Способ разрушения и предотвращения образования бактериальных биопленок комплексом антимикробных пептидов насекомых Российский патент 2018 года по МПК A61K38/57 A61K35/64 A61P31/04 

Настоящее изобретение относится к областям медицины, гигиены, косметологии и ветеринарии и может быть использовано для разрушения патогенных биопленок, образуемых бактериями различных видов на коже и других поверхностях организма, поверхностях медицинских изделий, имплантатов и катетеров.

В медицине и ветеринарии используется большое разнообразие токсичных для бактерий антибиотиков и антисептиков, принадлежащих к различным классам органических соединений (бета-лактамы, макролиды, тетрациклины, флуороквинолоны, сульфонамиды, аминогликозиды, имидазолы, соединения пептидной природы, четвертичные соли аммония и др.). Большинство известных в настоящее время антибиотиков и антисептиков эффективны в отношении планктонных (свободно живущих) форм бактерий. Формируя биопленку (многоклеточное сообщество бактерий, окруженное матриксом и прикрепленное к внешним или внутренним поверхностям организма-хозяина или неживых предметов), бактерии приобретают резистентность к антибиотикам и антисептикам [1, 2], а также оказываются недоступными для уничтожения клетками иммунной системы [3]. Поэтому лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности [4, 5]. Известно, что биопленки вызывают порядка 80% бактериальных инфекций человека [6], разнообразные воспалительные и связанные с ними аутоиммунные и онкологические заболевания, поражения сердечно-сосудистой системы. Благодаря этому биопленки служат одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Высокая устойчивость биопленок к внешним воздействиям создает также проблемы для дезинфекции медицинских изделий, поддержания личной и профессиональной гигиены, лечения сельскохозяйственных и домашних животных. Соответственно, разработка методов разрушения бактериальных биопленок представляет одну из наиболее актуальных задач современной медицины, ветеринарии и смежных областей здравоохранения.

Одним из перспективных направлений решения этой задачи считается использование природных и синтетических антимикробных пептидов [6-9]. Однако практическая реализация этой идеи наталкивается на значительные трудности, связанные с недостаточной эффективностью и высокой стоимостью их использования, опасностью развития у бактерий перекрестной устойчивости к эндогенным антимикробным пептидам человека и животных и многими другими [10-12]. Для повышения эффективности лечения предлагается создавать комбинации антимикробных пептидов и обычных антибиотиков, в которых пептид и антибиотик проявляют синергическое действие на биопленки. В частности, предлагается использовать для лечения инфекций, вызываемых бактериальными биопленками, синтетические антимикробные пептиды в комбинации с антибиотиками различных групп [13]. С этой же целью предлагается использовать белок бактериофага лизин в комбинации с антибиотиками [14]. Этот способ разрушения биопленок (Заявка на изобретение RU 2014149348, 09.05.2013 «Способ предотвращения, разрушения и обработки биопленки лизином бактериофага») является наиболее близким к заявляемому изобретению техническим решением, принятым в качестве прототипа, в котором, в качестве синергиста антибиотиков используется пептидный (белковый) продукт биологического синтеза. Важно отметить, что в том и другом изобретении используется индивидуальное соединение пептидной природы (синтетический пептид [13] или природный белок [14]), а способ разрушения биопленки заключается в применении этого соединения в комбинации с определенным антибиотиком. Многокомпонентные комбинации с этой целью до сих пор не применялись в связи с технической сложностью их разработки и высокой стоимостью производства. Между тем, природные механизмы естественного иммунитета многоклеточных животных, как известно, включают сложные комплексы антимикробных пептидов. Это обеспечивает ряд ключевых преимуществ, отсутствующих у индивидуальных антимикробных пептидов и антибиотиков, в частности, препятствует развитию резистентности бактерий [16].

Технической задачей заявленного изобретения является разработка способа разрушения биопленок при помощи совместного или последовательного действия природных комплексов антимикробных пептидов и известных антибиотиков. Технический результат изобретения состоит в повышении эффективности лечения заболеваний человека и животных, вызываемых патогенными биопленками. Этот результат достигается за счет повышения чувствительности биопленок к антибиотикам под воздействием комплекса антимикробных пептидов, снижения терапевтически эффективной концентрации антибиотика и, соответственно, его токсичности для пациента. Для решения это задачи предлагается использовать очищенные природные комплексы антимикробных пептидов, синтезируемые культурами насекомых отряда Diptera. Получаемый препарат применяется совместно или последовательно с антибактериальным средством (или комбинацией антибактериальных средств), выбираемым из числа антибиотиков или антисептиков, токсичных для данного вида бактерий. При этом предпочтение отдается антибактериальным средствам, проявляющим эффект синергизма с комплексом антимикробных пептидов при тестировании in vitro на биопленках данного вида.

Сущность заявленного изобретения

Известны две основные жизненные формы, характерные для большинства бактерий: планктонная форма (свободно живущие клетки, обеспечивающие заражение организма-хозяина) и биопленка (прикрепленное к различным поверхностям многоклеточное сообщество одного и более видов микроорганизмов, погруженное в выделяемый ими матрикс). Находясь в составе биопленки, колония бактерий может неограниченно долго персистировать в организме хозяина, образуя по мере необходимости планктонные клетки, распространяющие инфекцию за пределы первичного очага [1-5].

