АНТИВИРУСНОЕ ВЕЩЕСТВО Российский патент 2006 года по МПК A61K35/64 A61P31/12 

Настоящее изобретение относится к фармакологически активным веществам природного происхождения и может быть использовано для получения антивирусных лекарственных средств и лечения вирусных инфекций.

Известны фармацевтические препараты, содержащие комплекс экстрактивных веществ животных или растительных тканей и применяемые для лечения вирусных инфекций путем стимуляции иммунной системы и прямого воздействия на вирионы или зараженные вирусом клетки.

Известен процесс получения из CD4-позитивных Т-лимфоцитов и клеток костного мозга белков, подавляющих развитие вируса иммунодефицита человека (пат. US 5480782).

Известно наружное средство, содержащее экстракт растения Ginkgo biloba и обладающее антивирусной и антибактериальной активностью (Пат. DE 4334600 А1).

Патент WO 81/03124 описывает полипептидную фракцию, выделенную из моллюска Mytilus edulis и активную в отношении различных вирусов, бактерий и простейших.

Известны антивирусные препараты растительного происхождения, механизм действия которых основан на инактивации свободных вирусных частиц, блокировании их транспорта через клеточную мембрану или подавлении репликации вируса в клетке-хозяине (Ершов Ф.И., Антивирусные препараты, Москва, Медицина, 1998).

Известна многокомпонентная композиция, выделенная из тканей насекомого Calliphora vicina Robineau-Desvoidy (Diptera, Calliphoridae) и обладающая антивирусной активностью (Пат. US 6337093). Из состава данной композиции выделен пептид аллоферон с антивирусной и противоопухолевой активностью (пат. RU 2172322). Антивирусная активность указанной композиции и ее действующего вещества аллоферона обусловлена иммуномодулирующими свойствами: способностью индуцировать синтез интерферона и усиливать цитотоксическую активность естественных киллеров (Chernysh et al. Antiviral and antitumor peptides from insects // PNAS, 2002, 99, p.12628-12632). В то же время ни указанная композиция, ни аллоферон не оказывают прямого защитного действия на клетки, подвергнутые вирусной инфекции.

Указанная композиция и ее действующее вещество аллоферон являются единственными антивирусными препаратами из насекомых, известными в настоящее время. По этому признаку они являются наиболее близкими аналогами настоящего изобретения.

Перечисленные выше и аналогичные им фармацевтические препараты природного происхождения увеличивают арсенал антивирусных лекарственных средств. Однако известные препараты не покрывают существующую потребность, в связи с чем вирусные инфекции остаются одной из наиболее опасных и трудноизлечимых групп заболеваний человека и животных.

В задачу настоящего изобретения входит расширение арсенала антивирусных лекарственных средств.

Сущность изобретения

В процессе создания настоящего изобретения установлено, что гемолимфа различных насекомых содержит экстрактивные вещества, введение которых в культуру клеток млекопитающих увеличивает устойчивость последних к вирусной инфекции. Дальнейшие систематические исследования крылатых насекомых (подкласс Pterigota класса Insecta) позволили выявить наличие аналогичной антивирусной активности в отдельных таксономических группировках ранга видов, родов, семейств и отрядов. В результате была разработана методология поиска антивирусных лекарственных средств, содержащихся в тканях насекомых, и определены на ее основе виды и группы более высокого ранга, наиболее перспективные в качестве источника антивирусных веществ.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является новая группа антивирусных средств - антивирусные препараты прямого действия, получаемые путем экстракции тканей насекомых, в частности представителей отрядов Odonata (стрекозы), Mantoptera (богомолы), Hemiptera (полужесткокрылые), Coleoptera (жуки), Diptera (двукрылые), Mecoptera (скоропионницы) или Lepidoptera (бабочки). Под препаратами прямого действия в данном случае понимаются индивидуальные вещества или их смеси, увеличивающие устойчивость клеток организма к вирусной инфекции путем разрушения вируса, блокирования его репликации или иным способом, который может осуществляться без участия иммунной системы. Отличительной особенностью и родовым признаком таких препаратов служит повышение устойчивости клеток-мишеней к вирусной атаке вне организма (in vitro), например, при введении препарата в культуральную среду с клетками. Антонимом препаратов прямого действия в контексте настоящего изобретения являются иммуномодуляторы, фармакологическая активность которых основана на стимуляции антивирусного иммунного ответа организма. Понятно, что некоторые метаболиты насекомых могут сочетать свойства антивирусного препарата прямого и иммуномодулирующего механизма действия. Последнее обстоятельство не должно препятствовать их включению в заявляемую группу лекарственных средств, если терапевтическая эффективность этих веществ полностью или частично обусловлена механизмом прямого антивирусного действия.

