СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, может быть применено в комплексной диагностике хламидийных поражений мочеполовой системы.

В клинической практике с целью диагностики хламидиоза применяют методы, направленные на непосредственное определение возбудителя: прямая и непрямая иммунофлюоресценция, полимеразно-цепная реакция, иммуноферментное выявление антигена. К их недостаткам относят снижение информативности при диагностике инфекции верхних отделов урогенитального тракта, хронического процесса, для которого характерно наличие отграниченных лейкоцитарным валом кальцинированных и петрифицированных очагов воспаления. Для диагностики хламидиоза используют также и серологические методы. Суть их сводится к количественному определению специфических иммуноглобулинов класса М, А, и G к антигенам хламидий, фиксированных на твердой фазе (иммуноферментный анализ). Учитывая низкую иммуногенность хламидий, определяемые концентрации специфических антител находят лишь у 70-80% больных. Кроме того, гуморальный иммунитет при урогенитальном хламидиозе имеет скорее маркерное, нежели протективное значение [5] . Ведущая роль в осуществлении антихламидийной защиты принадлежит интерферонам и некоторым другим цитокинам, продуцируемым различными пулами клеток лейкоцитарного ряда. Таким образом, оценка их метаболической активности позволяет косвенно учесть реализацию этой функции. В настоящее время общепризнанной является точка зрения о необходимости комплексной диагностики хламидиоза с использованием 2-3 различных методик. Поэтому целесообразным представляется выработка принципиально новых подходов к диагностике урогенитального хламидиоза.

Известно, что метод люминол зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) успешно применяется для оценки ответа клеток на антигенную стимуляцию [2]. Показана целесообразность использования хемилюминесцентного анализа с целью индивидуального подбора иммунокорректоров [3], диагностики аллергии неинфекционного происхождения [4], изучения ответа фагоцитов на микробные клетки и отдельные их антигенные структуры [1, 6].

Целью изобретения является повышение точности диагностики урогенитального хламидиоза с учетом реакции лейкоцитарных клеточных систем макроорганизма на присутствие возбудителя, снижение экономических затрат на лабораторные исследования.

Поставленную цель решают за счет того, что исследуют уровень спонтанной и индуцированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов, используя в качестве второго индуктора лизат элементарных телец хламидий (комплексный специфический антиген), рассчитывают индексы хемилюминесценции по зимозану (ИХЛ-з) и специфическому антигену (ИХЛ-аг) как отношение стимулированной хемилюминесценции к спонтанной, при значениях 21,35≤ИХЛ-з≤И,41 и 0,53≤ИХЛ-аг≤1,00 подозревают хроническую хламидийную инфекцию, а при ИХЛ-з<21,35 и ИХЛ-аг>1,00 диагностируют хламидиоз.

Способ осуществляют следующим образом. Венозную кровь (4 мл) обследуемого забирают в центрифужную пробирку, хорошо перемешивают с 80 ЕД гепарина и 1 мл полиглюкина. Для осаждения эритроцитов смесь инкубируют при 37^oС в течение 20 мин и 20 мин при комнатной температуре. Лейкоцитарный супернатант переносят в чистую центрифужную пробирку, доводят объем 0,1% раствором желатина на реактиве Хенкса без индикатора до 7 мл и дважды отмывают в течение 7 мин при 1000 об/мин. По окончании последнего центрифугирования супернатант удаляют, а осадок разводят в 2 мл раствора Хенкса, производят подсчет клеток в камере Горяева и доводят их концентрацию до 4 млн/мл. Для определения спонтанной хемилюминесценции в кювету хемилюминометра вносят 250 мкл клеточной суспензии, 100 мкл люминола в концентрации 10^-5 М и 650 мкл реактива Хенкса; для определения реакции на неспецифический антиген (опсонизированный зимозан) - 250 мкл клеточной суспензии, 40 мкл пуловой донорской IV (АВ) группы сыворотки, 50 мкл зимозана (2 мг/мл), 100 мкл люминола и 560 мкл раствора Хенкса; для определения специфического ответа - 250 мкл клеточной суспензии, 250 мкл раствора лизата ЭТ хламидий в разведении 1:400, 40 мкл пуловой сыворотки, 100 мкл люминола и 360 мкл раствора Хенкса. Измерения проводили на серийном медицинском хемилюминометре CL-3606 ("Биофизика", Красноярск), предназначенном для исследования сверхслабых свечений биологически активных объектов в спектральной области 200 - 650 нм. Прибор выполнен в виде единого конструктива и работает под управлением ПЭВМ типа IBM Pentium 166. В качестве детектора в установке используют 24-разрядный счетчик импульсов ФЭУ-85. В рабочем режиме установки напряжение питания для ФЭУ-85 составляет 1500 В, световая чувствительность фотокатода 9х10 ехр^-5, энергетический эквивалент собственных шумов 0,85 КэВ. Кюветы помещают в термостатируемый барабан с температурой 37,0^o С. Время измерения одной точки хемилюминесцентной кривой составляет 0,1 сек, минимальное число точек измерения на каждую кривую -1, общее время измерения - 90 мин. Графическую информацию подвергали математической обработке с помощью прилагаемого программного обеспечения функцией полинома 5 степени, после чего рассчитывали максимумы спонтанной и индуцированной ХЛ. С целью интегральной оценки результатов вычисляли индексы ХЛ как отношение индуцированной хемилюминесценции к спонтанной по зимозану (ИХЛ-з) и хламидийному антигену (ИХЛ-аг).

