ГАЛАКТОМАННАНООЛИГОСАХАРИДЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, А ТАКЖЕ ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2006 года по МПК C12P19/04 C12N9/42 A61K31/715 A23L1/308 C12R1/125 

Настоящее изобретение относится к галактоманноолигосахаридам, способу их получения, а также их применению в пищевых продуктах и лекарственных средствах.

Постоянно существует потребность в получении из растительного природного сырья биологически активных веществ и/или добавок для пищевых продуктов и/или лекарственных средств. Это объясняется как высокой приемлемостью потребителем сырья, получаемого из природных источников, так и совместимостью их получения с окружающей средой. Маннаны и их производные, как глюкоманнан и галактоманнан, представляют собой такого рода природное сырье. Маннаны представляют собой полиозы, которые состоят из маннозы вместо глюкозных структурных единиц. Маннозные цепи состоят из β-1,4-связанных маннозных структурных единиц. Галактоманнаны, наряду с β-1,4-связанными маннозными структурными единицами, включают вместе с тем α-1,6-связанные галактозные структурные единицы, следовательно, состоят из маннозных и галактозных структурных элементов. Такого рода галактоманнаны получают в виде гуаровой камеди, камеди кассии коричной и камеди плодов рожкового дерева и используют, например, в качестве загустителей в пищевой промышленности и в качестве вспомогательных для таблетирования средств в фармацевтической промышленности ("Industrial Gums", R.L.Whistler und J.N. BeMiller, Herausgeber, 3. Auflage, 1992, Academic Press, New York). Галактоманнаны из разных источников различаются по существу своим относительным содержанием маннозы и галактозы.

Для получения пригодного для пищевых продуктов сырья полиозы часто расщепляют до меньших структурных единиц. Так, известен гидролиз полисахаридов с помощью разбавленных кислот при различных температурах. Гидролиз галактоманнанов приводит к смеси мономеров, следовательно, маннозы и галактозы.

Получаемая из Aspergillus niger эндо-β-маннаназа (Е.С. 3. 2.1.78) известна тем, что ферментативно гидролизует галактоманнан (Н.Uhlig "Enzyme arbeiten für uns", Carl Hanser, München, Wien, 1991). Этот фермент, однако, неспособен гидролизовать галактоманнан из гуаровой камеди, в то время как галактоманнан из камеди плодов рожкового дерева гидролизуется только частично. В зависимости от происхождения галактоманнаны, следовательно, обладают различной склонностью к гидролизу.

Из работы Ajisaka et al. ("Carbohydrate Research", 270, 123- 130 (1995)) известен способ, который позволяет осуществлять ферментативный синтез маннобиозы и маннотриозы с помощью выделенной из Aspergillus niger α-маннозидазы. Этот синтез, который осуществляется путем инверсии нормальной реакции гидролиза фермента, протекает с технологически неприемлемыми выходами около 2%. Продукты не содержат никаких галактозных структурных единиц.

Из работы К. Newman ("Biotechnology in the Feed Industry", Proc. Of Alltech's 10^th Symposium (1994), 167-174) известен получаемый из клеточной стенки дрожжей глюкоманнобелковый комплекс, который специфически связывает специфичные к маннозе лектины патогенных микроорганизмов. Так как этот продукт не содержит никаких галактозных структурных единиц, он не может опосредовать никакого связывания со специфичными к галактозе микробными лектинами.

Задача настоящего изобретения состоит в получении веществ из галактоманнана, а также в разработке способа их получения, которые оздают преимущественные возможности применения в области фармацевтики и технологии пищевых продуктов.

Поставленная задача решается способом получения содержащих маннозу и галактозу олигосахаридов из галактоманнанов, при этом готовят водный раствор или суспензию галактоманнана, осуществляют гидролиз за счет происходящей из бактерий ферментативной активности, в особенности при использовании происходящего из бактерий ферментативного агента, и получают смесь содержащих маннозу и галактозу олигосахаридов со степенью полимеризации (DP) <15, в особенности от 2 до 7. Поставленная задача решается также путем получения такого рода галактоманноолигосахаридов, включающих β-1,4-связанные маннозные структурные единицы и α-1,6-связанные с ними галактозные структурные единицы со степенью полимеризации <15, в особенности от 2 до 7. Эти галактоманноолигосахариды неожиданным и преимущественным образом отличаются тем, что при применении в составе или в качестве пищевых продуктов, вкусовых продуктов и лекарственных средств они позволяют осуществлять профилактику и лечение заболеваний, а также вообще способствуют улучшению состояния здоровья.

Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды в особенности отличаются тем, что они снижают гликемический индекс вкусовых и пищевых продуктов, позволяют бороться с инфекционными заболеваниями и/или предотвращать их, поскольку они предотвращают или уменьшают аккумуляцию патогенных микроорганизмов в человеческих и животных эпителиальных клетках, позволяют бороться и/или предотвращать воспалительные хронические кишечные заболевания, противодействуют возникновению рака кишки, соответственно рака толстой кишки, и/или позволяют бороться с ними, усиливают иммунный ответ против общих инфекций, модулируют иммунную защиту и тем самым позволяют бороться и/или предотвращать воспалительные заболевания и повышают поступление кальция и благодаря этому противодействуют в особенности остеопорозу.

В связи с настоящим изобретением под заболеванием понимают нарушение жизненных процессов в органах или во всем организме, которые вызывают субъективно ощутимые или объективно устанавливаемые телесные, умственные или психические изменения. В связи с настоящим изобретением под заболеванием понимают также состояния дефицита.

В связи с настоящим изобретением под биологически активным веществом понимают вещество, которое в живом организме или его частях вызывает биологическое действие. Под лекарственным веществом понимают биологически активное вещество, которое может служить для профилактики, облегчения, лечения или распознавания заболеваний. Под лекарственным средством понимают предназначенную для применения в случае людей или животных готовую препаративную форму лекарственных веществ.

В связи с настоящим изобретением под продуктом питания или пищевым продуктом понимают служащее первично для поддержания жизненных функций средство, в то время как под вкусовым продуктом понимают служащее первично для возникающего при его приеме хорошего самочувствия средство.

Настоящее изобретение, следовательно, относится к содержащим маннозу и галактозу олигосахаридам, называемым также как галактоманноолигосахариды, со степенью полимеризации (DP) <15, в особенности со степенью полимеризации от 2 до 7, причем маннозные структурные единицы связаны в положении β-1,4 и галактозные структурные единицы связаны с маннозными структурными единицами в положении α-1,6. Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды стабильны по отношению к гидролитическим условиям в области рта, желудка и тонкой кишки и, таким образом, по существу неизмененными могут попадать в толстую кишку и там проявлять свое желательное оздоровительное действие.

Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды не только сами стабильны в гидролитических условиях в тонкой кишке, но они даже ингибируют постоянные мукозные α-глюкозидазы (глюкоамилаза/мальтаза и сахараза/изомальтаза). Поэтому их согласно изобретению можно использовать для снижения гликемического индекса вкусовых и пищевых продуктов.

Согласно изобретению предлагаемые в настоящем изобретениии галактоманноолигосахариды также способны снижать или предотвращать аккумуляцию патогенных микроорганизмов в эпителиальных клетках и благодаря этому предотвращать инфекционные заболевания, а также служить лекарственным средством при их протекании. Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды к тому же стимулируют слизистую секрецию из бокаловидных клеток в кишечнике и поэтому положительно влияют на протекание различных кишечных заболеваний.

Как упоминалось, предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды в тонкой кишке не гидролизуются, а попадают неизмененными в толстую кишку, где они затем ферментируются находящимися там микроорганизмами до короткоцепочечных жирных кислот, в особенности бутирата. Происходящее вследствие этой ферментации снижение значения рН ухудшает условия жизни для вредных микроорганизмов, как клостридии, и одновременно улучшает условия жизни для полезных бифидобактерий и лактобацилл. Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды, следовательно, обладают предбиотическим действием. За счет описанного повышенного образования бутирата может происходить уменьшение, соответственно, предотвращение появления и роста раковых заболеваний толстой кишки.