Способ получения заявляемых антивирусных веществ описан в примере 1 настоящей заявки. Понятно, что те же антивирусные вещества могут быть выделены из гемолимфы насекомых другими способами, технически эквивалентными описанному. Например, те же антивирусные вещества могут быть получены без процедуры активации иммунной системы у тех насекомых, у которых их синтез происходит конститутивно, в отсутствие внешнего воздействия. Очевидно также, что процесс активации может осуществляться различными способами, поскольку иммунный ответ у насекомых является неспецифическим и не связан с распознаванием определенных антигенов. Поэтому для иммунизации могут быть использованы различные микроорганизмы, живые или убитые, с одинаковым или сходным результатом. Пути введения микробных антигенов также могут быть различными. В свою очередь, дальнейшая обработка гемолимфы может производиться различными технически эквивалентными способами. Например, вместо центрифугирования можно использовать те или иные варианты фильтрации, хроматографическое разделение может осуществляться при помощи различных сорбентов, например, С4 или С8 силикагелей, и растворителей, на колонках, мембранах и других хроматографических носителях различной конструкции. Все эти варианты осуществления изобретения являются очевидными и не меняют его технического уровня и изобретательского замысла.

Понятно также, что антивирусные вещества, первоначально выделенные из тканей указанных насекомых, могут быть воспроизведены путем химического или биологического синтеза и использованы в таком или модифицированном виде в качестве лекарственных средств. Модификации базовой структуры могут преследовать цели увеличения стабильности, биодоступности, антивирусной активности, снижения токсичности или иных побочных эффектов препарата. Полученные индивидуальные вещества и их смеси могут использоваться в составе фармацевтических композиций, а также в комбинации с другими антивирусными средствами.

Указанную совокупность антивирусных веществ прямого действия, выделяемых из тканей различных насекомых, предлагается обозначать терминов энтовироны ("энто-" от греческого "энтомон" - насекомое и "-вирон" от латинского "вирус").

С целью изучения распределения энтовиронов в пределах класса насекомых были исследованы по единой методике препараты гемолимфы 31 вида насекомых:

Отряд Mantoptera: Iris polystictica

Отряд Hemiptera: Aphrophora salicina

Отряд Coleoptera: Pseudophonus rufipes, Acanthocinuss aedilis, Nicrophorus vespillo

Отряд Hymenoptera: Athalia colibri

Отряд Diptera: Delia brassicae, Epysyrphus balteatus, Stratiomys singularior, Gasterophilus veterinus, Lunatipula sublunata

Отряд Mecoptera: Panorpa communis

Отряд Lepidoptera: Mamestra persicaria, Diachrysia chrysitis, Operophtera brumata, Dendrolimus sibiricus, Lasiocampa trifoli, Axylia putris, Notodonta dromedarius. Sphinx ligustri, Ephestia kuhniella, Tortrix viridana

Отряд Odonata: Aeschna cyanea, Aeschna grandis, Libellula quadrimaculata, Somatochlora metallica

Присутствие энтовиронов установлено в образцах 26 видов, относящихся ко всем исследованным отрядам насекомых (Таблица 1). Исследованные отряды, как показано на чертеже, относятся к двум главным ветвям эволюции подкласса Pterigota (крылатые насекомые): Palaeoptera (древнекрылые) и Neoptera (новокрылые). На этом основании энтовироны можно считать характерной особенностью подкласса Pterigota в целом. Этот вывод подтверждается тем обстоятельством, что энтовироны обнаружены во всех подразделениях группы Neoptera, включающих Polyneoptera, Paraneoptera и Oligoneoptera, а также во всех подразделениях наиболее многочисленной группы Oligoneoptera, а именно Neuropteroidea, Hymenopteroidea и Mecopteroidea. Представители подкласса Apterigota в исследовании не участвовали в связи с техническими трудностями получения образцов гемолимфы. Поэтому формула настоящего изобретения ограничена представителями подкласса Pterigota.

