СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ КОЛОНОК С ПОЛИМЕРНЫМИ СОРБЕНТАМИ ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N30/56 

Изобретение относится к жидкостной хроматографии и может быть использовано для получения эффективных колонок для разделения биополимеров, для экспресс-контроля молекулярно-массового распределения (ММР) олигомеров этоксисилоксанов в гидролизованных и негидролизованных этилсиликатах, а также для других случаев хроматографических процессов.

Для приготовления современных высокоэффективных колонок широко используют полимерные сорбенты на основе полистирола (ПС) и полистирол-дивинилбензола (ПС-ДВБ) с высокой степенью сшивки, причем существующие технологии позволяют получать мелкие фракции моносферических зерен диаметром 3-10 мкм [1, 2].

Полимерные сорбенты, используемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), должны обладать определенными свойствами по параметрам величин: механической прочности, изменению объема в органических и водно-органических средах, диаметру пор, распределению пор по размеру, удельной поверхности и гидрофобности.

В большинстве случаев, из вышеперечисленных характеристик, определяющих применимость полимерного сорбента в ВЭЖХ, основными являются его механическая прочность и степень набухания в органических и водно-органических средах.

Синтезированные по патенту [2] моносферические гранулы полимерного сорбента на основе ПС-ДВБ, упакованные в хроматографическую колонку, изменяют объем при набухании в дихлорметане (хороший растворитель) на 9-20%, а в 50% растворе метанола в воде (плохой растворитель) на 0,03-0,15%.

Хроматографические колонки, упакованные моносферическими гранулами диаметром 3 мкм полимерного сорбента на основе ПС-ДВБ, имеют эффективность более 50000 теоретических тарелок/метр (т.т./м) [2]. Но в патенте [2] не указаны тип используемого растворителя для приготовления суспензии сорбента и условия методики приготовления колонок.

Следует отметить ряд свойств, которые принципиально отличают сорбенты на основе сверхсшитого полистирола (ССПС) от всех известных полимерных сорбентов. Сухой ССПС набухает в любых растворителях, независимо от их параметра растворимости [3, 4]. Начиная с 20% степени сшивки, полимеры этого типа проявляют способность набухать в метаноле, этаноле и гексане.

В настоящее время фирма Purolite, Великобритания, выпускает ряд ССПС сорбентов как гидрофобных, так и содержащих катионо- и анионообменные группы, под общим названием Macronet (MN). Их характеристики представлены в [5]. Эти сорбенты предназначены для извлечения органических соединений из вод в промышленных масштабах. Из зерен немодифицированного гидрофобного сорбента MN-200 можно получать мелкие частицы, пригодные для ВЭЖХ, имеющие диаметр макропор 850-950 Å и микропор 15 Å, работающие при рН 0-14.

Среди ССПС для ВЭЖХ, наиболее изучена химическая структура MN-200 [6], которая исследована в работе [7]. ССПС MN-200 по сравнению с сорбентом на основе ПС-ДВБ имеет меньшее набухание в тетрагидрофуране в 3,9 раза и ацетонитриле в 8,7-12 раз [6, стр.6].

Одним из уникальных свойств немодифицированного ССПС является то, что, несмотря на высокую гидрофобность этого сорбента, его поверхность смачивается водой. Проведенные исследования показали, что поверхность ССПС MN-200 имеет заряд, причем и величина, и знак заряда определяются рН раствора, в котором находится сорбент [7]. В соответствии с зависимостью дзета-потенциала (ξ) от рН, при рН<4,3 немодифицированный ССПС MN-200 имеет положительный заряд, достигающий максимального значения при рН 2,5-2,7, а при рН>4,3 имеет отрицательный заряд, достигающий максимального значения при рН 8-9.