Основным средством лечения бактериальных инфекций, включая биопленки, являются антибиотики. Однако, как уже было сказано выше, большинство антибиотиков обладают низкой или нулевой активностью в отношении биопленок по сравнению с планктонной формой того же штамма. Широкое распространение штаммов с генетически обусловленной резистентностью к антибиотикам в еще большей степени сужает возможности терапии биопленочных инфекций. В литературе предлагается использовать для решения этой проблемы антимикробные пептиды в качестве синергистов, усиливающих антибиопленочную активность антибиотиков [6-9, 13, 14]. Существующие в настоящее время методы оценки синергических эффектов (метод «checkerboard») позволяют разрабатывать главным образом бинарные комбинации (1 пептид + 1 антибиотик). Это существенно ограничивает возможности доступных в настоящее время способов разрушения бактериальных биопленок. В частности, такие комбинации обладают узким спектром терапевтической эффективности. Так, использование лизина бактериофага [14] применимо лишь в отношении биопленки, образуемой грамположительными бактериями типа Staphylococcus aureus и неэффективно в отношении грамотрицательных бактерий.

Заявленный способ разрушения биопленок, как и известные способы, основан на использовании эффекта синергизма антимикробных пептидов и антибиотиков. Основное отличие состоит в том, что вместо индивидуального антимикробного пептида (например, синтетического катионного пептида [13] или лизина бактериофага [14]) в качестве синергиста антибиотиков предлагается использовать очищенный комплекс антимикробных пептидов насекомых отряда Diptera. Эта идея основана на исследованиях авторов изобретения в области иммунологии насекомых, в особенности личинок мясной мухи Calliphora vicina. Авторами установлено, что личинки этого вида в ответ на заражение бактериями одновременно синтезируют и накапливают в гемолимфе комплекс антимикробных пептидов, в состав которого входят дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды [15, 16]. Одни из этих пептидов избирательно повреждают клеточную стенку грамположительных (дефензины) или грамотрицательных (диптерицины, цекропины) бактерий, другие нарушают синтез белков и РНК в бактериальной клетке (пролин-богатые пептиды). Все четыре класса характерны для иммунной системы насекомых отряда Diptera [15]. Соответственно, комплексы антимикробных пептидов, получаемые из различных видов отряда Diptera, могут использоваться для осуществления заявляемого изобретения, как показывают результаты апробации в режиме реального времени, приведенные в примерах 1 и 2. Помимо С.vicina, с этой целью можно использовать такие виды как С.vomitoria, Lucilia sericata, L. caesar (Diptera, Calliphoridae), Musca domestica (Diptera, Muscidae), Hermetia illucense (Diptera, Stratiomyidae). Эти виды объединяет та особенность, что все они, как и С.vicina, относятся к числу синантропных двукрылых-сапрофагов, обитающих в средах, максимально насыщенных патогенной микрофлорой человека, сельскохозяйственных и домашних животных. Поэтому антимикробные комплексы синантропных сапрофагов проявляют высокую активность именно в отношении микрофлоры этого типа [15-16]. Особенности экологии С.vicina и других перечисленных выше видов насекомых-сапрофагов отряда Diptera позволяют культивировать их в промышленных масштабах на дешевых кормовых субстратах, что делает биосинтез заявляемого антимикробного комплекса технически и экономически реализуемым.

Уникальной особенностью комплекса антимикробных пептидов насекомых на примере С.vicina является сложность его состава. Результаты проведенных исследований, суммированные в примере 3, показывают, что в состав комплекса входят не менее 11 индивидуальных антимикробных пептидов, участвующих в иммунном ответе этого насекомого. Это обстоятельство делает С.vicina и родственные виды отряда Diptera особенно перспективными объектами для реализации заявляемого способа разрушения и предупреждения образования биопленок. Однако эволюционный консерватизм механизмов естественного иммунитета позволяет предположить, что для реализации заявленного способа могут быть использованы и комплексы антимикробных пептидов других организмов.

Известно, что комплекс антимикробных пептидов С.vicina способен разрушать биопленки, образуемые различными видами бактерий, однако для этого требуется создание высоких концентраций комплекса (от 1.5 до 7.6 г/л в зависимости от вида бактерий) [18]. Это обстоятельство существенно ограничивает возможности применения комплекса в медицине и других областях. Теоретически данное ограничение может быть устранено за счет комбинирования природного комплекса антимикробных пептидов и антибиотиков или антисептиков, образующих с ним синергическую пару. Однако данное предположение в литературе ранее не рассматривалось и не подвергалось экспериментальному изучению. Соответственно, поэтому неизвестны способы разрушения бактериальных биопленок, основанные на использовании комплекса антимикробных пептидов насекомых отряда Diptera в сочетании с другими антибактериальными средствами. Такая задача была впервые поставлена и реализована авторами настоящего изобретения. Результаты соответствующих экспериментальных исследований приведены в конкретных примерах реализации.