Хотя энтовироны широко распространены среди насекомых, активность их существенно различается у представителей различных группировок. Наибольшей активностью отличаются энтовироны представителей отряда Odonata (стрекозы), в частности стрекоз семейства Aeschnidae, таких как Aeschna grandis и Aeschna cyanea, а также семейства Libellulidae, в частности Libellula quadrimaculata и Somatochlora metallica. Другая группа с повышенной активностью энтовиронов относится к отряду Lepidoptera, в частности к семейству Noctuidae, представленному видами Diachrysia chrysitis и Mamestra persicaria семейства, а также семейству Geometridae на примере Operophtera brumata. Кроме того, высокий уровень активности энтовиронов характерен для некоторых представителей отрядов Coleoptera (Pseudophonus rufipes, Carabidae) и Diptera (Stratiomys singularior, Stratiomyidae). Представители перечисленных выше видов, семейств и отрядов особенно полезны в качестве источника получения энтовиронов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Выделение энтовиронов из гемолимфы насекомых

Исходный биологический материал для постановки опытов (личинок насекомых определенного вида и стадии развития) получали из природных популяций, определяли видовую принадлежность и содержали в лабораторных условиях при комнатной температуре и естественной влажности. Иммунную систему личинок активировали путем прокола кутикулы иглой, смоченной суспензией убитых нагреванием (1 мин на кипящей водяной бане) клеток бактерий Escherichia coli и Micrococcus luteus (10⁹/мл клеток каждого вида). Иммунизированных таким образом личинок инкубировали в течение суток при комнатной температуре. По истечении этого срока поверхность личинок стерилизовали 70%-ным этанолом, промывали личинок в стерильной дистиллированной воде и подсушивали на фильтровальной бумаге. Гемолимфу личинок собирали через разрез кутикулы в охлажденные на льду пробирки с добавлением апротинина и фенилтиомочевины для подавления протеолитической и фенолоксидазной активности гемолимфы, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили до использования при -20°С.

Размороженную гемолимфу центрифугировали 10 мин при 4000 G, супернатант подкисляли трифторуксусной кислотой до конечной концентрации кислоты 0.05% (v/v) и наносили на колонку Sep-Pak с сорбентом C₁₈ (фирма Waters) из расчета 3 мл гемолимфы на 1 г сорбента. Гидрофильные компоненты гемолимфы удаляли, промывая колонку 0.05%-ной трифторуксусной кислотой. Затем сорбированные на колонке гидрофобные компоненты элюировали 50%-ным ацетонитрилом в 0.05%-ной трифторуксусной кислоте. Полученную в результате элюции ацетонитрилом смесь гидрофобных компонентов лиофилизировали и использовали для определения антивирусной активности.

Пример 2. Антивирусная активность энтовиронов, выделенных из гемолимфы насекомых.

Антивирусную активность определяли в системе in vitro, обычно используемой для определения антивирусной активности интерферонов (Chemysh et al. Antiviral and antitumor peptides from insects // PNAS, 2002, 99, p.12628-12632). Культуру клеток человека L 41 выращивали в лунках 96-луночных планшетов до образования монослоя клеток на дне лунки. Затем в лунку вносили тестируемый препарат и одновременно вирус везикулярного стоматита (VSV, штамм Индиана) в дозе 100 ЦПД₅₀ (цитопатическая доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя). В контрольные лунки вносили эквивалентное количество растворителя. Зараженную вирусом культуру инкубировали 18 часов при 37°С, затем клетки окрашивали 0.1% раствором красителя "кристаллический фиолетовый". Долю погибших клеток определяли путем последующей экстракции красителя и определения его оптической плотности при 590 нм. Критерием активности энтовиронов служило увеличение доли выживших клеток монослоя по сравнению с контролем. Результат признавался положительным при уровне достоверности различий между опытом и контролем Р<0.01 по критерию Стьюдента.

Результаты изучения антивирусной активности препаратов гемолимфы 26 видов насекомых представлены в Таблице 1. Как видно из чертежа, содержащие энтовироны образцы относятся к 8 отрядам, представляющим всем подразделения крылатых насекомых (Pterigota): Palaeoptera и Neoptera, Polyneoptera, Paraneoptera и Oligoneoptera, Neuropteroidea, Hymenopteroidea и Mecopteroidea. На этом основании энтовироны следует считать характерным компонентом гемолимфы класса насекомых в целом.

Среди исследованных образцов выделяются высоким уровнем активности энтовиронов четыре кластера, относящихся к определенным отрядам и семействам. Прежде всего это образцы, полученные из гемолимфы стрекоз (отряд Odonata), представленных семействами Aeschnidae и Libellulidae на примере Aeschna grandis и Libellula quadrimaculata, соответственно. Второй кластер относится к отряду жуки (Coleoptera), представленному семейством Carabidae на примере Pseudophonus rufipes. Третий кластер образуют препараты гемолимфы бабочек (Lepidoptera), представленные семейством Noctuidae на примере совок Diachrysia chrysitis и Mamestra persicaria, а также семейством Geometridae на примере пяденицы Operophtera brumata. Наконец, четвертый кластер относится к отряду двукрылых (Diptera), представленному семейством Stratiomyidae на примере Stratiomys singularior.