По данным элементного анализа, наряду с углеродом и водородом MN-200 содержит небольшое количество хлора и около 6% кислорода. Таким образом, наличие положительного заряда на поверхности немодифицированного ССПС можно объяснить только присутствием атомов кислорода в структуре полимерной матрицы. Природа функциональных групп на поверхности MN-200 была исследована методами твердофазного ЯМР ¹³С, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием [7, 8]. Установлено, что на поверхности ССПС находятся кетонные, эфирные (R-O-R) и функциональные спиртовые группы, точную концентрацию каждой из которых определить не удается.

Потенциометрическое титрование MN-200 показало, что на его поверхности помимо карбонильных, присутствуют катионообменные группы трех типов: слабо и сильно кислые, а также фенольные [6, стр.87].

В работе [6, с.53] заполнение колонок ССПС MN-200 осуществляли в виде суспензии в ацетоне, но других условий методики заполнения колонок не приведено.

В работе [9, с.89] заполнение колонок нейтральным ССПС марки Chromalite 5 HGN осуществляли в виде суспензии, но какие использовали растворители и условия методики заполнения колонок не приведено.

У сорбентов типа μ-стирогеля (сополимер стирола и дивинилбензола) с малым размером пор (100 Å и 500 Å) наблюдается усадка слоя сорбента в колонке как в полярных, так и в неполярных растворителях. Удобным, хотя и весьма дорогим выходом из положения является использование отдельных наборов колонок для каждого применяемого растворителя. Некоторые фирмы с этой целью выпускают колонки с одним и тем же размером пор, заполненные разными растворителями - тетрагидрофураном, толуолом, хлороформом и диметилформамидом [10].

Колонки для ВЭЖХ с полимерными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола с диаметром гранул 10 мкм и диаметром пор 500 Å, 1000 Å имеют следующую эффективность (тыс. т.т./м): μ-стирогель, заполнены в толуоле - 10; μ-сферогель, заполнены в толуоле - 18; ультрастирогель, заполнены в толуоле - 46; ультрастирогель, заполнены в тетрагидрофуране - 40; TSK - гель, заполнены в тетрагидрофуране - 20 [10].

Как видно, колонки для ВЭЖХ с полимерными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола имеют различную эффективность, которая в большой степени зависит от методики заполнения колонок.

Учитывая, что сверхсшитые полимерные сорбенты на основе полистирола, полидивинилбензола и полистирола-дивинилбензола не набухают в воде, казалось бы, что вода - идеальный элюент для набивки колонок. Однако в водном элюенте эти сорбенты не образуют суспензии и в нем не разрушаются агломераты зерен сорбентов, что препятствует плотной упаковке сорбентов в колонках для ВЭЖХ.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу, выбранному в качестве ближайшего аналога, является способ приготовления колонок для ВЭЖХ суспензионным методом, включающий: взвешивание требуемого для колонки данного размера количества сорбента, заливку его растворителем и приготовление суспензии. Суспензию помещают в резервуар, соединенный с колонкой, на конце которой установлен фитинг с фильтром, и под давлением 20-60 МПа продавливают суспензию через колонку, подавая в резервуар насосом растворитель. Суспензию отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядоченный слой сорбента, обеспечивающий эффективное разделение при ВЭЖХ. Останавливают поток растворителя, дают давлению упасть до нуля и снимают колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки и присоединяют второй фитинг с фильтром. Полученную таким образом колонку устанавливают на хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе [10, стр.151].

Растворитель для приготовления суспензии сорбента часто является определяющим фактором для качества упаковки колонки, так как суспензия должна сохранять стабильность, начиная от переноса ее в резервуар и в течение всей упаковки, или необходимо замедлить седиментацию или исключить ее. Растворители с сорбентами могут давать истинные суспензии, осаждающиеся в соответствии с законом Стокса (в них частицы распределены в виде индивидуальных частиц), и "склеенные" суспензии, осаждающиеся много быстрее и содержащие комочки из нескольких частиц сорбента [10, стр.152-153].

