СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2006 года по МПК A61B5/02 G01N33/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинико-лабораторной диагностике. Оно может быть использовано для установления степени выраженности патологического процесса в эндотелии сосудов человека.

Уровень техники

Сосудистые заболевания и осложнения таких болезней, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и сахарный диабет, в настоящее время являются основной причиной инвалидизации человечества (И.Е.Чазова, В.Б.Мычка, 2004). В связи с этим изменениям в сосудах придается основное значение, так как они становятся основным источником сосудистых катастроф при указанных заболеваниях. По современным данным основной патологический процесс в сосудах связан с эндотелиальными клетками. Они выстилают внутреннюю поверхность сосудистого русла и служат промежуточным звеном между циркулирующей кровью и гладкомышечными клетками (Ю.Н.Беленков с соавт., 2002). В последние годы показано, что эндотелиальные клетки играют важную роль в поддержании гомеостаза посредством системы химических медиаторов. Эти вещества, в зависимости от состава, вызывают вазоконстрикцию или вазодилятацию. Ключевым медиатором эндотелиальных клеток является оксид азота, уровень которого в определенной степени регулируется уровнем брадикинина, образующегося из кининогена под действием активированного прекалликреина (калликреина). Эти соединения являются составными элементами калликреин-кининовой системы (ККС), которая является центральным звеном в комплексе гуморальных систем, регулирующих гомеостаз и осуществляющих вазодепрессорные функции (Г.А.Яровая, 2002). Измененный или уменьшенный выброс этих вазоактивных веществ приводит к дисфункции эндотелия сосудов, трансформации диаметра и нарушению сосудодвигательной функции эндотелия. В результате этого происходит истощение и извращение компенсаторной дилатационной способности эндотелия и преимущественным ответом эндотелиальных клеток на обычные стимулы вазоактивных веществ становится их вазоконстрикция и пролиферация. На основе этого процесса формируется повышение артериального давления и другие патологические сосудистые изменения.

В связи с вышеизложенным признается актуальной проблема ранней диагностики сосудистых изменений с учетом функциональных возможностей эндотелиальных клеток и активности калликнеин-кининовой системы.

В обычной клинической практике функциональная активность эндотелиальных клеток оценивается инвазивными, неинвазивными и биохимическими методами. К первым относится коронарная катетеризация, ко вторым ультразвуковая доплерография с различными пробами и компьютерная томография, к третьим биохимическое определение вазоактивных веществ (J.L.Hondhton, A.A.Can, 1997). Недостатком инвазивных методов является их дороговизна, наличие крупногабаритной аппаратуры, потребность в специальных помещениях, а также определенные ограничения для пациента. Недостатками известных неинвазивных методов в определении эндотелиальной дисфункции является ограниченность их результатов и вариабельность интерпретации. При биохимической оценке вазоактивных веществ определяется только ограниченный круг соединений, иногда не связанных с изучаемым процессом, или определяется конечный результат, а не причина ее вызвавшая.

В частности, известен способ оценки вазомоторной функции сосудистого эндотелия, при которой больному проводят пробы с реактивной гиперемией, холодовую, нитроглицериновую и определяют уровень метаболитов оксида азота, исследуют сосуды периферического и церебрального бассейнов и по оригинальным формулам рассчитывают различные индексы (Гельцер Б.И., Котельников В.Н. и др., RU 2209587 С2). Недостатком этого способа является его большая громоздкость, многофакторность и сложная математическая обработка, а также длительность времени исполнения и особые условия предварительного отбора пациентов.

Описан способ внутривенного введения L-аргинина, позволяющий стимулировать продукцию NO и оценивающий NO-опосредованную дилатацию сосудов при различных заболеваниях. Клиническим проявлением сосудистого ответа на введение L-аргинина является снижение артериального давления (D.Fava, 2002). Недостатком этого способа является то, что снижение артериального давления является следствием изменения многих факторов и систем, а L-аргинин воздействует прицельно только на один из них. Кроме того, введение этого препарата за короткий промежуток времени может вызвать различные парадоксальные и аллергические реакции организма.

