СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОЛОГИЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/00 A61P31/06 C12N5/08 

Изобретение откосится к способу получения аутологичной клеточной вакцины против возбудителя туберкулеза.

Развитие медицины в последние два десятилетия охарактеризовано глобальными достижениями в понимании механизмов иммунной защиты организма, принципиально новыми подходами к лекарственному воздействию на нее при наиболее распространенных заболеваниях. Широко распространенное во фтизиатрии индивидуально необоснованное назначение иммуномодулирующих препаратов на основе общих представлений о природе иммунодефицита при туберкулезе легких лишь в половине случаев обусловливает иммуностимулирующий эффект, в других случаях оказывает прямо противоположное негативное действие. Несмотря на повышенный интерес исследователей к проблеме лекарственно-резистентного туберкулеза, в имеющейся литературе недостаточно сведений, касающихся особенностей иммунопатогенеза лекарственно-устойчивых форм распространенного деструктивного туберкулеза легких. Между тем, немногочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями установлено, что характер специфического воспаления а, вероятно, и иммунологическая реактивность организма во многом зависят от биологических свойств поражающего штамма М.tuberculosis. Так, комплексный анализ параметров иммунного статуса у больных с различными клиническими формами распространенного деструктивного туберкулеза легких позволил сделать, вывод о том, что при данной патологии имеется дефект Т-клеточного звена иммунитета. В основе его развития при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном вариантах инфекции лежат как сходные (угнетение пролиферации, секреции Т-активирующих цитокинов, активация апоптоза), так и различающиеся механизмы. В первом случае - свободно-радикальное повреждение лимфоцитов в условиях декомпенсированной клеванной активации факторов антиоксидантной защиты, во втором - делеция реактивных клонов клеток на фоне развивающейся иммунологической толерантности и нарастающей анергии. Эти данные могут быть интересны не только с теоретической точки зрения, но и с позиций иммунокоррекции выявленных нарушений.

Одним из возможных направлений в иммунотерапии туберкулеза является применение Т-клеток, предварительно «обученных» в присутствии антиген-активированных дендритных клеток. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-презентирующими клетками, которые обеспечивают наиболее эффективное представление различных антигенов и активацию Т-клеток. ДК, расположенные в воздухоносном эпителии и паренхиме легких, находятся в «незрелом» состоянии, неспособном к стимуляции Т-лимфоцитов, но обладают свойством специализации к захвату антигена. После взаимодействия с патогеном или продуктами воспаления ДК могут мигрировать в лимфоидные органы для осуществления Т-клеточного ответа. ДК, полученные из моноцитов, культивированные с М.tuberculosis, обладают высокой способностью к стимуляции Т-клеточной пролиферации и секреции цитокинов. Однако при непосредственном введении зрелых антиген-активированных ДК не исключена вероятность их повторного взаимодействия с компонентами клеточной стенки микобактерий, стимулирующими секрецию иммуносупрессорного цитокина ИЛ-10, который может ингибировать развитие клеточного ответа на микобактерий, подавляя секрецию ИЛ-12 ДК. Поэтому правильнее проводить совместное культивирование ДК с Т-клетками, в процессе которого происходит активация клеточного варианта иммунного ответа. Одним из факторов, «запускающих» активацию иммунного ответа по клеточному пути, является ИЛ-2. Он является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов и NK-клеток, повышает функциональную активность Т-хелперов, стимулирует выработку ими эндогенного γ-ИНФ, уменьшает их спонтанный апоптоз. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразование, увеличивает функциональную активность фагоцитов, улучшает процесс презентации и элиминации антигенов. В уже проводимых исследованиях in vitro было выявлено, что введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с ИЛ-2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цитокина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными.

В этой связи есть основание полагать, что использование вакцины на основе мононуклеарных клеток, «обученных» антиген-активированными ДК, может быть эффективным подходом к восстановлению специфического иммунного ответа in vivo у больных туберкулезом легких.

Известен способ получения клеточной вакцины для лечения туберкулеза, сущность которого заключается в инфицировании алло- и ксеногенных макрофагов и клеток макрофагальных клеточных линий патогенным штаммом M.tuberculosis. После чего макрофаги обрабатываются лекарственными средствами, вызывающими гибель микобактерий. Затем клетки подвергаются воздействию гамма-облучения, приводящего к их гибели путем апоптоза. Полученной вакциной иммунизируются резистентные и чувствительные к туберкулезу линии животных, и осуществляется поствакцинальный контроль над показателями, свидетельствующими об активации иммунного ответа. Вакцинация приводила к активации иммунного ответа. Однако вакцина, полученная данным способом, содержит чужеродные организму клетки, что может послужить причиной развития поствакцинальной аллергической реакции.

Техническая задача изобретения - получение высокоэффективной аутологичной вакцины для лечения туберкулеза.