С этой целью авторами были проведены исследования антибиопленочной активности комплекса антимикробных пептидов (сокращенно КАМП) С.vicina в сочетании с антибиотиками из групп аминогликозидов, бета-лактамов, гликопептидов, макролидов, линкозамидов, флюороквинолонов, амфениколов и тетрациклинов, а также антисептиков из группы четвертичных солей аммония. Подробное описание экспериментов приведено в примерах 4-5. Основным методом исследования был анализ взаимодействия различных антибактериальных средств в системе in vitro, широко используемый при проведении аналогичных исследований (метод «checkerboard»). В качестве биологической модели использованы резистентные к антибиотикам биопленки, формируемые бактериями Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa. Биопленки, образуемые этими бактериями, вызывают большинство клинически значимых бактериальных инфекций. Данные по влиянию комплекса антимикробных пептидов на антибиопленочную активность антибиотиков и антисептиков суммированы в Таблице 1. Количественным критерием антибиопленочной активности служила величина МБИК₉₀ (концентрация антибиотика, ингибирующая метаболическую активность биопленки на 90% в стандартном ТТС тесте).

Среди исследуемых 20 вариантов комбинаций КАМП и антибактериальных средств различных классов 8 комбинаций проявили аддитивный эффект (FICI>0.5), а 11 комбинаций - синергический (FICI<0.5). Лишь в одном случае (полимиксин В на биопленке Е. coli) не отмечено потенцирование действия антибиотика. Тот и другой тип взаимодействия позволяет более эффективно разрушать биопленку и снижать терапевтически эффективную концентрацию антибиотика. Полученные результаты экспериментальных исследований наглядно демонстрируют, обосновывают и подтверждают 14 зависимых пунктов от независимого п. 1 формулы изобретения заявленного способа разрушения биопленок. В зависимости от типа биопленки следует выделить несколько наиболее перспективных вариантов осуществления изобретения.

Так, биопленка золотистого стафилококка S. aureus оказалась совершенно нечувствительна к действию бета-лактама меропенема, аминогликозидов амикацина и канамицина (МБИК90>500 мкг/мл), линкозамида клиндамицина (МБИК90>250 мкг/мл). В присутствии КАМП эти антибиотики проявляют высокую антибиопленочную активность (МБИК90<0.1, 1.5, 3 и 12 мкг/мл, соответственно). Следовательно, заявленное изобретение позволяет использовать эти антибиотики для лечения наиболее распространенной группы бактериальных инфекций - биопленок S. aureus. Расширение арсенала антибиотиков для лечения этой группы инфекций имеет особенно важное значение в случае заражения особо опасными метициллин-устойчивыми (MRSA) и ванкомицин-устойчивыми (VRSA) формами S. aureus. Согласно полученным данным, для разрушения биопленок MRSA перспективна комбинация КАМП + аминогликозиды, в случае VRSA инфекции - КАМП + линкозамиды. Часть использованных при апробации антибиотиков, токсичных для планктонных клеток S. aureus, сохраняет активность и в отношении биопленок этого вида, если применяется в повышенных концентрациях. В этой группе следует выделить ванкомицин и ампициллин, для которых КАМП служит мощным синергистом, позволяя снизить подавляющую биопленку S. aureus концентрацию с 38-24 до 1 и менее мкг/мл. Целесообразность применения комбинаций КАМП с этими антибиотиками для подавления биопленок S. aureus представляется очевидной. Следует отметить, что и более низкие значения коэффициента усиления (К_у<10) могут обеспечить существенное улучшение лечения биопленки S. aureus.

Так, антисептик хлорид бензалкония, применяемый для дезинфекции раневой поверхности, как и другие антисептики, отличается высокой токсичностью. Возможность снизить его концентрацию в 8 раз при сохранении антибиопленочной активности позволяет снизить токсическое действие на окружающие рану ткани и улучшить тем самым схему лечения раневых инфекций.

Биопленка, образуемая другим распространенным патогеном - кишечной палочкой Е. coli - проявляет относительную (хотя и сниженную по сравнению с планктонными клетками этой бактерии) чувствительность ко всем изученным антибиотикам. В этих условиях комбинирование с КАМП обеспечивает потенцирование действия всех исследованных антибиотиков. Однако следует отметить особенно высокий уровень синергизма КАМП с бета-лактамами меропенемом и цефотаксимом (снижение эффективной концентрации более чем в 187 и 62 раза, соответственно). По этому показателю комбинация КАМП с меропенемом и другими бета-лактамами представляется особенно перспективной. Комбинация КАМП с меропенемом демонстрирует также синергическое действие в отношении биопленок, образуемых другими распространенными патогенами P. aeruginosa и A. baumannii.

Комбинирование КАМП с антибиотиками позволяет также обеспечить другой технически важный результат, а именно снижение эффективной концентрации КАМП. Для разрушения биопленки S. aureus наилучший с этой точки зрения результат дает сочетание КАМП с амикацином (снижение эффективной концентрации КАМП более чем в 48 раз), а также ванкомицином, канамицином и тетрациклином (снижение от 16 до более чем 24 раз). В отношении биопленок, формируемых другими изученными бактериями (Е. coli, P. aeruginosa, K. pneumonia, A. baumannii), сочетание с антибиотиками различных классов также позволяет снизить эффективную концентрацию КАМП от 2 до более чем 43 раз в зависимости от вида бактерии и типа антибиотика.

