СПОСОБ ОТБОРА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ИНФЕКЦИИ, ПЕРЕДАВАЕМОЙ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а точнее к способам диагностики возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, и может быть использовано с диагностической целью при гинекологических заболеваниях.

Известен способ диагностики возбудителя инфекции передаваемой половым путем, включающий отбор материала из половых органов и выявление возбудителя инфекций, передаваемых половым путем (см. статьи Reichelderfer P.S., Coombs R.W., Wright D.J., Cohn J., Bums DN и другие «Effect of menstrual cycle on HIV-1 levels in the peripheral blood and genital tract. WHS 001 Study Team.» AIDS 2000 Sep.29; 14(14):2101-7 (PMID 11061650 [PubMed - indexed for MEDLINE]), а также - Mostad S.B., Jackson S., Oveirbaugh J., Reilly M. и другие «Cervical and vaginal shedding of human immunodeficiency virus type 1-infected cells throughout the menstrual cycle». J. Infect. Dis. 1998. Oct.; 178(4):983-91 (PMID 11061650 [PubMed - indexed for MEDLINE]).

Недостатком известных решений является то, что их рекомендации прямо противоречат друг другу, что не позволяет обеспечить высокий уровень достоверности результатов.

Известен также способ диагностики возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, включающий отбор материала из мочеполовых органов в период максимальной частоты выявления данного возбудителя и последующее лабораторное выявление возбудителя инфекций, передаваемых половым путем (см. статью Brock B.V, Seike S., Benedetti J., Douglas J.M. Jr, Corey L., «Frequency of asymptomatic shedding of herpes simplex virus in women with genital herpes». JAMA. 1990. Jan. 19; 263(3):418-20 (PMID 2152951 [PubMed - indexed for MEDLINE]).

Недостатком известного решения является то, что его применение не позволяет обеспечить высокий уровень достоверности результатов, поскольку не учитывают сезонные изменения частоты выявления данного возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, причем использовались специфичные методы диагностики, к тому же не отличающиеся достаточной чувствительностью. Кроме того, на практике, как правило, проводят одновременное исследование на нескольких возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в таких условиях выбор предпочтительной для исследования фазы цикла может стать затруднительной.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в обеспечении высокого уровня достоверности результатов диагностики одновременно нескольких возбудителей инфекции, передаваемой половым путем.

Технический результат, достигаемый при решении поставленной задачи, выражается в обеспечении возможности отбора проб в период максимальной активности возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, и возможности оценки достоверности полученных результатов и, кроме того, позволяет с большей экономической эффективностью использовать средства диагностики (по соотношению затраты-результат).

Поставленная задача решается тем, что способ диагностики возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, включающий отбор материала из мочеполовых органов в период максимальной частоты выявления данного возбудителя и последующее лабораторное выявление возбудителя инфекций, передаваемых половым путем, отличается тем, что отбор материала производят во время овариально-менструального цикла, в интервал времени, который определяют при заданном показателе определенности R², из уравнения полиноминальной аппроксимации результатов предварительно проведенного в данном регионе исследования частоты выявления различных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в зависимости от временного интервала овариально-менструального цикла, с учетом сезонного изменения этого параметра, выражающего зависимость вероятности выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, от порядкового номера одного из десяти интервалов, на которые разбит овариально-менструальный цикл, при этом нумерация интервалов времени возрастает от начала овариально-менструального цикла, причем продолжительность 1, 9 и 10 интервалов задают равной четырем дням, а продолжительность остальных интервалов задают равной трем дням, кроме того, при определении зависимости частоты выявления данного возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, от интервала овариально-менструального цикла и непосредственно при диагностике, используют молекулярно-биологические методы диагностики, предпочтительно метод полимеразной цепной реакции. Кроме того, при показателе определенности, равном R²=0,703, используют выражение

У=-0,0015х²+0,0215х+0,0981,

где у - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %;

х - порядковый номер интервала. Кроме того, при показателе определенности, равном R²=0,8039, используют выражение

У=0,000004х⁶+0,0002х⁵-0,0032х⁴+0,0272х³-0,1166х²+0,245х-0,0459,

где у - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %;

х - порядковый номер интервала.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию "новизна".

Признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи:

Признаки первого пункта формулы обеспечивают возможность назначения времени отбора материала в наиболее благоприятный для этого интервал овариально-менструального цикла с позиций, обеспечивающих заданное повышение точности прогноза. Кроме того, заданная разбивка овариально-менструального цикла на интервалы и их продолжительность обеспечивают повышение точности выбора времени отбора материала для диагностики. Кроме того, заданный метод диагностики также способствует повышению достоверности результатов и за счет своей высокой точности и за счет единого диагностирующего метода, используемого и на этапе формирования экспертной базы и непосредственно при работе врачей-диагностов.

Признаки второго и третьего пунктов формулы изобретения обеспечивают возможность регулирования экономической составляющей процесса диагностики в зависимости от заданной степени достоверности результатов на конечном этапе диагностики.

На фиг.1 показана диаграмма 1 (Средневзвешенная частота выявления наиболее часто встречаемых возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в различные периоды овариально-менструального цикла); на фиг.2 показана диаграмма 2 (Средневзвешенная частота выявления возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в разное время года).

Использование метода полимеразной цепной реакции обусловлено высокой чувствительностью метода (на практике - десятки и сотни копии ДНК в пробе для получения положительного результата), которая как минимум на порядок выше, чем у любого другого метода. В принципе она более чем достаточна для определения патогена в минимальном количестве в любую фазу цикла (даже вне периода физиологической провокации, каковым считается его начало и конец), однако известно, что в моче встречаются ингибиторы полимеразной цепной реакции, концентрация которых зависит от фазы менструального цикла, что количество цервикальной слизи, обладающей ингибирующим эффектом, максимально в овуляторную фазу и т.д. Т.е. несмотря на применение диагностирующего метода повышенной чувствительности при его бездумном использовании получение достоверных результатов может стать недостижимым.

Заявленный способ реализуется в следующем порядке.

Вначале выявляют зависимость частоты выявления различных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, от временного интервала овариально-менструального цикла, с учетом сезонного изменения этого параметра (нумерация временных интервалов возрастает от начала овариально-менструального цикла, причем продолжительность 1, 9 и 10 интервалов задают равной четырем дням, а продолжительность остальных интервалов задают равной трем дням, при этом рассматривалась продолжительность овариально-менструального цикла, равная 33 дням).

Методологически это осуществляется путем проведения крупномасштабного исследования материала (соскобов, мазков из цервикального канала, влагалища, уретры), который получают известным образом, с соблюдением известных мер обеспечения стерильности (для получения материала используются одноразовые стерильные уретральные и цервикальные зонды - «щеточки» или «свабы» - ватные тампоны на стержне, либо стерильные ложки Фолькмана - по одной на каждую точку взятия материала), в разные фазы овариально-менструального цикла от женщин, обращающихся в женские консультации региона.

В процессе проведения работ соблюдают следующие правила взятия материала для исследования методом полимеразной цепной реакции:

- на протяжении одного месяца (в крайнем случае - двух недель) до взятия материала обследуемый должен отказаться от приема антибиотиков, различного рода биологически активных веществ. Перед исследованием нельзя использовать местные лекарственные средства (мази, свечи т.п.)

У женщин: Материал из цервикального канала берут после предварительного удаления (ватным тампоном, пинцетом) слизистой пробки. Несоблюдение этого правила может привести к ложноотрицательному результату. Необходимо соблюдать разумный баланс между получением достаточного количества исследуемого материала при соскобе и умеренной травматичностью.

При взятии материала из влагалища соскоба как такового не требуется - выявляемые микроорганизмы располагаются практически на поверхности эпителия (можно говорить о взятии методом мазка).

Из уретры пробу получают после массажа через влагалище путем прижатия уретры к внутренней поверхности лонного сочленения.

Из полости матки - берут эндометрий стерильным аспирационным наконечником или шприцем накануне очередной менструации, в объеме около 1 см³ (до отметки на пробирке - 1). Результат готовится 10 дней.

Осадок мочи - моча собирается обычным способом и центрифугируется, в контейнер переносится 1 см³.

У девочек: Материал берут из влагалища и уретры, при хламидиозе возможно исследование первой утренней порции мочи.

Особенности получения материала для выявления некоторых инфекций:

Хламидии. При взятии материала для исследования следует помнить, что оптимальным местом для персистирования С.trachomatis и ее интенсивного размножения являются определенные участки призматического эпителия мочеполовых путей и слизистая оболочка цервикального канала матки на глубине 1,5 см, а также уретра.

