевной культуры каждый из штаммов выращивался в ферментационных пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой на роторной качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 18 часов. Затем в ферментационную среду внесли 0,1 мл (5%) посевной культуры. Ферментацию проводили в пробирках 20×200 мм с 2 мл минимальной ферментационной среды. Клетки выращивались в течение 24 часов при температуре 32°С на роторной качалке при 250 об/мин.

После окончания ферментации количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Пластинки Sorbfil (Акционерное Общество Сорбополимер, Краснодар, Россия) прогонялись в жидкой фазе следующего состава: изопропанол : ацетон : вода : 25% аммиак = 25:25:7:6 (соотношения объема). В качестве визуализирующего реагента использовался раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 1.

Использовали следующий состав среды для ферментации (г/л):

Сахароза40.0(NH₄)₂SO₄10.0KH₂PO₄1.0MgSO₄×7H₂O0.4FeSO₄×7H₂O0.02MnSO₄×5H₂O0.02Тиамин HCl0.0002Дрожжевой экстракт1.0СаСО₃20.0L-изолейцин0.05

Сахарозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН соответствовало 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на конкретные Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

ШтаммOD₅₆₀Треонин, г/лB3996/pMW-asd8.618.58.418.39.119.89.519.29.320.08.918.69.419.39.019.39.0±0.419.1±0.6В-3996 (контроль)9.318.69.617.910.517.910.617.69.817.89.918.110.218.010.017.910.0±0.418.0±0.3

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, указанная бактерия модифицирована с целью увеличения активности аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы. Согласно предложенному способу бактерию выращивают в питательной среде, а затем полученный и накопленный L-треонин выделяют из культуральной жидкости. Заявленное изобретение позволяет получать L-треонин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент треонина, отличающаяся тем, что такая бактерия модифицирована таким образом, что активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы увеличена.2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы увеличена за счет увеличения экспрессии гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы увеличена за счет увеличения числа копий гена аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена, таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген.5. Бактерия по любому из пп.2-4, отличающаяся тем, что ген аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что ген аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы кодирует белки (А) или (В):

(А) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2;

(В) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащую делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и обладающий активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

(a) ДНК, состоящую из последовательности нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1;

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным из указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназы.

мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.