Помимо разрушения зрелых биопленок, заявляемый способ обеспечивает еще один технически важный результат - уничтожение свободноживущих (планктонных) клеток бактерий и, соответственно, предотвращение формирования ими биопленок (пример 6). Синергическое или аддитивное действие КАМП и антибиотиков на планктонные культуры при проведении профилактических мероприятий позволяет значительно снизить терапевтически эффективную концентрацию антибиотика, необходимую для предотвращения образования биопленки, и таким образом избежать неблагоприятных последствий, связанных с применением высоких доз антибиотика.

Следует отметить, что комплекс антимикробных пептидов и антибиотик могут входить в состав одной фармацевтической композиции и наноситься на поверхность биопленки одновременно. Вместо этого антибиотик может вводиться в организм независимо от препарата, содержащего комплекс антимикробных пептидов, парентерально, перорально или любым другим принятым в медицине способом, обеспечивающим контакт антибиотика с разрушаемой биопленкой.

Заявленный способ может быть также реализован путем введения комплекса антимикробных пептидов насекомых в состав различных медицинских изделий (раневые и противоожоговые покрытия, катетеры, имплантаты и т.д.) с целью разрушения и предупреждения образования патогенных биопленок.

Кроме того, заявленный способ может быть реализован путем введения комплекса антимикробных пептидов насекомых в состав косметических средств для ухода за кожей с целью профилактики повреждений, связанных с образованием биопленок.

Очевидно также, что предлагаемый способ может применяться в ветеринарии для лечения бактериальных инфекций животных аналогичных заболеваниям человека.

В целом, заявленный способ позволяют комплексно значительно расширить арсенал методов, применяемых в медицине и смежных областях для лечения бактериальных инфекций, и повысить его эффективность. Основные преимущества заявленного способа состоят в следующем:

1. Возможность создания многокомпонентных композиций за счет использования природных комплексов антимикробных пептидов. В качестве такого комплекса возможно использование комбинации антимикробных пептидов насекомых отряда Diptera, содержащей четыре различных класса пептидов (дефензины, цекропины, диптерицины, пролин-богатые пептиды), каждый из которых представлен несколькими различными формами. Известные в настоящее время способы разрушения биопленок ограничены схемой один пептид плюс один антибиотик, характеризующейся узким спектром антибактериальной активности и повышенным риском появления лекарственной устойчивости у бактерий.

2. Возможность снижения концентрации антибиотика, необходимой для разрушения биопленки, за счет потенцирующего (синергического или аддитивного) действия комплекса антимикробных пептидов насекомых. Это позволяет снизить терапевтическую дозу антибиотика и, соответственно, риск развития побочных эффектов его применения

3. Расширение арсенала антибиотиков, применимых для разрушения биопленок. В частности, результаты научных исследований и конкретных примеров апробации показали, что в присутствии КАМП проявляют антибиопленочную активность бета-лактамные антибиотики и аминогликозиды - две ключевые группы антибиотиков, которые в настоящее время считаются малопригодными для лечения биопленочных инфекций. Это новое и перспективное направление ислледований.

4. Изменение пути введения антибиотика. В настоящее время большинство антибиотиков применяются системно путем парентерального или перорального введения. Местное применение антибиотиков ограничено недостаточной клинической эффективностью. При системном введении для создания необходимой концентрации в очаге инфекции используются большие дозы антибиотиков, вызывающие гибель нормальной микрофлоры пациента и риск других нежелательных явлений (нефротоксичность, нейротоксичность, кардиотоксичность и т.д.). Заявляемый способ позволяет повысить эффективность антибиотика при введении непосредственно в очаг инфекции (например, путем нанесения на поверхность биопленки) и таким образом в ряде ситуаций, подтвержденных экспериментально, может устранить необходимость его системного применения.

5. Изученные антибиотики в свою очередь потенцируют антибиопленочное действие комплекса антимикробных пептидов насекомых, позволяя снизить его терапевтически эффективную концентрацию и расширить возможную область применения.

6. В настоящее время экспериментально обоснованы с подтверждением полученных положительных результатов 19 сочетаний КАМП и антибиотиков. Не вызывает сомнения, что в дальнейшем этот список будет в ходе дальнейших научных исследований и экспериментальных исследований значительно расширен. Заявленный способ позволяет также варьировать соотношение терапевтических доз и путей введения КАМП и антибиотика.

7. Резюмируя изложенное, заявленный способ позволяет существенно и резко расширить возможности персонализированной терапии бактериальных инфекций с учетом особенностей пациента и характера заболевания.

Результаты многочисленных апробаций подтверждены конкретными примерами реализации, приведенными ниже.

Пример 1

Получение препаратов, содержащих очищенный комплекс антимикробных пептидов насекомых отряда Diptera и анализ их антибактериальной активности.