Наконец, предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды являются полезными, поскольку они повышают поступление кальция в область кишечника из неорганических компонентов пищи и, таким образом, применимы при профилактике и предотвращении остеопороза, в особенности первичного остеопороза, как постменопаузальный или старческий остеопороз или вторичный остеопороз.

Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды, наконец, предпочтительно используют также, поскольку они вступают непосредственно во взаимодействие с клеточной иммунной системой, при этом они, с одной стороны, усиливают иммунную защиту и, с другой стороны, модулируют иммунный ответ таким образом, что воспалительные процессы ослабляются или подавляются.

Изобретение относится поэтому также к вкусовым продуктам, продуктам питания или пищевым продуктам, а также к так называемым функциональным продуктам питания, которые содержат предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды. Такого рода пищевыми продуктами могут быть, например, молочные продукты, как масло, йогурт, творог, хлебобулочные изделия, супы и соусы в порошке, намазываемые на хлеб продукты, маргарин, хлебопекарные жиры, смеси пряностей, конфитюры, безалкогольные напитки и т.д. Вкусовые продукты могут представлять собой, например, твердые или мягкие карамели, жевательные резинки, шоколад, мюсли, кондитерские изделия, мороженое, конфетные изделия пенообразной структуры, драже, алкогольные и безалкогольные напитки и т.д.

Изобретение относится также к лекарственным средствам, которые содержат предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды, в случае необходимости, вместе с фармакологически пригодными носителями, добавками и вспомогательными веществами, в фармацевтически эффективном количестве. Такого рода носителями, вспомогательными веществами или добавками могут быть, например, антиадгезивы, смазки, загустители, стабилизаторы, эмульгаторы, консерванты, лецитин, интенсивно сладкие вещества, подслащивающие средства, красители, вкусовые вещества, ароматизаторы, наполнители, и т.д.

Лекарственные средства могут находиться, например, в виде пастилок, капсул, таблеток, драже, суппозиториев, растворов, суспензий, эмульсий, растворов для инъекций, растворов для внутривенного введения, капель, соков, мазей, кремов, гелей, аэрозолей, лекарственной формы для ингаляций или других обычных форм применения.

Изобретение относится также к применению галактоманноолигосахаридов согласно изобретению в способе хирургической или терапевтической обработки организма человека или животного. Изобретение относится, наконец, также к применению предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов для профилактики или лечения сахарного диабета II, инфекционных заболеваний, кишечных заболеваний, рака толстой кишки, воспалительных заболеваний и остеопороза, а также к применению предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов для получения лекарственного средства в вышеуказанных целях.

Изобретение относится также к способу получения предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов, при этом готовят водный раствор или суспензию галактоманнана из содержащего галактоманнан сырья, в особенности из гуаровой камеди, например, набухающей муки из зернобобовых, камеди кассии коричной, камеди плодов рожкового дерева, гидролизуют при использовании происходящей от бактерий ферментативной активности, в особенности при использовании происходящего от бактерий ферментативного агента, и получают водный раствор смеси из содержащих маннозу и галактозу олигосахаридов со степенью полимеризации <15, предпочтительно от 2 до 7. Из водного раствора продукта получают сухую смесь продукта, например, путем распылительной сушки.

Согласно изобретению, следовательно, предлагается неожиданное техническое решение, заключающееся в том, что с помощью происходящей от бактерий ферментативной активности галактоманнаны из содержащего их сырья, например из гуаровой камеди, камеди кассии коричной и камеди плодов рожкового дерева, можно гидролизовать с соответственно одинаковой высокой эффективностью до предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов.

Концентрация галактоманнанов в водном растворе составляет предпочтительно 1-5%, значение рН составляет предпочтительно 5-8 и температура раствора предпочтительно равна 30-40°С.

В связи с настоящим изобретением под ферментативно действующим агентом понимают полностью или частично очищенный фермент или неочищенный экстракт из бактерий, в особенности клеток бацилл или живых или инактивированных бактерий, которые могут гидролизовать галактоманнаны в особенности до галактоманноолигосахаридов со степенью полимеризации <15, предпочтительно от 2 до 7. Неочищенные экстракты можно получать с помощью обычных способов, как механический способ переведения в удобное для переработки состояние, например, шаровые мельницы. Френч-пресс; химические или электрические способы переведения в удобное для переработки состояние, например, создание электрических полей или также путем ультразвуковой обработки.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения используют бактерии рода Bacillus subtilis, в особенности штамм Bacillus subtilis с номером депонирования DSM 13182, депонированный 06.12.1999 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур в Брауншвейге.