Истинные суспензии осаждаются в виде плотного, труднодиспергируемого осадка. "Склеенные" суспензии осаждаются в виде рыхлого и легкодиспергируемого осадка. Предпочтение следует отдавать растворителям, дающим с данным сорбентом истинную суспензию.

Мнения о концентрации суспензии, оптимальной для упаковки колонок расходятся: некоторые авторы получают наилучшие результаты с очень разбавленными суспензиями (1-5%), другие - с концентрацией (10-30%). Очевидно, для каждой системы растворитель-сорбент существует диапазон концентраций суспензии, дающий наилучшую упаковку слоя сорбента [10, стр.153].

Однако данный способ приготовления высокоэффективных колонок со сверхсшитыми полимерными сорбентами на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола в виде суспензии в полярных кислородсодержащих органических растворителях (например, в ацетоне или спиртах) имеет следующие недостатки:

1. Не удается получить равномерную и плотную структуру слоя сорбента в колонке из-за наличия на поверхности ССПС положительного или отрицательного электрических зарядов. Наличие отрицательного заряда на поверхности ССПС связано с присутствием карбоксильных сильнокислотных, слабокислотных и функциональных фенольных групп, а наличие положительного - присутствием катионов металлов в структуре этого полимера, таких как хлориды железа, олова, титана, алюминия, которые используются в качестве катализаторов реакции Фриделя-Крафтса - реакции сшивания цепей линейного полистирола метиленовыми группами, и гидролизуются в водных растворах.

2. Не удается получить равномерную и плотную структуру слоя сорбента в колонке из-за наличия на поверхности ПС-ДВБ и полидивинилбензольных сорбентов положительного заряда. Наличие положительного заряда связано с присутствием катионов металлов в структуре этих полимеров, таких как хлориды железа, олова, титана, алюминия, цинка и т.п., которые используются в качестве катализаторов реакции Фриделя-Крафтса и гидролизуются в водных растворах.

3. Наличие карбонильных, карбоксильных и др. групп на поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов, а также содержание в структуре полимера катионов железа, олова, титана, алюминия, цинка приводит к сорбции органических веществ биомолекул плазмы крови, мономерной кремниевой кислоты и ее олигомеров при хроматографическом разделении.

4. Наличие карбонильных и карбоксильных групп на поверхности сверхсшитого полимерного сорбента на основе полидивинилбензола приводит к набуханию сорбента в колонке в течение 30-35 суток в подвижной фазе - абсолютированном этаноле, что приводит к резкому повышению давления на входе в колонку.

5. Из-за различной степени набухания сверхсшитых полимерных сорбентов в органических и водно-органических средах, в процессе разделения на колонках при использовании элюентов, содержащих 50-95% воды, образуются микропустоты в колонке, что приводит к снижению эффективности разделения.

6. Изменение положительного заряда на поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов в водной среде при рН выше 2,5 связано с постепенным гидролизом катионов железа, олова, титана, алюминия, цинка, в результате чего образуются микропустоты в колонке, что приводит к проседанию сорбента в колонке и, соотвественно, снижению эффективности разделения.

Задача решаемая данным изобретением - устранение набухания сорбентов в процессе приготовления колонок, предотвращение потери эффективности колонок в процессе эксплуатации путем устранения катионов металлов, карбонильных и карбоксильных групп с поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола и разрушение агломератов моносферических зерен сорбента.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что предлагаемый способ приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами для жидкостной хроматографии включает приготовление суспензии моносферических зерен сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола диаметром 5 и 10 мкм в водном растворе щелочи с рН 11-14, выдерживание ее при комнатной температуре в течение 0,5-60 часов для удаления с поверхности сорбента катионов металлов, карбонильных и карбоксильных групп; введение этой суспензии в колонку, упаковку сорбента в колонке и его уплотнение при максимальном давлении (250-300 атм.) последовательным пропусканием водного раствора щелочи с рН 11-14, в котором не происходит набухание сорбента при комнатной температуре.