Методика получения препарата соответствовала описанной ранее процедуре [16]. Для этого использовали личинок четырех видов насекомых отряда Diptera, включая три вида мясных мух семейства Calliphoridae Calliphora vicina, С. vomitoria и Lucilia sericata и комнатную муху Musca domestica семейства Muscidae. Процедура получения препарата состояла в следующем. Личинок иммунизировали путем введения в полость тела суспензии бактериальных клеток и инкубировали в течении 24 часов. По истечению этого срока у личинок собирали гемолимфу через разрез кутикулы и использовали ее для выделения комплекса антимикробных пептидов. Для этого собранную гемолимфу подкисляли 0.1%-ной трифторуксусной кислотой (ТФУ) и удаляли нерастворимый осадок центрифугированием. Полученную надосадочную жидкость наносили на предварительно стабилизированную 0.05% ТФУ колонку с С-18 сорбентом (Waters, 35 СС SepPack cartridge), промывали 0.05% ТФУ и элюировали 50% ацетонитрилом / 0.05% ТФУ. Элюат подвергали лиофильной сушке и использовали в данном и последующих примерах в качестве очищенного комплекса антимикробных пептидов. Антибактериальную активности комплекса определяли при помощи метода серийных разведений [19]. Средние для трех независимых измерений значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для планктонной культуры Е. coli 774.1 представлены в Таблице 2. Все четыре комплекса проявляли выраженную антибактериальную активность. При этом максимальная активность обнаружена у комплекса С.vicina. Данный препарат выбран для дальнейшим исследований в качестве наилучшего варианта осуществления изобретения.

Пример 2

Антибактериальная активность препарата из Hermetia illucens

Препарат, содержащий комплекс антимикробных пептидов Н. Illucens, получали по методике описанной в примере 1. Антибатериальную активность комплекса определяли при помощи метода агаровых пластинок [19]. Для этого в стерильные чашки Петри (диаметр 9 см) заливали 7.5 мл питательной среды Luria-Bertany с агарозой (Invitrogen) (бактотриптон 1%, дрожжевой экстракт 0.5%, NaCl 1%). Перед застыванием в теплую среду вводили 2×10⁵ клеток планктонной культуры бактерий соответствующего штамма (Таблица 3). Тестируемый материал в объеме 2 μl наносили на поверхность застывшей среды. Чашки инкубировали 24 ч при +37°С и измеряли диаметр зоны ингибирования роста бактерий. В качестве контроля использовали препарат из С.vicina. Из данных Таблицы 3 видно, что препарат Н. Illucense, в отличие от препарата С.vicina, в условиях данного эксперимента проявлял активность в отношении P.aeruginosa. Следовательно, препарат Н. Illucense может иметь преимущество при лечении бактериальных инфекций, вызываемых данной бактерией.

Пример 3

Анализ состава комплекса антимикробных пептидов

Препарат, содержащий комплекс антимикробных пептидов С.vicina, был получен методом, описанным в примере 1. Состав антимикробных пептидов был изучен с использованием описанных ранее методов жидкостной хроматографии, масспектрометрии и транскриптомного анализа [18]. Установлена структура 11 пептидов, ответственных за антимикробную активность комплекса (Таблица 4). Из них 5 пептидов (Seq ID №№1, 2, 4, 9, 11) охарактеризованы ранее [18, 20], остальные 6 пептидов являются новыми для науки. Кроме того, в состав входят антимикробные пептиды с молекулярными массами от 6773 до 6973 дальтон, структура которых пока не расшифрована, и, вероятно, другие минорные компоненты с антимикробной активностью. В соответствии с классификацией, принятой в литературе [21, 22], активные соединения С.vicina принадлежат к четырем классам антимикробных пептидов насекомых: дефензинам (Seq ID №1), цекропинам (Seq ID №2, 3), диптерицинам (Seq ID №4-8) и пролин-богатым пептидам (Seq ID №9-11).

Пример 4

Разрушение сформированных патогенными бактериями биопленок при контактировании с КАМП С. vicina и антибиотиками различных классов. ТТС тест

В исследовании использовали штаммы Е. coli АТСС25922, S. aureus 203, P. aeruginosa АТСС 27583, К. pneumonia 145, A. baumannii 28. с повышенной способностью образовывать биопленки [18]. Методика получения биопленок соответствовала приведенной в этой публикации. Биопленки получали в пластиковых 96-луночных микропланшетах. В лунки планшета вносили по 100 мкл бактериальной суспензии с концентрацией клеток 5×10⁵ КОЕ/мл и инкубировали 24 ч при 37°C. В качестве отрицательного контроля использовали питательную среду LB (Invitrogen). Препарат КАМП С.vicina получали по протоколу, описанному примере 1. Для изучения типа взаимодействия комбинаций КАМП С.vicina и антибиотиков на биопленке был использован модифицированный метод перекрестного титрования. Для этого 24-часовую биопленку в микропланшете промывали трижды 200 мкл раствора PBS и подсушивали. В другом 96-луночном микропланшете готовили комбинации КАМП С.vicina и антибиотиков таким образом, что двукратные разведения препарата помещали в горизонтальные ряды лунок, а двукратные разведения антибиотиков - в вертикальные. Далее по 100 мкл содержимого каждой лунки из этого микропланшета переносили в микропланшет с биопленкой и инкубировали ее 24 ч при 37°C. Формирование биопленки оценивалось с помощью окрашивания ее хлоридом тетразолиума (ТТС). Для этого по 11 μl 0.2% раствора ТТС добавляли во все лунки планшета. После 1 ч инкубации при температуре 37°C OD₅₄₀ измеряли с помощью ридера микропланшетов Epoch (BioTek). Значение OD₅₄₀ 48-ч биопленки, на которую не действовали антимикробными препаратами, было взято в качестве контроля. Все эксперименты были выполнены в двух повторностях. Минимальная ингибирующая биопленку концентрация (МБИК) оценивалась как МБИК₉₀, то есть концентрация препарата, которая подавляла жизнеспособность 90% клеток. Индекс действия сочетаний антибиотиков FICI (fractional inhibitory concentration index) определяли для каждого ряда сочетаний двух антибиотиков по формуле: FICI=FICA+FICB, где FICA равен МИК антибиотика А в сочетании с другим антибиотиком, поделенному на МИК препарата А, взятого как монопрепарат и FICB равен МИК антибиотика В в сочетании с другим антибиотиком, поделенному на МИК препарата В, взятого как монопрепарат. FICI интерпретировали следующим образом: синергизм при FICI≤0.5, аддитивный эффект при FICI>0.5≤1, нет взаимодействия (индифферентность) при >1≤4 и антагонизм при FICI>4. Всего изучена антибиопленочная активность 1470 комбинаций КАМП и антибиотиков с использованием ТТС теста.