Перечисленные виды, семейства и отряды являются особенно полезными в качестве источника получения энтовиронов.

Изобретение относится к биофармакологии, медицине. Антивирусное вещество на основе гемолимфы насекомых подкласса Pterigota характеризуется тем, что получено путем активации иммунной системы насекомых, сбора гемолимфы и дальнейшей обработки полученной гемолимфы центрифугированием, хроматографией супернатанта, элюированием сорбированных на колонке гидрофобных компонентов, полученный элюат содержит смесь гидрофобных компонентов, обладающих антивирусной активностью. Изобретение обеспечивает прямое антивирусное действие и увеличивает устойчивость клеток организма к вирусной инфекции путем разрушения вируса или блокирования его репликации или иным способом. 40 з.п.ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Антивирусное вещество на основе гемолимфы насекомых подкласса Pterigota, отличающееся тем, что оно получено путем активации иммунной системы насекомых, сбора гемолимфы и дальнейшей обработки полученной гемолимфы центрифугированием, хроматографией супернатанта, элюированием сорбированных на колонке гидрофобных компонентов, полученный элюат содержит смесь гидрофобных компонентов, обладающих антивирусной активностью.2. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что иммунную систему активируют путем прокола кутикулы иглой, смоченной суспензией убитых нагреванием клеток бактерий, например, Escherichia coli или Micrococcus luteus.3. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что хроматографию супернатанта проводят на колонке с сорбентом С18 путем элюирования сорбированных на колонке гидрофобных компонентов 50%-ным ацетонитрилом.4. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Odonata.5. Антивирусное вещество по п.2, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Odonata используют виды семейства Aeschnidae.6. Антивирусное вещество по п.3, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Aeschnidae используют стрекоз рода Aeschna.7. Антивирусное вещество по п.2, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Odonata используют виды семейства Libellulidae.8. Антивирусное вещество по п.5, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Libellulidae исползуют стрекоз рода Libellula.9. Антивирусное вещество по п.5, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Libellulidae используют стрекоз рода Somatochlora.10. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Mantoptera.11. Антивирусное вещество по п.8, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Mantoptera используют богомолов рода Iris.12. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Hemiptera.13. Антивирусное вещество по п.10, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Hemiptera используют пенниц рода Aphrophora.14. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Mecoptera.15. Антивирусное вещество по п.12, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Mecoptera используют скорпионниц рода Panorpa.16. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Hymenoptera.17. Антивирусное вещество по п.14, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Hymenoptera используют пилильщиков рода Athalia.18. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Coleoptera.19. Антивирусное вещество по п.16, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Coleoptera используют виды семейства Carabidae.20. Антивирусное вещество по п.17, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Carabidae используют жужелиц рода Pseudophonus.21. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Diptera.22. Антивирусное вещество по п.19, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Diptera используют виды семейства Stratiomyidae.23. Антивирусное вещество по п.20, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Stratiomyidae используют львинок рода Stratiomys.24. Антивирусное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Lepidoptera.25. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Noctuidae.26. Антивирусное вещество по п.23, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Noctuidae используют совок рода Mamestra.27. Антивирусное вещество по п.23, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Noctuidae используют совок рода Diachrisia.28. Антивирусное вещество по п.23, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Noctuidae используют совок рода Axylia.29. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Geometridae.30. Антивирусное вещество по п.27, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Geometridae используют пядениц рода Operophtera.31. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Lasiocampidae.32. Антивирусное вещество по п.29, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Lasiocampidae используют шелкопрядов рода Dendrolimus.33. Антивирусное вещество по п.29, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Lasiocampidae используют шелкопрядов рода Lasiocampa.34. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Notodontidae.35. Антивирусное вещество по п.32, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Notodontidae используют хохлаток рода Notodonta.36. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Sphingidae.37. Антивирусное вещество по п.34, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Sphingidae используют бражников рода Sphinx.38. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Pyralydae.39. Антивирусное вещество по п.36, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Pyralydae используют огневок рода Ephestia.40. Антивирусное вещество по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Tortricidae.41. Антивирусное вещество по п.38, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Tortricidae используют листоверток рода Tortrix.