Известен также способ истощения калликреин-кининовой системы, когда экспериментальному животному одновременно вводят в кровеносное русло калликреин и кининазы. При введении этих веществ происходит активация кининообразования, вызывающая истощение предшественников активных кининов, кининогенов и значительное увеличение скорости кининоразрушения, что приводит к невозможности образования активных кининов по потребности организма, то есть к истощению ККС крови. Недостатком указанного способа является то, что он разработан для экспериментальных животных и его невозможно перенести на человека, т.к. ведение указанных веществ в организм человека может инициировать очень выраженные вазорелаксирующие реакции или другие побочные эффекты, способные вызвать шок (RU 2077721 С1).

Раскрытие изобретения

Указанные выше недостатки существующих способов определения эндотелиальной дисфункции преодолеваются в предлагаемом изобретении. С целью исключения трудностей, перечисленных выше, в настоящем изобретении предлагается способ определения эндотелиальной дисфункции, в котором проводят сочетанные измерения кровотока и исследуемого вещества, в частности содержания прекалликреина и пробы с реактивной гиперемией.

Таким образом, задача настоящего изобретения состояла в разработке доступного, простого и объективного способа оценки резервных возможностей эндотелия сосудов.

Эта задача достигается за счет определения резервных возможностей ККС, выполненного с помощью определения содержания прекалликреина и показателей, выявленных при пробе с реактивной гиперемией.

Авторами изобретения экспериментально показано, что при повышении уровня прекалликреина - профермента калликреина в сыворотке крови относительно его уровня до функциональной пробы на 10-40% имеет место функциональная полноценность эндотелия сосудов, так как значительно возрастает эндотелийзависимая вазодилятация (ЭЗВД), а при понижении содержания прекалликреина на 10-30% относительно исходного уровня имеет место дисфункция эндотелия сосудов, при которой ЭЗВД резко снижается в сравнении с контролем.

Изобретение предлагает оценивать резервные возможности эндотелиальных клеток сосудистого бассейна человека путем комплексного использования в заявленном способе результатов пробы с реактивной гиперемией и результатов определения активности калликреин-кининовой системы, на основе оценки содержания прекалликреина в сыворотке крови до и после ишемической пробы делается вывод о резервных возможностях эндотелиальных клеток сосудистого бассейна человека.

Проба с реактивной гиперемией может быть выполнена, например, по стандартной методике, как описано в ссылке D.Celermaier et al., 1989.

Активность калликреин-кининовой системы может быть определена на основе оценки содержания прекалликреина в сыворотке крови, выполненной, например, по методике в ссылке Т.С.Пасхина, А.В.Кринская, 1974.

Согласно предлагаемому способу вначале проводится эходоплерографическое исследование сосудов плечевой артерии линейным датчиком 7,5 МГц с фазированной решеткой. В режиме двухмерного звукового сканирования фиксируются изменения в диаметре плечевой артерии и линейной скорости кровотока до и после проведении пробы с реактивной гиперемией (эндотелий - зависимая вазодилятация). Эндотелийзависимую вазодилатацию выражают в процентном приросте диаметра артерии в ответ на проведенную пробу (реактивную гиперемию). Затем после отдыха производится забор крови из локтевой вены и в манжету сфигмоманометра, расположенную на плече, нагнетается давление, заведомо превышающее давление у пациента. Продолжительность пробы составляет пять минут. После чего производят резкую декомпрессию до нуля и в течение первой минуты выполняют повторный забор крови. В собранных образцах сыворотки крови определяют содержание прекалликреина после выделения неадсорбированной фракции белков сыворотки крови на ДЭАЭ-сефадексе А-50 с последующей активацией прекалликреина трипсином и оценкой его количества по эстеролитической активности калликреина по отношению к N-α-бензоил-аргинин-этиловому эфиру.