Результаты суммированы в Таблице 5. Эксперименты с S. aureus показали, что комбинирование с КАМП оказывает выраженное синергическое действие на антибиопленочную активность аминогликозидов амикацина и канамицина, бета-лактамов ампициллина и меропенема, гликопептида ванкомицина, макролида эритромицина, линкозамида клиндамицина, хлорамфеникола. Аддитивное действие КАМП оказывал на действие оксациллина и антисептика хлорида бензалкония. Таким образом, КАМП потенцирует действие всех изученных антибиотиков и антисептиков на биопленку S. aureus. В опытах с Е. coli установлено, что КАМП оказывает синергическое действие на разрушение биопленки этого типа меропенемом и цефотаксимом, аддитивное действие на эффективность гентамицина, ципрофлоксацина, хлорамфеникола и тетрациклина. Установлено также, что КАМП проявляет синергизм с меропенемом при разрушении биопленки, формируемой Р. aeruginosa и A. baumannii, и аддитивное действие на K. pneumonia. Среди всех изученных 15 антибиотиков и антисептиков 9 различных классов КАМП не оказывал потенцирующего действия только на эффективность полимиксина В.

Таким образом, КАМП является практически универсальным средством для повышения антибиопленочной активности антибиотиков. Заявленный способ разрушения биопленок комбинацией КАМП плюс антибиотик, может быть реализован в большом количестве сочетаний с учетом типа биопленки, порога снижения терапевтической дозы антибиотика и/или изменения способа его доставки к очагу инфекции.

Пример 5

Разрушение сформированных патогенными бактериями биопленок при контактировании с КАМП С.vicina и антибиотиками различных классов. КФ тест.

В этом примере взаимодействие КАМП С.vicina и антибиотиков исследовали, используя альтернативный метод анализа антибиопленочной активности - окрашивание биопленки кристальным фиолетовым (КФ тест). Метод анализа соответствовал описанному ранее [18]. В отличие от ТТС теста, оценивающего эффект по уровню снижения метаболической активности клеток, КФ позволяет оценить степень разрушения (толщину) биопленки по количеству связанного биопленкой красителя. Критерием эффективности служила минимальная ингибирующая концентрация КАМП, антибиотика или их различных комбинаций, которая уменьшает количество связанного КФ на 90% по сравнению с контролем (BIC₉₀). 24-часовые биопленки, выращенные в лунках 96-луночных планшетов трижды промывали 200 мкл стерильного раствора PBS и сушили на воздухе. Готовили стерильные серии двукратных разведений КАМП и антибиотиков в PBS, по 100 мкл каждой концентрации добавляли в соответствующие лунки и планшеты инкубировали 24 ч при 37°С.Затем остатки среды удаляли и промывали лунки трижды 200 мкл PBS, подсушивали на воздухе и окрашивали в течение 2 мин 0.1% водным раствором КФ (Ленреактив, Россия). Окрашенные биопленки промывали трижды 200 мкл PBS, подсушивали на воздухе и растворяли краситель в 200 мкл 95% этанола в течение 1 часа. Затем оптическую плотность раствора связанного биопленкой красителя измеряли при длине волны 570 нм на приборе Epoch reader (BioTek). Каждое измерение проводили в две независимые повторности. Полученные данные суммированы в Таблице 6. Как и в ТТС тесте (Таблица 5), комбинирование с КАМП усиливало активность антибиотиков в отношении биопленок всех изученных штаммов бактерий. При этом в 8 случаях установлен синергизм и в двух -аддитивный эффект. Выявленные в КФ и ТТС тестах оценки типов взаимодействия совпали во всех примерах апробации. Таким образом, данные КФ теста подтверждают сделанный на основании результатов ТТС теста вывод о том, что КАМП является универсальным средством потенцирования антибиопленочной активности антибиотиков. Сопоставление результатов КФ и ТТС тестов показывает также, что заявленный способ разрушения биопленок обеспечивает одновременно уничтожение бактериальных клеток и разрушение компонентов биопленки, включая матрикс. Последнее обстоятельство демонстрирует еще одно важное преимущество предлагаемого способа - возможность ускоренного удаления продуктов бактериального метаболизма и, соответственно, снижения воспалительных и аллергических реакций, сопровождающих биопленочные инфекции.

Пример 6

Предотвращение развития биопленок при контактировании планктонных форм бактерий с КАМП С.vicina и антибиотиками различных классов.