Для решения поставленной задачи в способе получения вакцины против туберкулеза. включающем выделение мононуклеарных клеток и их последующую инактивацию, монуклеарные клетки выделяют из крови пациента больного туберкулезом путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина при соотношении крови и градиента 2:1, центрифугируют в течение 40-45 минут при скорости 1500 об/мин двукратно отмывают собранные из интерфазы мононуклеары центрифугированием в фосфат-забуференном физиологическом растворе при 1500 об/мин в течение сначала 15, а затем 10 минут, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды DMEM, в 100 мл которой содержится 10% FCS; 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 5×10^-5 М меркаптоэтанола, 2,5 мг/мл гентамицин, 100 ЕД/мл Ронколейкина, 500 ТЕ/мл Туберкулина, производят подсчет клеток в камере Горяева, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С и СО₂- инкубаторе при концентрации 5% СО₂, после этого однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15 минут, ресуспендируют а 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ/мл Ронколейкина.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение вакцины

Пациенту производят гемоэксфузию в объеме 100 мл из периферической вены в контейнер с 4 мл гепарина (10 тыс.ЕД). Для выделений мононуклеарных клеток (МНК) наслаивают на градиент плотности фиколл-урографина (ρ 1.077 г/см) из расчета 8 мл крови на 4 мл градиента (2:1) и центрифугируют в центрифужных пробирках в течение 40-45 минут при скорости 1500 оборотов в минуту. Собранные из интерфазы мононуклеары двукратно отмывают центифугированием фосфат-забуференным физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15, а затем 10 минут. Далее, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды (состав среды DMEM на 100 мл: FCS 10%, HEPES 5 мМ, глутамин 2 мМ, меркаптоэтанол 5×10^-5 M, антибиотик, например, гентамицин 2,5 мг/мл, Ронколейкин 100 ЕД/мл, Туберкулин 500 ТЕ/мл), производят подсчет клеток в камере Горяева. После чего клетки доводят до концентрации 2 млн в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С, 5% СО₂ (в CО₂- инкубаторе). После культивирования МНК собирают и однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин, 15 минут, ресуспендируют в 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ Ронколейкина.

Режим обработки крови для получения вакцины подобран эмпирически и основан на следующем: первым этапом в создании вакцины является выделение мононуклеарной фракции лейкоцитов из крови пациента. Затем клетки переносятся в среду с добавлением туберкулина и ронколейкина, в результате чего культивируются антиген презентирующие клетки (дендритные клетки) и активированные лимфоциты. Туберкулин является белковым экстрактом микобактерии туберкулеза и используется в качестве антигена для активации дендритных клеток. Ронколейкин, рекомбинантный ИЛ-2, является полным структурным и функциональным аналогом эндогенного ИЛ-2. В организме ИЛ-2 способствует пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразозание, увеличивает функциональную активность фагоцитов и клеток натуральных киллеров (NK-клеток). Этот цитокин участвует в регуляции иммунного ответа и направляет его по Т-хелпер 1 - клеточному пути развития. Введение ронколейкина в среду для культивирования способствует запуску и развертыванию клеточного иммунного ответа, который является наиболее эффективным в борьбе с микобактерией туберкулеза.

Пример 2.

Оценка специфических показателей вакцины.

В работе использовалась гепаринизированная венозная кровь пациентов, больных туберкулезом, получающих стандартную терапию на базе ГУЗОО «Клинический противотуберкулезный диспансер», г.Омск (n=18).

Для анализа фенотипических характеристик дендритных клеток использовались моноклональные антитела anti-CD83-PE (BD Pharmingen), anti-CD86-FITC (BD Pharmingen), anti-HLA-DR-FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Признаком функциональной зрелости дендритных клеток считалось повышение уровня экспресии вышеперечисленных маркеров по сравнению с незрелыми ДК (нДК).

Фенотипические характеристики дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом (n=18), приведены в Таблице 1, где * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с незрелыми дендритными клетками.

Через 72 часа созревание нДК приобретают фенотип зрелых дендритных клеток (зДК), увеличивая экспрессию CD83+CD86+HLA-DR+.

Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа оценивалась пролиферативная активность мононуклеарных клеток (MHК) с использованием системы APO-BRDU Flow Kit на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Тестирование проводилось через 72 часа культивирования MНК активированными зДК в ответ на специфический антиген M.tuberculosis - туберкулин.

Результаты приведены в таблице 2 (Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК (n=18), * - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с группой МНК).

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что антиген-активированные дендритные клетки повышают пролиферативную активность мононуклеарных клеток больных туберкулезом in vitro.