Содержание прекалликреина выражают в ME в 1 мл сыворотки крови, где ME - количество фермента, гидролизующего 1 мкМ БАЭЭ в 1 минуту при 25 градусах.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Исследования проводят утром, натощак, в спокойной обстановке. За 2 дня до исследования пациент ограничивает прием продуктов, содержащих большое количество экзогенных нитратов, за один день до исследования пациент ограничивает тяжелые физические нагрузки.

За 48 часов до исследования лечение остается неизменным.

Вначале проводят доплерографию сосудов предплечья с пробами.

Затем осуществляют забор венозной крови из кубитальной вены, проводят гипоксический тест по стандартной методике и затем опять производят забор крови из той же вены. После чего проводят биохимический анализ и математическую обработку полученных данных.

На основе полученных результатов делается заключение о наличии или отсутствии эндотелиальной дисфункции.

В качестве контрольной представительной группы были использованы добровольцы - практически здоровые лица, среднего возраста 46,5 лет, без признаков сосудистых заболеваний и со средним артериальным давлением 119/83 мм рт.ст. Эти лица характеризовались тем, что ЭЗВД у них в среднем составляла 9,58±0,5%; содержание прекалликреина до пробы было 357,50±10,44 МЕ/мл, а после пробы 342,68±10,13 МЕ/мл (таблица).

В группу больных, с целью оценки активности эндотелиальных клеток, были включены пациенты с артериальной гипертензией 1 степени (АД ср. - 157-96 мм рт.ст.) той же возрастной группы и с длительностью заболевания в среднем 4,4 года.

Неожиданно исследование показало, что в группе больных имеет место два типа реакции эндотелиальных клеток на тестовую нагрузку.

При первом типе реагирования отмечается статистически значимое снижение уровня прекалликреина на 30,2% (ρ<0,001) по сравнению с таковым в контрольной группе, а после пробы его уровень возрастал на 15,9% (ρ<0,001), а ЭЗВД увеличивались на 43,4% (ρ<0.05).

Этот тип реагирования оценивался как благоприятный.

При втором типе реагирования также выявляется статистически значимое снижение содержания прекалликреина, но заметно меньшее - на 19,2% ρ<0,001) в сравнении с контролем. Кроме того, после пробы содержание прекалликреина и ЭЗВД продолжает статистически достоверно дополнительно снижаться - на 16,4% (ρ<0,001) и 28,7% (ρ<0,05) соответственно по сравнению с аналогичными показателями до ишемической пробы.

Этот тип реагирования оценивался как неблагоприятный (таблица).

Накопленные данные по изучению активности ККС крови при патологических состояниях разного генеза позволяют сделать вывод о ведущей роли этой системы в реализации молекулярных механизмов гомеостаза. Однако существующий подход не содержит информации о степени функционального напряжения, скрытых нарушениях и компенсаторных возможностях как всей системы, так и ее отдельных компонентов.

В связи с этим несомненный интерес представляет оценка резервных возможностей ККС крови в условиях адекватных нагрузочных тестов, особенно при сочетании определения основных ее показателей, в частности содержания прекалликреина в сыворотке крови и определения ЭЗВД.

Увеличение содержания прекалликреина в сыворотке крови больных после ишемической пробы свидетельствует о сохранении возможностей его мобилизации из тканевых или плазменных форм и прогностически благоприятно, так как у этих больных не отмечено признаков эндотелиальной дисфункции. Снижение содержания прекалликреина в сыворотке крови после ишемической пробы свидетельствует об истощении возможностей его мобилизации из эндотелиальных депо и прогностически неблагоприятно, так как приводит к ослаблению эндотелиальной вазодилатации.

Таким образом, определение содержания прекалликреина в сыворотке крови до и после ишемической пробы позволяет: 1) оценить компенсаторные возможности организма в условиях адаптивного напряжения (болезни), 2) в доклиническом варианте прогнозировать развитие эндотелиальной дисфункции с индивидуализацией последующей лекарственной терапии.