Биопленки формируются свободноживущими (планктонными) клетками бактерий, оседающими на поверхностях организма или неживых объектов. Уничтожение планктонных клеток в очаге инфекции представляет наиболее надежный способ предотвращения формирования биопленок. В настоящее время для этого используют антибиотики и антисептики. Целью экспериментов, рассмотренных в данном примере, было выяснение бактерицидного действия КАМП С.vicina, применяемого в комбинации с антибиотиками и антисептиками, на планктонные клетки патогенных бактерий. В экспериментах использованы штаммы Е. coli АТСС25922, S. aureus 203, P. aeruginosa АТСС 27583, K. pneumoniae 145, А. baumannii 28 с повышенной способностью образовывать биопленки [18]. Планктонные культуры получали путем инкубации клеток в течение ночи при температуре +37°C в жидкой питательной среде LB (Invitrogen). Для изучения типа взаимодействия комбинаций КАМП С.vicina и антибиотиков в планктонной культуре был использован метод перекрестного титрования. Для этого в 96-луночном микропланшете готовили комбинации КАМП С.vicina и антибиотиков в 50 мкл жидкой питательной среды таким образом, что двукратные разведения препарата помещали в горизонтальные ряды лунок, а двукратные разведения антибиотиков - в вертикальные. Далее вносили по 50 мкл бактериальной суспензии с концентрацией клеток 106 КОЕ/мл в каждую лунку с препаратами и инкубировали планшет 24 ч при 37°C. Рост клеток оценивался с помощью окрашивания хлоридом тетразолиума (ТТС). Для этого по 11 μl 0.2% раствора ТТС добавляли во все лунки планшета. После 1 ч инкубации при температуре 37°C OD540 измеряли с помощью ридера микропланшетов Epoch (BioTek). Значение OD540 48-ч суспензионной культуры, на которую не действовали антимикробными препаратами, было взято в качестве контроля. Все эксперименты были выполнены в две независимые повторности. Минимальная ингибирующая планктонную культуру концентрация (МИК) оценивалась как МИК90, то есть концентрация препарата, которая подавляла жизнеспособность 90% клеток.

Результаты суммированы в Таблице 7. Эксперименты с S. aureus показали, что комбинирование с КАМП оказывает выраженное синергическое действие на антибиотическую активность хлорамфеникола и тетрациклина. Аддитивное действие КАМП оказывал на действие амикацина, канамицина, ампициллина, меропенема, ванкомицина, эритромицина, клиндамицина и антисептика хлорида бензалкония. Таким образом, КАМП потенцирует действие почти всех изученных антибиотиков и антисептиков на планктонную культуру S. aureus. В опытах с Е. coli установлено, что КАМП оказывает синергическое действие на активность полимиксина и цефотаксима, аддитивное действие на эффективность ципрофлоксацина, хлорамфеникола и тетрациклина. Установлено также, что КАМП проявляет синергизм с меропенемом при подавлении роста планктонных клеток A. baumannii и аддитивное действие на S. aureus, P. aeruginosa и K. pneumoniae.

Таким образом, КАМП значительно усиливает бактерицидное действие всех изученных антибиотиков в отношении планктонных клеток бактерий.

Как показали результаты апробации, проведенные в режиме реального времени и в реальных условиях, заявленный способ позволяет предотвращать развитие биопленок на ранней стадии инфекционного процесса, предшествующей формированию зрелой биопленки, что имеет колоссальное научное и практическое значение для предотвращения, как было отмечено выше, излечения многих заболеваний.

Использованные источники информации

1. Hoiby N, Bjarnsholt Т, Givskov М, Molin S, Ciofu О. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 2010;35: 322-332. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011

2. Dufour D, Leung V, Levesque CM. Bacterial biofilm: structure, function, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 2012;22: 2-16. doi: 10.1111m / j 1601-1546.2012.00277

3. Leid JG. Bacterial biofilms resist key host defenses. Microbe. 2009;4(2): 66-70

4. Romling U, Balsalobre C. Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies (Review). J Intern Med. 2012;272: 541- 561. doi: 10.1111/joim.12004

5. Gupta P, Sarkar S, Das B, Bhattacharjee S, Tribedi P. Biofilm, pathogenesis and prevention - a journey to break the wall: a review. Arch Microbiol. 2015; 198(1): 1-15. doi 10.1007/s00203-015-l 148-6

6. Pletzer D, Coleman SR, Hancock RE. Anti-biofilm peptides as a new weapon in antimicrobial warfare. Curr Opin in Microbiol. 2016;33: 35-40. doi: 10.1016/j.mib.2016.05.016

7. Luca M, Maccari G, Nifosi R. Treatment of microbial biofilms in the post-antibiotic era: prophylactic and therapeutic use of antimicrobial peptides and their design by bioinformatics tools. Pathog Dis. 2014;70: 257-270. doi: 10.1111/2049-632X.12151

8. Strempel N, Strehmel J, Overhage J. Potential application of antimicrobial peptides in the treatment of bacterial biofilm infections. Curr Pharm Des. 2015; 21(1): 67-84. doi: 10.2174/1381612820666140905124312