Приготовленные хроматографические колонки (150 мм × 3 мм), заполненные моносферическими зернами сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола диаметром 5 и 10 мкм имеют эффективность 30000-40000 т.т./м по гексану (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

Высокоэффективные эксклюзионно-хроматографические колонки характеризуются следующими параметрами: моносферические зерна сорбента имеют диаметр 10 мкм и менее [11, с.1, 113]; длина колонки при размере частиц сорбента 5-6 мкм составляет 10-15 см [11, с.200]; диаметр колонки 0,26-0,70 см [11, с.183]; противодавление колонки до 7000 psi (490 ат) [11, с.128, 141]; скорость потока элюента до 3 мл/мин [11, с.128]; объем проточной кюветы рефрактометра 5-10 мкл [11, с.151]; колонка с частицами сорбента 10 мкм дает эффективность 7000-10000 т.т. на 25 см длины.

Пример 1. 1,5 см³ моносферических зерен диаметром 10 мкм сверхсшитого полистирольного сорбента (ССПС) марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å, помещают в 10 см³ 96%-го этанола при комнатной температуре. Через 1 час суспензию ССПС переносят на стеклянный фильтр с диаметром пор менее 10 мкм и отфильтровывают этанол под вакуумом. ССПС переносят на сито с размером ячейки 20 мкм и протирают его через сито с дробным добавлением (по 0,5-1,0 см³) 15 см³ 96%-го этанола для разрушения агломератов моносферических зерен сорбента. Суспензию ССПС помещают в металлическое устройство для заполнения колонок объемом 15 см³, герметизируют его с помощью головки, к которой присоединяют в металлическом корпусе с помощью штуцера и фторопластовой прокладки стеклянную колонку длиной 150 мм, внутренним диаметром 3 мм (150 мм × 3 мм), на противоположном конце которой установлен металлический фильтр, фторопластовая прокладка и фитинг. Устройство для заполнения колонок с присоединенной колонкой переворачивают, и заполнение колонки ССПС осуществляют в положении снизу-вверх. При плавном повышении давления до 30 МПа продавливают суспензию ССПС через колонку, подавая в устройство для заполнения колонок насосом растворитель. Суспензию ССПС отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядочный слой сорбента. При прокачивании через колонку 15 см³ этанола, останавливают поток растворителя, давление снижают до нуля и отсоединяют колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки с помощью скальпеля, устанавливают металлический фильтр, фторопластовую прокладку и присоединяют второй фитинг. Заполненную ССПС колонку устанавливают на жидкостной хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе. Приготовленная такими действиями по известному способу [10] колонка имеет эффективность по гексану 4000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ССПС в колонке и, соответственно, снижение эффективности колонки. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС полностью не разрушаются при протирании его через сито и при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит изменение заряда моносферических зерен ССПС и гидролиз хлоридов металлов (железа, олова, титана, алюминия, цинка и др.).

При хроматографическом разделении на колонке с ССПС олигомеров этоксисилоксанов и кремниевой кислоты, имеющихся в гидролизате тетраэтоксисилана, (элюент - абсолютный этанол - 0,1 мл/мин), отмечается сорбция кремниевой кислоты на сорбенте.

Использование органического растворителя - этанола для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента ССПС при заполнении колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.

Пример 2. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å приготавливают аналогично примеру 1, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен ССПС используют толуол, как в известном способе [10]. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 1500 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ССПС в колонке.

Использование органического растворителя как в известном способе [10] - толуола для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента ССПС при заполнени колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.

Пример 3. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают аналогично примеру 1 по известному способу [10], с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 10 мкм высокосшитого полидивинилбензольного сорбента с диаметром пор 500 Å, которые выдерживают давление до 30 МПа. Заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа.

Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 3500 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен полидивинилбензольного сорбента полностью не разрушаются при протирании сорбента через сито и при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит изменение заряда моносферических зерен сорбента.