Контрольное исследование на хламидиоз должно проводиться не ранее чем через 1 месяц после прекращения терапии - время полного обновления призматического эпителия. При несоблюдении этого правила ДНК погибших хламидий, оставаясь внутри эпителиальных клеток, может дать ложноположительный результат.

Герпес. Вероятность выявления вируса простого герпеса многократно возрастает в период его репликации (который обычно совпадает с клиническим обострением). Поэтому (чтобы не получить ложноотрицательный результат) рекомендуется брать материал в период обострения инфекции из очага поражения на слизистых; в крайнем случае (вне периода явного обострения) - с поверхности обнаруживаемых дефектов слизистой (трещин, микроизъязвлений и т.п.)

Туберкулез. Материал для исследования у женщин - менструальная кровь, биоптаты эндометрия. Другой материал малоинформативен.

Хранение и доставка отобранного материала:

Зонд переносится в стерильный физраствор, находящийся в пластиковой пробирке, прополаскивается, отжимается о ее стенки. Пробирку герметически закрывают и передают регистратору, который маркирует ее и помещает в штатив (чистые пробирки и пробирки с материалом необходимо хранить раздельно, при наличии только одного холодильника в нем сохраняются пробирки с полученным материалом, а «чистые» пробирки можно хранить вне холодильника).

В отличие от микробиологического исследования, для полимеразной цепной реакции жизнеспособность возбудителя не является необходимой - чувствительность метода снижается лишь при распаде ДНК, что даже при комнатной температуре происходит далеко не сразу. Поэтому одноразовые пробирки транспортируются в обычных температурных условиях. Тем не менее, хранить полученный материал лучше в морозильной камере холодильника (это повышает чувствительность метода за счет разрушения ингибиторов полимеразы). В современных морозильных камерах, обеспечивающих температуру -20°С, материал сохраняется в течение месяцев.

Все анализы производят методом полимеразной цепной реакции с использованием однотипных тест-систем (разработчик - «ДНК-технология» - Россия, Москва). Длительный период исследований и большое число участников позволяют учесть влияние сезонного фактора на частоту выявления различных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем. Полученные сведения накапливают в компьютерной базе данных, где и проходит первичный анализ информации. Для обеспечения возможности одновременного исследования на несколько различных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, на основании упомянутых статистических данных рассчитывают интегральный показатель, средневзвешенную частоту обнаружения возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, который отражает вероятность выявления «среднестатистического» патогена в различные интервалы овариально-менструального цикла - см. фиг.1). На диаграмме совершенно определенно прослеживается более высокий уровень обнаружения возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в середине цикла. Закономерность просматривается еще отчетливее, если обратить внимание на линию тренда, полученную путем полиноминальной аппроксимации второго порядка. Вероятность обнаружения возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, при показателе определенности, равном R²=0,703, рассчитывается по формуле

У=-0,0015х²+0,0215х+0,0981,

или с более высокой точностью (R²=0,8039) вероятность детекции патогена можно определить с использованием уравнения полиноминальной аппроксимации шестого порядка

У=-0,000004х⁶+0,0002Х⁵-0,0032х⁴+0,0272х³-0,1166х²+0,245х-0,0459.

здесь у - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %;

х - порядковый номер интервала.

Названные показатели определенности вполне корректны с точки зрения практических задач (по критерию затраты-эффективность). При решении задач научно-исследовательского характера может быть задана и более высокая определенность, использование которой при решении обычных задач диагностики нерационально.

Для повышения достоверности оценки на основании этих же статистических данных рассчитывают интегральный показатель - средневзвешенная частота обнаружения возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, который отражает вероятность выявления «среднестатистического» возбудителя в различные периоды года.

Далее работы осуществляются следующим образом.

После обследования пациентки, при диагностировании гинекологического заболевания (выявлении воспалительного заболевания), предварительно определяют возможный перечень видов возбудителя этого вида инфекции, передаваемой половым путем (на основании известных диагностических признаков заболевания). Затем, зная текущий день цикла пациентки, в зависимости от конкретных условий выбирают выражение, по которому врач получает предполагаемый (основанный на данных объемного статистического исследования) процент обнаружения выбранного комплекса патогенов на выбранный период. С учетом этой информации назначают время отбора материала из половых органов, таким образом, чтобы оно приходилось на период максимальной частоты выявления данных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем. Далее в назначенный срок проводят отбор материала для анализа, после чего осуществляют лабораторное выявление возбудителя инфекций передаваемых половым путем. Методологически это осуществляется аналогично вышеупомянутой процедуре, т.е. отбираются пробы (соскобы, мазки из цервикального канала, влагалища), который получают известным образом, с соблюдением известных мер обеспечения стерильности, в соответствующие фазы овариально-менструального цикла, при этом анализы производят методом полимеразной цепной реакции с использованием однотипных тест-систем (разработчик - «ДНК-технология» - Россия, Москва).