9. Batoni G, Maisetta G, Esin S. Antimicrobial peptides and their interaction with biofilms of medically relevant bacteria. Biochim Biophys Acta. 2016; 1858(5): 1044-60. doi: 10.1016/j.bbamem.2015.10.013

10. Bell G, Gouyon PH. Arming the enemy: the evolution of resistance to self-proteins. Microbiology. 2003;149: 1367-1375. doi: 10.1099/mic.0.26265-0 PMID: 12777478

11. Habets MG, Brockhurst MA. Therapeutic antimicrobial peptides may compromise natural immunity. Biol Lett. 2012;8: 416-418. doi: 10.1098/rsbl.2011.1203 PMID: 22279153

12. Napier BA, Burd EM, Satola SW, Cagle SM, Ray SM, McGann P, et al. Clinical use of colistin induces cross-resistance to host antimicrobials in Acinetobacter baumannii. mBio. 2013; 4(3). Available from: http://mbio.asm.org/content/4/3/e00021-13.full

13. Patent WO 2015/038339 Al Small cataionic anti-biofilm and IDR peptides

14. Patent WO 2013/170022 BIOFILM PREVENTION, DISRUPTION AND TREATMENT WITH BACTERIOPHAGE LYSIN: Заявка на изобретение RU 2014149348, 09.05.2013 «Способ предотвращения, разрушения и обработки биопленки лизином бактериофага» (прототип)

15. Черныш С.И., Гордя Н.А. Иммунная система личинок Calliphora vicina (Diptera, Calliphoridae) как источник лекарственных веществ, Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2011, Т. 47, No. 6, с. 444-452

16. Chernysh S., Gordya N., Suborova Т. Insect Antimicrobial Peptide Complexes Prevent Resistance Development in Bacteria. PLOS ONE, 2015 DOI: 10.1371/journal.pone.0130788 July 15,2015

17. Патент RU 2447896 Антимикробное вещество

18. Natalia Gordya, Andrey Yakovlev, Anastasia Kruglikova, Dmitry Tulin, Evdokia Potolitsina, Tatyana Suborova, Domenico Bordo, Camillo Rosano, Sergey Chernysh Natural antimicrobial peptide complexes in the fighting of antibiotic resistant biofilms: Calliphora vicina medicinal maggots PLoS ONE 12(3): e0173559.doi:10.1371/journal.pone.0173559

19. Chernysh S. I, Gordja N. A, Simonenko N. P.Diapause and Immune Response: Induction of Antimicrobial Peptides Synthesis in the Blowfly, Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae). Entomological science, 2000, v. 3, No 1, p. 139-144

20. Yakovlev AY, Nesin AP, Simonenko NP, Gordya NA, Tulin DV, Kruglikova AA, Chernysh SI Fat body and hemocyte contribution to the antimicrobial peptide synthesis in Calliphora vicina R.-D. (Diptera: Calliphoridae) larvae. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2016 Sep 1. [Epub ahead of print] DOI:10.1007/s11626-016-0078-1

21. Bulet P, R. Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation. Protein Pept Lett. 2005;12(1): 3-11

22. Mylonakis E, Podsiadlowski L, Muhammed M, Vilcinskas A. Diversity, evolution and medical applications of insect antimicrobial peptides. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 2016; 371 (1695). doi: 10.1098/rstb.2015.0290.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Предложен способ разрушения и предотвращения образования бактериальных биопленок, включающий контактирование бактерий с комплексом антимикробных пептидов насекомых, в состав которого входят дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды, в комбинации с антибиотиками или антисептиками. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения заболеваний человека и животных, вызываемых патогенными биопленками. 7 з.п. ф-лы, 7 табл., 6 пр.

1. Способ разрушения и предотвращения образования бактериальных биопленок, включающий контактирование бактерий с комплексом антимикробных пептидов насекомых, в состав которого входят дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды, в комбинации с антибиотиками или антисептиками.

2. Способ по п. 1, где комплекс дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов получают из насекомых отряда Diptera семейств Calliphoridae, Muscidae и Stratiomyidae.

3. Способ по п. 2, где насекомые отряда Diptera относятся к видам Calliphora vicina, Lucilia sericata, Musca domestica или Hermetia illucense.

4. Способ по п. 3, в котором комплекс дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO 1-11 или их варианты, имеющие, по меньшей мере, 80% идентичности с гомологичными доменами, определяющими антибактериальную активность этих пептидов.

5. Способ по п. 1, в котором комплекс дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов получают путем химического или генно-инженерного синтеза аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 1-11 или их вариантов, имеющих, по меньшей мере, 80% идентичности с гомологичными доменами, определяющими антибактериальную активность этих пептидов.

6. Способ по п. 1, где антибиотики или антисептики представлены одним или более соединением из числа аминогликозидов, бета-лактамов, гликопептидов, макролидов, линкозамидов, флюороквинолонов, амфениколов, тетрациклинов или четвертичных солей аммония.

7. Способ по п. 6, где антибиотик или антисептик выбирают из числа соединений, комбинирование которых с комплексом антимикробных пептидов насекомых, включающим дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды, оказывает синергическое или аддитивное действие на процесс разрушения и предотвращения образования бактериальных биопленок.

8. Способ по п. 1, включающий контактирование комплекса дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов насекомых с бактериями на коже, слизистой оболочке, раневой поверхности, поверхности эрозии или язвы.