ШТАММ "Т-12" ВИРУСА АДЕНОВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С ВКЛЮЧЕНИЯМИ - ГИДРОПЕРИКАРДИТА КУР (АДВГГ) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИКУМОВ И ВАКЦИН И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ Российский патент 2006 года по МПК C12N7/00 A61K39/29 A61K39/235 A61P31/12 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а точнее к производству диагностикумов и вакцинных препаратов против вируса "аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ)", и может быть использовано как для изготовления диагностикумов и вакцин, так и для экспериментального изучения болезни.

Важным средством борьбы против аденовирусной инфекции, получившей в настоящее время широкое распространение и наносящей значительный экономический ущерб птицеводству, является вакцинопрофилактика. Технология производства вирус-вакцин и диагностикумов такова, что используемые при их изготовлении штаммы должны обладать высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью, а также быть устойчивыми к действию факторов окружающей среды и различным химическим агентам и не терять при контакте с ними основные биохимические свойства, используемые при производстве биопрепаратов.

За рубежом известен ряд штаммов возбудителя гидроперикардита птиц, используемых для производства антигена и иммунной сыворотки (1, 2).

Известен используемый в отечественной ветеринарной практике штамм "АДВ" вируса гидроперикардита птиц семейства Adenoviridae №2330 (коллекция вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН РФ), используемый для производства антигена и иммунной сыворотки для постановки реакции нейтрализации с целью лабораторной диагностики гидроперикардита птиц (3).

Штамм представляет собой генетически однородный, свободный от контаминации вирусный материал с высокой биологической и антигенной активностью.

Однако на практике часто возникает необходимость в воспроизведении различных форм болезни для проведения экспериментальных исследований, а также необходимость в получении высокоактивного антигена для наработки средств специфической профилактики АДВГГ и специфической высокоактивной иммунной сыворотки и антигена для постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) с целью диагностики болезни.

Задачей, решаемой в рамках данного изобретения, является создание штамма вируса "аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ)" с многообразными биологическими и патогенетическими свойствами, позволяющими воспроизводить различные формы болезни для экспериментальных исследований, а также пригодного для производства диагностикумов и вакцин, обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью.

Указанная задача решается получением штамма "Т-12" вируса "Аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ)" для производства диагностикумов и вакцин и для экспериментального изучения болезни.

Штамм "Т-12" вируса "Аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ)" депонирован в Государственной коллекции вирусов ГВК №2358 (коллекция вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН РФ).

Штамм "Т-12" аденовируса птиц относится к ДНК-содержащему семейству Adenoviridae. Обладает кубическим типом симметрии, не имеет суперкапсидной оболочки, размеры вирионов - 70-80 нм, форма - икосаэдрическая. Вирус устойчив к температуре 56С° не менее 30 минут, а также к действию эфира и хлороформа. Инактивируется формалином, теотропином, димерэтиленэмином.

Штамм "Т-12" культивируется в культуре клеток печени эмбрионов кур, вызывая через 72-96 часов после заражения характерные очаги грануляции (округление клеток), формирование отдельных округлых клеток и очагов дегенерации клеток. Титр вируса в пределах 10^5,5 ТЦД₅₀/мл.

При культивировании штамма на СПФ и коммерческих эмбрионах кур оптимальные результаты достигаются при заражении 6-суточных эмбрионов в желточный мешок. Отмечается отставание в развитии и гибель эмбрионов, отек и ухудшение прозрачности хориоаллатоисной оболочки (ХАО), отек головы, подчелюстного пространства и поверхности брюшной полости, разлитые кровоизлияния на коже головы, тела, конечностей. Печень эмбрионов, погибших на 3-4 сутки после заражения, кровенаполнена, темно-вишневого цвета, увеличена. На 5-6 сутки печень желто-коричневого цвета, пятнистая в связи с наличием множества некротических очагов. Культивирование вируса на эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость и на ХАО менее эффективны. Несмотря на метод заражения эмбрионов, основным местом накопления вируса является печень.