Полученные данные позволили сделать ряд заключений: у части больных с неблагоприятным типом реагирования имеются признаки истощения содержания прекалликреина в сыворотке крови. Это происходит на ранних стадиях формирования патологического процесса и приводит к дисфункции эндотелиальных клеток. Дизадаптивные нарушения в ККС не позволяют ей в полном объеме осуществлять свою роль, направленную на нормализацию сосудистого вазодепрессорного гомеостаза.

Таким образом, важным преимуществом предлагаемого способа является возможность комплексной оценки эндотелиальной дисфункции на ранних стадиях развития патологического процесса при помощи стандартных методов исследования.

Пример 1.

Пациент В., 49 лет, проходящий профилактический осмотр. В анамнезе хронических заболеваний нет. У ближайших родственников сосудистой патологии нет. Ему проведено общеклиническое обследование, а также выполнено исследование вазомоторной функции сосудистого эндотелия и определено количество прекалликреина. Уровень АД при осмотре 125/80 мм рт.ст. По результатам пробы с реактивной гиперемией уровень ЭЗВД составлял 9.31%, уровень прекалликреина до пробы 342.68 МЕ/мл, а после пробы - 357.51 МЕ/мл. По результатам клинического обследования был признан практически здоровым, а по результатам проведенных проб выявлена высокая способность эндотелиальных клеток к вазодилатации, при этом уровень прекалликреина оставался стабильным, что свидетельствовало о сохранности резервных возможностей ККС.

Пример 2.

Больной К., 49 лет. Диагноз: Артериальная гипертензия 1 ст. умеренного стратификационного риска, ПК 0 ст. Считает себя больным 4.3 года. Пациенту проведены стандартные клинические исследования по рекомендациям Европейского общества кардиологов, выполнено исследование функциональной активности эндотелия сосудов и определен уровень прекалликреина. Среднесуточные величины систолического и диастолического давления были 152 и 89 мм рт.ст. соответственно. При ультразвуковой доплерографии обнаружено увеличение ЭЗВД на 42.3% (ρ<0.05) в сравнении с контролем. Уровень прекалликреина до пробы был снижен (231.47 МЕ/мл), а после пробы увеличился на 15% (266.2 МЕ/мл). Учитывая эти результаты, было сделано заключение о сохранении адаптивных возможностей ККС и отсутствии эндотелиальной дисфункции. Это обстоятельство позволило сохранить прежний курс лечения больного, признав его вполне адекватным.

Пример 3.

Больной С., 53 лет. Диагноз: Артериальная гипертензия 1 ст. умеренного стратификационного риска, НК 0 ст. Болен около 3 лет. Обследуется повторно. Больному проведены клинические исследования по рекомендациям Европейского общества кардиологов, а также выполнено комплексное изучение вазомоторной функции сосудистого эндотелия. По результатам обследования больному подтвержден (?) вышеуказанный диагноз. Среднесуточные величины систолического и диастолического артериального давления составили 157 и 97 мм рт.ст. Методом ультразвуковой доплерографии выявлено ослабление эндотелийзависимой вазодилатации плечевой артерии (ЭЗВД - 6.87%), а содержание прекалликреина в сыворотке крови до пробы составляло 294.62 МЕ/мл, а после пробы - резко снизилось до 242.72 МЕ/мл (на 18%).

Таким образом, прелагаемый способ позволил выявить у больного "С" эндотелиальную дисфункцию:

истощение резервных возможностей ККС в ответ на проведенную пробу, о чем свидетельствовало снижение содержания прекалликреина в сыворотке крови, что приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, за счет уменьшения вазодилатирующей способности и формированию сосудистой неполноценности.

Это позволило не только подтвердить и доказать наличие у больного "С" вышеупомянутого диагноза, но и выявить ранние функциональные изменения вазодепрессорных систем и наличие эндотелиальной дисфункции. Полученные данные позволили скорректировать проводимую терапию и предотвратить развитие более высокой гипертензии, а также последующие сосудистые катастрофы.