Для определения эффективности ответа на специфический антиген М.tuberculosis (туберкулин) оценивали количество клеток, продуцирующих IFN-γ, с использованием системы BD FastImmune Cytokine на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Определение уровня продукции IFN-γ в культуральных супернатантах МНК проводили с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бест») через 72 часа культивирования МНК активированных зДК. Под действием аутологичных антиген-активированных дендритных клеток больных туберкулезом легких достоверно повышается количество IFN-γ-секретирующих клеток и уровень продукции цитокина монокуклеарными клетками в ответ на туберкулин по сравнению с клетками исходной популяции. Данные представлены в таблице 3. (Продукция IFN-γ MHК пациентов, больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК (n=18), * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК).

Для определения потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов определялось содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин, с помощью соответствующих моноклональных антител anti-perforin-PE (BD Pharmingen) через 72 часа культивирования МНК, активированных зДК, в ответ на туберкулин. Повышение количества перфорин-позитивных клеток служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения М.tuberculosis in vivo.

Содержание перфорин-позитивных клеток в популяции МНК составило 18,21±0.9% на 100 тыс. клеток исходной популяции и 37,37±1,83% - для популяции МНК + зДК.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего при p<0,05. Статистическая достоверность различий определялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 6.0.

Табл.1 Уровень экспрессии маркеров (% позитивных клеток) Стадия развития ДК Незрелые ДК (%) Зрелые ДК (%); CD 83+/CD 86+ 18,59±1,05 31,33±1,56* CD 83+/HLA-DR⁺ 7,67±0,45 22,26±1,12*

Табл.2 Группы Спонтанный пролиферативный ответ, % Туберкулин -стимулированный пролиферативный ответ, % МНК 10,09±0,65 13,03±0,71 МНК + ДК
(без антигена) 21,27±2,81 27,14±2,54 МНК + ДК
(с антигеном) 27,41±1,45* 46,75±2,3*

Табл.3   Количество IFN-γ-продуцирующих клеток, % Содержание IFN-γ в супернатантах МНК, пг/мл   Спонтанное Туберкулинстимулированное Спонтанное Туберкулинстимулированное МНК 32±1,3 64±3,2 65±3,25 135±6,75 МНК + ДК
(без антигена) 81±14,05 97±15,1 105±15,25 381±49,05 МНК + ДК
(с антигеном) 84±4,02* 161±8,15* 618±30,91* 885±44,25*

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность индукции специфического противоинфекционного иммунного ответа при туберкулезе с помощью антиген-активированных дендритных клеток и «обученных» мононуклеарных клеток in vitro. Совместное культивирование специфических аутологичных дендритных клеток и мононуклеарных клеток больных туберкулезом легких приводит к активации мононуклеарных клеток, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, увеличении количества цитотоксических клеток и повышении их функциональной активности. Преимуществами данной вакцины является использование аутологичных клеток пациента, что обеспечивает индивидуальный подход к лечению заболевания и нивелирует развитие побочных реакций на вакцинацию. Полученная вакцина устраняет дефекты иммунного ответа, возникающие при длительной персистенции микобактерий туберкулеза в организме как на стадии презентации антигена и дифференцировки антиген представляющих дендритных клеток, так и на стадии активации основного клеточного варианта развития иммунного ответа, а также дополнительно гуморального. Таким образом, полученную предлагаемым способом вакцину можно рекомендовать для лечения больных туберкулезом путем внутривенного капельного введения с физраствором.

Изобретение касается способа получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза. Сущность изобретения заключается в активации in vitro мононуклеарной фракции лейкоцитов, выделенных из крови пациента, больного туберкулезом, путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина. После центрифугирования отмывают собранные из ннтерфазы мононуклеары, ресуспендируют в культуральной среде DMEM и культивируют в этой среде с добавлением Туберкулина и Ронколейкина. Затем подсчитывают клетки, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют при концентрации 5% углекислого газа, после чего клетки ресуспендируют в физрастворе с Ронколейкином. Использование способа позволяет получить высокоэффективную аутологичную вакцину для лечения туберкулеза. 3 табл.

Способ получения вакцины против туберкулеза, включающий выделение мононуклеарных клеток и последующее их инактивирование, отличающийся тем, что мононуклеарные клетки выделяют из крови пациента, больного туберкулезом, путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина при соотношении крови и градиента 2:1, центрифугируют в течение 40-45 мин при скорости 1500 об/мин, двукратно отмывают собранные из интерфазы мононуклеары центрифугированием в фосфат-забуференном физиологическом растворе при 1500 об/мин в течение сначала 15, а затем 10 мин, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды DMEM, в 100 мл которой содержится 10% FCS, 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 5·10^-5 М меркаптоэтанола, 2,5 мг/мл гентамицина, 100 Ед/мл Ронколейкина, 500 ТЕ/мл Туберкулина, производят подсчет клеток в камере Горяева, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С в СО₂-инкубаторе при концентрации 5% СО₂, после этого однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ Ронколейкина.