Вирус активно репродуцируется в печени 10-20-суточных цыплят. Титр вируса при этом составляет 3,25 lg ИД₅₀/мл и 1,92 lg ЛД₅₀/мл. При заражении цыплят вирус индуцирует образование различных факторов специфического иммунитета, в том числе вируспреципитирующих и вируснейтрализующих антител, что было использовано для наработки специфической гипериммунной сыворотки для производства диагностических наборов и для производства средств специфической профилактики заболевания.

Штамм "Т-12" обладает наиболее оптимальным сочетанием биологических свойств, позволяющих воспроизводить различные формы болезни для экспериментальных исследований; возможность получения высокоактивного антигена для наработки средств специфической профилактики АДВГГ и специфической высокоактивной (от 1:64 до 1:128) иммунной сыворотки и антигена для постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) с целью диагностики болезни.

Пример 1. На основе штамма "Т-12" был разработан набор компонентов для диагностики аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита (АДВГГ) в реакции диффузионной преципитации (РДП).

Диагностический набор предназначен для обнаружения в патологическом материале от больной и павшей птицы антигена и выявления в сыворотках крови птиц антител к аденовирусу гепатита с включениями - гидроперкардита (АДВГГ) в реакции диффузионной преципитации (РДП), а также для выявления антител и антигена аденовирусов 1 группы, имеющих общий группоспецифический антиген с аденовирусом (АДВГГ) и вызывающих различные болезни цыплят, перепелов, фазанов, цесарок и других видов птиц.

Набор содержит следующие компоненты:

- инактивированный антиген штамма "Т-12" вируса (АДВГГ) - 2 ампулы по 0,5 см³;

- отрицательный антиген - 2 ампулы по 0,5 см³;

- положительная сыворотка - 2 ампулы по 0,5 см³;

- отрицательная сыворотка - 2 ампулы по 0,5 см³.

Компоненты набора представляют собой пористую массу; положительный и отрицательный антиген - белого, бело-желтого или светло-коричневого цвета; сыворотки - белого или светло-розового цвета.

Для обнаружения антигена вируса (АДВГГ) в качестве патологического материала используют пробы печени 10-20-суточных цыплят. Материал гомогенизируют в соотношении 1:5 на стерильном физиологическом растворе (рН 7,2-7,4). После трехкратного замораживания и оттаивания центрифугируют при 5 тыс. оборотов в минуту в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают и используют для исследования в РДП.

С целью выявления в РДП специфических антител к возбудителю АДВГГ исследуют сыворотку крови птиц в возрасте 1-го, 60-ти, 120-ти, 240-а, 360-ти дней. После постановки РДП учет результатов проводят через 24, 48, 72 часа после постановки реакции. Реакцию учитывают только при наличии линии преципитации между сывороткой и антигеном в контроле. За положительный результат принимают образование линии преципитации между лунками с исследуемым материалом и специфической сывороткой, а при выявлении антител - наличие линии преципитации между лунками с исследуемой сывороткой и положительным антигеном.

Пример 2. Использование штамма "Т-12" в вакцинном препарате обусловливает его высокую и длительно сохраняющуюся иммуногенную активность.

Вакцинный препарат получают следующим образом.

Из матричной расплодки производственного штамма "Т-12" вируса АДВГГ готовят разведение 1:10 на стерильном физиологическом растворе (рН 7,2) с добавлением антибиотиков (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 ед/мл нистатина) и выдерживают для контакта в течение 2 часов при температуре 4-8С°.