Использование органического растворителя, как в известном способе [10] - этанола для приготовления суспензии моносферических зерен высокосшитого полидивинилбензольного сорбента при заполнении колонки при высоком давлении (25 МПа) не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.

Пример 4. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами полимерного сорбента на основе полистирола-дивинилбензола (ПС-ДВБ) диаметром 10 мкм и диаметром пор 500 Å приготавливают аналогично примеру 1, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента используют тетрагидрофуран, как в известном способе [10]. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 4500 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ПС-ДВБ сорбента в колонке.

Использование органического растворителя - тетрагидрофурана для приготовления суспензии моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента при заполнени колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.

Пример 5. Готовят суспензию - 1,5 см³ моносферических зерен ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å, в соответствии с предложенным изобретением, помещают в 10 см³ водного раствора щелочи (NaOH) с рН 13, и оставляют при комнатной температуре на 12 часов. Затем суспензию ССПС помещают в металлическое устройство для заполнения колонок объемом 15 см³, герметизируют его с помощью головки. К головке присоединяют в металлическом корпусе с помощью штуцера и фторопластовой прокладки стеклянную колонку (150 мм × 3 мм), на конце которой установлен металлический фильтр, фторопластовая прокладка и фитинг. Устройство для заполнения колонок с присоединенной колонкой переворачивают, и заполнение колонки суспензией ССПС осуществляют в положении снизу-вверх. При плавном повышении давления до 30 МПа продавливают суспензию ССПС через колонку, подавая в устройство для заполнения колонок насосом водный раствор щелочи с рН 13. Суспензию ССПС отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядочный слой сорбента. После прокачивания через колонку 15 см³ водного раствора щелочи, останавливают поток растворителя, давление снижают до нуля и отсоединяют колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки с помощью скальпеля, устанавливают металлический фильтр, фторопластовую прокладку и присоединяют второй фитинг. Заполненную ССПС колонку устанавливают на жидкостной хроматограф, прокачивают через нее дистилированную воду для удаления щелочи, а затем 96%-ный этанол до установления равновесия, после чего она готова к работе. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и хлориды металлов.

На фиг.1 представлена хроматограмма олигомеров этоксисилоксанов в гидролизате тетраэтоксисилана, полученная на колонке (300 мм × 3 мм) (соединенные две стеклянные колонки 150 мм × 3 мм) с ССПС марки Chromalite 10HMN2. Олигомеры этоксисилоксанов: 1 - олигоэтоксисилоксан (Si₁₃), 2-4 - олигоэтоксисилоксаны (Si₂-Si₆) и мономеры: 5 - тетраэтоксисилан, 6 - кремниевая кислота. Детектор - дифференциальный рефрактометр RIDK-102 юстирован по циклогексану, чувствительность 16×10^-7 ед. рефракции; скорость сухого элюента - 0,2 мл/мин толуола, содержащего 1% изопропанола; температура термостата колонки, инжектора и детектора - 25°С; объем дозирующей петли - 10 мкл; проба 10 мкл 0,1% гидролизата тетраэтоксисилана в сухом толуоле, содержащего 1% изопропанола.

При хроматографическом разделении на колонке с ССПС марки Chromalite 10HMN2 не отмечается сорбции кремниевой кислоты, содержащейся в гидролизате тетраэтоксисилана.

Пример 6. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 14, а время обработки сорбента в щелочи составляет 30 минут. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-14 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента, и хлориды металлов в результате гидролиза.

Пример 7. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å приготавливают аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 11, а время обработки сорбента в щелочи составляет 60 часов. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента, и хлориды металлов в результате гидролиза.

Пример 8. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 10 мкм высокосшитого полидивинилбензольного сорбента с диаметром пор 500 Å и заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента.

На фиг.2-3 представлены хроматограммы, полученные на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 10 мкм. Сигналы детектора через интерфейс записывают в компьютер с помощью программы "Экохром".