ТаблицаРезультаты проведения проб с реактивной гиперемией и определением уровня прекалликреина.ПоказательЭЗВД (%)Прекалликреин (МЕ/мл.)  До пробыПосле пробыКонтроль9,58±0,5357,50±10,44342,68±10,13Артериальная гипертензия благоприятный вариант.13,84±0,74
p<0,001227,22±10,77
p<0,001; p¹<0,001263,34±11,04
p<0,05Артериальная гипертензия, неблагоприятный вариант.6,93±0,58
p<0,005288,80±9,37
p<0,001241,51±16,16
p<0,001; p¹<0,001Р - достоверность отличий изучаемых показателей от таковых в контрольной группе.Р¹ - достоверность отличий изучаемых показателей до и после пробы.

Предлагаемый способ прошел апробацию в условиях клиники и зарекомендовал себя как высокоинформативный полезный для целей диагностики метод.

Список литературы

1. Беленков Ю.Н., Мареев В.Ю., Агеев Ф.Т. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента в лечении сердечно-сосудистых заболеваний // Москва, 2002. - 86 с.

2. Чазова И.Е., Мычка В.Б. Метаболический синдром // Москва, Медиа Медика. - 168 с.

3. Пасхина Т.С., Кринская А.В. // Вопросы медицинской химии. - 1974, 20 (6). С.660-663.

4. Изобретение. Гельцер Б.И. и соав. Способ комплексной оценки вазомоторной функции сосудистого эндотелия // RU 2209587 С2.

5. Изобретение. Шумилов С.П. Способ истощения калликреин-кининовой системы крови в эксперименте // RU 2077721 С1.

6. Яровая Г.А. // Вопросы медицинской химии. - 2001; 47 (1). С.20-42.

7. Hondhton J.L. et. al. // Am. J. Med. - 1997; 102: p.245-251.

8. Fava D. et. al. // Diabetic Medicine. - 2002; 19: p.752-757.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения эндотелиальной дисфункции. Исследуют вазодилятирующую способность сосудов путем проведения пробы с реактивной гиперемией и определяют уровень прекалликреина в сыворотке венозной крови с последующей оценкой функциональных возможностей эндотелия сосудов и резервного потенциала калликреин-кининовой системы (ККС). При повышении содержания прекалликреина в сыворотке крови относительно его уровня до функциональной пробы на 10-40% и увеличении эндотелийзависимой вазодилятации на 20-40% определяют отсутствие эндотелиальной дисфункции. При понижении содержания прекалликреина на 10-30% относительно исходного уровня и снижении величины эндотелийзависимой вазодилятации на 15-30% определяют наличие дисфункции эндотелия. Величину эндотелийзависимой вазодилятации сосудов исследуют с помощью доплерографии. Венозную кровь забирают из кубитальной вены. Способ позволяет выявить нарушения в функционировании эндотелия сосудов на ранних стадиях развития патологического процесса. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения эндотелиальной дисфункции, включающий исследование вазодилятирующей способности сосудов путем проведения пробы с реактивной гиперемией и определение уровня прекалликреина в сыворотке венозной крови с последующей оценкой функциональных возможностей эндотелия сосудов и резервного потенциала калликреин-кининовой системы (ККС) и при повышении содержания прекалликреина в сыворотке крови относительно его уровня до функциональной пробы на 10-40% и увеличении эндотелий-зависимой вазодилятации на 20-40% определяют отсутствие эндотелиальной дисфункции, а при понижении содержания прекалликреина на 10-30% относительно исходного уровня и снижении величины эндотелий-зависимой вазодилятации на 15-30% определяют наличие дисфункции эндотелия.2. Способ по п.1, в котором величину эндотелий-зависимой вазодилятации сосудов исследуют с помощью допплерографии.3. Способ по п.1, в котором венозную кровь забирают из кубитальной вены.