Разведенный материал готовят в объеме, необходимом для заражения данной партии цыплят 25-30-дневного возраста. Зараженных цыплят убивают через 96 часов после заражения, отбирают пробы печени, гомогенизируют их в 0,01 М фосфатно-буферном растворе (рН-7,2) в соотношении 1:1 (вес/объем), трижды замораживают в течение 30 минут, собирают вируссодержащую надосадочную жидкость. В полученный вируссодержащий материал добавляют 500 ед/мл пенициллина, 500 мкг/мл стрептомицина и 200 ед/мл нистатина. После контакта при 4-8С° из каждого флакона берут пробу вируссодержащей жидкости в объеме 1 мл для контроля на стерильность и контаминацию микоплазмами. Затем из каждого флакона берут пробу в объеме 1 мл вируссодержащего материала и сливают в один стерильный флакон емкостью 100 мл. Эту взвесь проверяют на биологическую активность производственной расплодки. До получения результатов проверки на биологическую активность вся производственная расплодка вируса хранится в замороженном состоянии при температуре 25-30С°. Для приготовления вакцины используют только стерильную в бактериальном отношении вируссодержащую жидкость с титром для вируса АДВГГ не менее 3,5 lg ИД₅₀. Для инактивации инфекционных свойств вируса АДВГГ используют препарат теотропин (А-24). Готовая вакцина содержит также масляный адъювант - инфузолипол. По внешнему виду вакцина представляет собой эмульсию белого или бело-бежевого цвета. Допускается незначительное расслоение вакцины, которое легко устраняется при встряхивании флакона. Вакцину применяют для профилактической иммунизации молодняка кур против аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита.

Исследования иммуногенной активности вакцины подтвердили эффективность препарата. Вакцинированные птицы после контрольного заражения патогенным штаммом "Т-12" в 80% и более были устойчивы к развитию болезни, при том, что смертность в группе контрольных невакцинированных птиц составила - 87,5%.

Таким образом, штамм "Т-12" представляет собой свободный от контаминации вирусный материал, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, и в зависимости от дозы и метода заражения вызывает либо острое (со смертностью птицы 80-100%), либо субклиническое течение болезни, выявляемое только при гистологических исследованиях, что удобно для проведения экспериментальных исследований различных патогенетических и иммунных процессов, отмечающихся при АДВГГ, а также для изучения морфогенеза самих аденовирусов, исследования их онкогенных свойств на лабораторных млекопитающих животных.

Источники информации

1. Barrett S.Cowen. Inclusion body hepatitis-anemia and hydropericardium syndromes: etiology and control / Word, s Poultry Science Journal, Vol.48, November, 1992.

2. Ahmad I., Afzal M., Malik M.J., Hussan Z., Hanif W. Studies on the disease pattern and etiology of hydropericardium syndrome in broiler chickens in Pakistan. Pakistan Journal of Agricultural Research. 1988, Vol.10, p.195-199.

3. Патент RU 2120993, 6 C 12 N 7/00, А 61 К 39/235, 27.10.98. "Штамм "АДВ" вируса гидроперикардита птиц семейства ADENOVIRIDAE." Алиев А.С., Джавадов Э.Д., Вихрева И.Н., Алиева С.Н., Алиев Т.С.

Штамм относится к ДНК-содержащему семейству Adenoviridae. Обладает кубическим типом симметрии, не имеет суперкапсидной оболочки, размеры вирионов - 70-80 нм, форма - икосаэдрическая. Устойчив к температуре 56°С не менее 30 минут, а также к действию эфира и хлороформа. Инактивируется формалином, теотропином, димерэтиленэмином. Штамм культивируется в культуре клеток печени эмбрионов кур, через 72-96 часов после заражения вызывает характерные очаги грануляции (округления клеток), формирование отдельных округлых клеток и очагов дегенерации клеток. Титр вируса в пределах 10^5,5 ТЦД₅₀/мл. Штамм позволяет воспроизводить различные формы болезни для экспериментальных исследований, пригоден для производства диагностикумов и вакцин, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью.

Штамм "Т-12" вируса аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ) ГКВ №2358, используемый для производства диагностикумов и вакцин и экспериментального изучения болезни.