На фиг.2 представлена хроматограмма определения флуоресцирующих комплексов глутатиона и металлотионеина с N-(9-акридин)-малеимидом (NAM) в ацетонитрильном экстракте плазмы крови (10 мкл) крупного рогатого скота (коровы) из Тырнауза. 1, 2, 3, 6, 7, 8 - металлотионеины с NAM с временами удерживания 2,14, 2,31, 2,56, 5,22, 6,06, 8,02 мин; 4, 5 - металлотионеины + глутатион с NAM временами удерживания 3,32, 4,14 мин.

При определении металлотионеина в плазме крови животных использовали методику [12] со следующими внесенными изменениями:

- из плазмы крови металлотионеин экстрагировали ацетонитрилом, при этом высокомолекулярные белки высаждались;

- после центрифугирования ацетонитрильный экстракт из плазмы крови подвергали дереватизации и проведению реакции с NAM по методике [12];

Детектор - флуоресцентный RF-530 (Шимадзу), возбуждение при 360 нм, флуоресценция при 435 нм; скорость элюента - 0,4 мл/мин 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 35% этанола; проба 10 мкл дериватизата из ацетонитрильного экстракта плазмы крови в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,5.

Хроматографирование ацетонитрильных экстрактов металлотионеина из плазмы крови животных позволяет заметно повысить чувствительность анализа за счет увеличения объема исследуемой плазмы и сократить время анализа до 25 мин за счет уменьшения коэкстрактивных веществ, реагируемых с NAM.

На фиг.3 представлена хроматограмма определения стандарта металлотионеина (100 нг) в виде флуоресцирующих комплексов с NAM по методике [12]. 1-9 - металлотионеины с NAM с временами удерживания 2,12, 2,31, 3,40, 4,33, 6,08, 6,47, 11,45, 14,45 и 15,58 мин.

Детектор - флуоресцентный RF-530 (Шимадзу), возбуждение при 360 нм, флуоресценция при 435 нм; скорость элюента - 0,4 мл/мин 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 35% этанола.

Пример 9. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 5 мкм высокосшитого полидивинилбензола с диаметром пор 500 Å и заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 40000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке в связи с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента.

На фиг.4 представлена хроматограмма, полученная на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 5 мкм, олигомеров этоксисилоксанов в гидролизате тетраэтоксисилана. Олигомеры этоксисилоксанов: 1 - олигоэтоксисилоксан (Si₁₃), 2-4 - олигоэтоксисилоксаны (Si₂-Si₆) и мономеры: 5 - тетраэтоксисилан и 6 - кремниевая кислота (Si(OH)₄). Детектор - дифференциальный рефрактометр RIDK-102 юстирован по абсолютному этанолу, чувствительность 8×10^-7 ед. рефракции; скорость элюента - абсолютного этанола - 0,18 мл/мин; температура термостата колонки, инжектора и детектора - 25°С; объем дозирующей петли - 10 мкл; проба 10 мкл 0,4% гидролизата тетраэтоксисилана в абсолютном этаноле.

При хроматографическом разделении на колонке с полидивинилбензольным сорбентом не отмечается сорбции кремниевой кислоты на сорбенте, содержащейся в гидролизате тетраэтоксисилана.

На фиг.5 представлена хроматограмма, полученная на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 5 мкм, гидратированных форм сульфата натрия - 1-8 с временами удерживания 3,16, 3,32, 4,08, 4,26, 5,09, 6,33, 7,43, 8,46 мин. Детектор - УФ - 230 нм (спектрофотометр фирмы Хитачи 320 с кюветой объемом 7 мкл); скорость элюента - 0,2 мл/мин 80% ацетонитрила в воде; проба 10 мкл насыщенного водного раствора сульфата натрия.

Пример 10. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами высокосшитого полидивинилбензольного сорбента диаметром 5 мкм с диаметром пор 500 Å приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 9, с той разницей, что для приготовления суспензии сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 11, а время обработки сорбента в щелочи составляет 60 часов. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 40000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке в связи с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента.