Способ был применен на базе поликлиники Красноярского краевого кожно-венерологического диспансера. Обследован 61 больной хроническим урогенитальным хламидиозом в различных стадиях инфекционного процесса и 14 человек контрольной группы без хламидиоза в анамнезе. Установлено, что при спонтанной активности лейкоцитов 2430,86±426,48 в контрольной группе добавление специфического антигена ингибировало их хемилюминесценцию, так что ИХЛ-аг= 0,51±0,02. Спонтанная ЛЗХЛ и ИХЛ-аг у больных хроническим урогенитальным хламидиозом статистически значимо повышаются по мере активации инфекции (см. табл. 1). Достоверное, в сравнении с контролем, снижение ИХЛ-з свидетельствует о текущем инфекционном процессе и указывает на специфичность реакции с комплексным хламидийным антигеном.

Пример 1. Больной Н., 28 лет. Поступил с жалобами на выделения из уретры по утрам слизистого характера, рези при мочеиспускании, периодические ноющие боли в промежности. В анамнезе 2 года назад лечился по поводу хламидийного уретропростатита, на контроль излеченности не явился. После проведения хемилюминесцентного анализа (ИХЛ-з = 18,23, ИХЛ-аг = 1,34) у больного диагностирован хронический хламидиоз. Данные ультразвукового исследования свидетельствовали о поражении предстательной железы. Диагноз урогенитального хламидиоза был впоследствии подтвержден обнаружением возбудителя методом прямой иммунофлюоресценции. Лечение скорректировано по методикам терапии хламидийного уретропростатита.

Выводы:
1. Использование в реакции ЛЗХЛ в качестве индукторов лизата элементарных телец хламидий и опсонизированного зимозана позволяет установить наличие хламидийной инфекции без непосредственного определения возбудителя в совокупности с оценкой нарушений функционального состояния полиморфноядерных лейкоцитов.

2. Предложенный метод способствует повышению точности диагностики хламидиоза, отличается простотой, высокой чувствительностью, обеспечивает объективную аппаратную регистрацию результатов и не требует использования дорогостоящих реактивов.

3. Метод позволяет учесть реакцию макроорганизма на присутствие инфекционного агента, может быть использован у больных хроническими, застарелыми формами, инфекцией верхних отделов урогенитального тракта, при различных стадиях инфекционного процесса.

ЛИТЕРАТУРА
1. Лобашевский А.Л., Давыдова Н.В. Методические подходы к изучению хемилюминесценции клеток // Клин. и лабор. диагн. - 1992. - 11-12. - с.54 - 58.

2. А. В. Резайкина, Л.Ф. Знаменская, М.X. Колиева и др. Скрининг иммуномодуляторов хемилюминесцентным методом in vitro. // Вестн. дерматол. и венерол. - 1996. - 3. - с.65.

3. Резайкина А. В., Колиева М.Г., Куршакова Т.С., Федоров С.М. Хемилюминесцентный анализ нейтрофилов при скрининге иммуномодулирующих препаратов у больных простым рецидивирующим герпесом // Вестн. дерматол. и венерол -1995. - 2. - с.12-14.

4. Резайкина А. В. , Самсонов В.А., Яшин М.М. Хемилюминесцентный метод диагностики аллергии неинфекционного происхождения у больных атопическим дерматитом. // Вестн. дерматол. и венерол. - 1996. - 4. - с 4 - 7.

5. Ремезов А. П. , Неверов В. А. , Семенов Н.В. Хламидийные инфекции (клиника, диагностика, лечение) // С.-Пб. - 1995. - с.19 - 28.

6. Савченко А.А., Куртасова Л.М., Шакина Н.А. и др. Применение хемилюминесцентного анализа для оценки функциональной активности лейкоцитов крови у детей с иммунопатологическими состояниями: метод, реком. для врачей. // Красноярск - 1998. -18 С.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии. В способе определяют уровень спонтанной и индуцированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов, используют лизат элементарных телец хламидий, рассчитывают индексы хемилюминесценции по зимозану и специфическому антигену как отношение стимулированной хемилюминесценции к спонтанной, при значениях 21,35≤ИХЛ-3≤31,41 и 0,53≤ИХЛ-aг≤1,00 диагностируют хроническую хламидийную инфекцию. Способ обеспечивает повышение точности диагностики урогенительного хламидиоза, позволяет учесть реакцию макроорганизма, отличается высокой чувствительностью и не требует использования дорогостоящих реактивов. 1 табл.

Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза, включающий определение реакции лейкоцитов макроорганизма на присутствие инфекционного агента путем исследования спонтанной и стимулированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют лизат элементарных телец хламидий, рассчитывают индексы хемилюминесценции к спонтанной и при значениях 21,35≤ИХЛ-з≤31,41 и 0,53≤ИХЛ-aг≤1,00 диагностируют хронический урогенитальный хламидиоз.