Пример конкретного исполнения. С целью нивелирования влияния сезонных и прочих факторов, при выявлении в зависимости частоты выявления различных возбудителей инфекции передаваемой половым путем от временного интервала овариально-менструального цикла, с учетом сезонного изменения этого параметра было проведено объемное исследование материала (соскобы, мазки из цервикального канала, влагалища), который был получен в разные фазы овариально-менструального цикла от 18186 женщин, обратившихся в женские консультации г.Хабаровска в период с 1997 по 2002 г. Все анализы произведены методом полимеразной цепной реакции с использованием однотипных тест-систем ("ДНК-технология" - Россия, Москва). Длительный период исследований и большое число участников определили естественный характер рандомизации изучаемого материала, позволил не прибегать к специальным мерам организации порядка исследования. Полученные сведения накапливались в компьютерной базе данных MS Access 97 и MS Access 2000, где и проходил первичный анализ информации. Развернутую статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программы Statistica 5.11.

Для детекции комплекса инфекционных агентов, затем в зависимости от установленной статистическими методами вероятности их обнаружения выбиралось наиболее «удачное» время. Сам процесс отбора проб и их последующего анализа не отличался от известного и вышеописанного.

Способ относится к области медицины. Способ включает отбор материала из мочеполовых органов в период максимальной частоты выявления данного возбудителя и последующее лабораторное выявление возбудителя, отбор материала производят во время овариально-менструального цикла, в интервал времени, который определяют при заданном показателе определенности R², из уравнения, отражающего результаты предварительно проведенного в данном регионе исследования частоты выявления различных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в зависимости от временного интервала овариально-менструального цикла, с учетом сезонного изменения этого параметра, выражающего зависимость вероятности выявления возбудителей от порядкового номера одного из десяти интервалов, на которые разбит овариально-менструальный цикл, при этом нумерация интервалов времени возрастает от начала овариально-менструального цикла, причем продолжительность 1, 9 и 10 интервалов задают равной четырем дням, а продолжительность остальных интервалов задают равной трем дням, кроме того, используют молекулярно-биологические методы диагностики, предпочтительно метод полимеразной цепной реакции, и, при показателе определенности, равном R²=0,703 используют выражение: У=-0,0015х²+0,0215х+0,0981, где у - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %; х - порядковый номер интервала; и при показателе определенности, равном R²=0,8039 используют выражение: У=-0,000004х⁶+0,0002х⁵-0,0032х⁴+0,0272х³-0,1166х²+0,245х-0,0459, где у - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %; х - порядковый номер интервала. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность способа. 3 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ отбора материала для выявления возбудителя инфекции, передаваемой половым путем, заключающийся в отборе материала из мочеполовых органов и последующее лабораторное выявление возбудителя, отличающийся тем, что отбор проводят во время овариально-менструального цикла, в интервал времени, который определяют при заданном показателе определенности R², не меньшем 0,703, из уравнения полиноминальной аппроксимации результатов предварительно проведенного в данном регионе исследования частоты выявления различных возбудителей инфекции, передаваемой половым путем, в зависимости от временного интервала овариально-менструального цикла, выражающего зависимость вероятности выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, от порядкового номера одного из десяти интервалов, на которые разбит овариально-менструальный цикл, при этом нумерация интервалов времени возрастает от начала овариально-менструального цикла, причем продолжительность 1, 9 и 10 интервалов задают равной 4 дням, а продолжительность остальных интервалов задают равной 3 дням.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что расчет вероятности выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, при R²=0,703 производят по формуле У=-0,0015х²+0,0215х+0,0981,

где У - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %;

х - порядковый номер интервала.

У=-0,000004х⁶+0,0002х⁵-0,0032х⁴+0,0272х³-0,1166х²+0,245х-0,0459,

где У - вероятность выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, %;

х - порядковый номер интервала.