Пример 11. По предлагаемому изобретению стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами полимерного сорбента на основе полистирола-дивинилбензола диаметром 10 мкм с диаметром пор 500 Å приготавливают аналогично примеру 5. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 35000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).

При использовании элюента - воды с рН 1-14 не происходит проседание слоя ПС-ДВБ сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и хлориды металлов в результате гидролиза.

Источники информации

1. А.С. СССР №948110, МКИ С 08 F 212/08; С 08 F 8/00. Способ получения макросетчатых изопористых полимеров стирола / М.П.Цюрупа, В.А.Даванков, Е.И.Люстгартен, А.Б.Пашков, Л.А.Бельчич. Опубл. 23.04.1983, Бюл. №15.

2. Патент России №2163911, МКИ С 08 F 257/02; G 01 N 30/48. Способ получения сорбентов для хроматографии // К.О.Сочилина, В.А.Сочилин. Опубл. 10.03.2001, Бюл. №7.

3. Даванков В.А., Волынская А.В., Цурюпа М.П. Сорбционные свойства макросетчатых изопористых полимеров стирола // Высокомол. соед.(Серия В). 1980. Т.22. С.746-748.

4. Даванков В.А., Рогожин С.В., Цурюпа М.П., Панкратов Е.А. Физико-химические свойства макросетчатых изопористых полистирольных гелей // Ж. физ. химии. 1974. Т. 48. С.2964-2967.

5. Hypersol-Macronet Sorbent Resins // Purolite Technical Bulletin. 1995. V.1. P.3-7.

6. Пеннер Н.А. Сверхсшитые полистирольные сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Дис. канд. хим. наук. М., 2000, 178 с.

7. Streat М., Sweetland L. A. Removal of pesticides from water using hypercrosslinked polymer phases: Part 1 - Physical and chemical characterization of adsorbents // Trans.I.Chem.Eng. 1998. V.76. P.115-126.

8. Steckle W.P.J., Duke J.R.J. Solid state NMR studies of hypercrosslinked resins. // Polym.Prepr. 1997. V.38. P.834-835.

9. Сычев К.С. Применение сверхсшитого полистирола в высокоэффективной жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции. Дис. канд. хим. наук. М., 2004, 147 с.

10. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.Б. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. - М.: Химия, 1986, 271 с.

11. W.W.Yau, J.J.Kirkland, D.D.Bly. Modern Size-Exclusion liquid chromatograhy. Practice of Gel permleation and Gel Filtration Chromatograhy. New York-Chichester-Brisban-Toronto, 1979. P.393.

12. Kamata К. Sensitive Fluorometuy of metallothionein as a functionl metal carrier in body // Japan-Russia International Symposium on Enviromental Studies. Tohoku Fukushi University: Sendai, 2003, p.9-10.

Использование: жидкостная хроматография, приготовление высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами. Сущность изобретения: для приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами готовят суспензию сорбента в водном растворе щелочи с рН=11-14 с выдержкой 0,5-60 часов, упаковку и уплотнение сорбента в колонке осуществляют также в водном растворе щелочи. Изобретение повышает эффективность эксплуатации колонок. 2 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами для жидкостной хроматографии, включающий приготовление суспензии моносферических зерен сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола в растворе, введение суспензии в колонку, продавливание суспензии через колонку при повышении давления при подаче раствора, упаковку, уплотнение и формирование упорядочного слоя сорбента, прокачивание раствора через колонку и снижение давления, отличающийся тем, что в качестве раствора используют водный раствор щелочи с рН 11-14, причем перед введением суспензии в колонку сорбент выдерживают в упомянутом растворе в течение 0,5-60 часов.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления суспензии используют зерна сорбента диаметром 5 и 10 мкм.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что уплотнение сорбента осуществляют при максимальном давлении 25-30 МПа.