Само собой разумеется, используемые бактерии могут быть естественно встречающимися или измененными путем генной инженерии бактериями, в особенности бациллами. Используемые бактерии, например, могут обладать резистентностями против определенных антибиотиков, что позволяет таким образом осуществлять особенно простое получение ферментативно действующего агента. Происходящий от бактерий фермент может быть природного происхождения, соответственно, иметь аминокислотную последовательность дикого типа, однако он также может иметь аминокислотные различия по сравнению с естественно существующим ферментом, например, делеции, инсерции, инверсии, замены или встраивания аминокислот, также необычные аминокислоты. Фермент в случае необходимости также может обладать модификациями, как гликозилирования или подобное. Фермент может также находиться в виде слитого белка с другим белком или пептидом или в виде ферментного фрагмента, пока он способен гидролизовать галактоманнаны до вышеуказанных продуктов.

Изобретение относится также к применению ферментативно действующего агента для гидролиза галактоманнана, причем ферментативно действующий агент можно использовать для гидролиза в свободной или иммобилизированной форме. Так, согласно изобретению гидролиз можно осуществлять с помощью покоящихся клеток бактерий, предпочтительно Bacillus subtilis. Можно также предусмотреть сначала иммобилизацию клеток на стабильной инертной матрице и использование таким образом получающегося биокатализатора для гидролиза галактоманнана. Согласно изобретению можно иммобилизировать как ферменты, бактерии, так и неочищенный экстракт. Иммобилизацию можно осуществлять путем связывания с носителем, сшивки, включения или инкапсуляции. Сшивку можно осуществлять, например, с помощью глутарового альдегида. Связывание с носителем может происходить за счет адсорбционной или ковалентной связи, в то время как для включения используют, например, полупроницаемые мембраны в форме гелей, микрокапсул или волокон. Инкапсулированные ферменты или микроорганизмы с помощью полупроницаемой мембраны отделяют от окружающего раствора субстрата и продукта.

Изобретение относится также к вышеуказанному способу, при этом получаемую смесь из содержащих маннозу и галактозу олигосахаридов подвергают хроматографическому способу разделения, в случае которого можно получать желательные олигосахариды с определенной степенью полимеризации.

Дальнейшие предпочтительные варианты осуществления изобретения следуют из зависимых пунктов формулы изобретения.

Изобретение поясняется подробнее с помощью следующих примеров.

Пример 1

Получение биокатализатора

Субкультуру штамма Bacillus subtilis SZ 100 (DSM 13182) из культуры на косом агаре вносят во встряхиваемую колбу со средой, состоящей из казеинового пептона (15 г/л), пептона соевой муки (5 г/л), NaCl (5 г/л) и гуаровой камеди (1 г/л), и инкубируют в течение 24 часов при встряхивании при температуре 30°С.

После этого выращиваемую при постоянном встряхивании культуру переносят в ферментер емкостью 10 л и в среде того же состава культивируют далее как выращиваемую при постоянном встряхивании культуру.

После фазы роста в течение 24 часов клетки отделяют путем центрифугирования, ресуспендируют в 3%-ном растворе альгината натрия и затем при перемешивании вносят по каплям в 2%-ный раствор хлорида кальция. Образовавшиеся нагруженные клетками Bacillus subtilis (DSM 13182) шарики альгината кальция (биокатализатор) промывают, высушивают и хранят в холодном состоянии.

Пример 2

Гидролиз гуаровой камеди

Полученный согласно примеру 1 биокатализатор подвергают набуханию в водном растворе гуаровой камеди (концентрация 1-5%) и заполняют им термостатированную при температуре 37°С колонку. Гидролиз гуаровой камеди проводят затем непрерывно путем пропускания раствора гуаровой камеди через колонку. За протеканием процесса гидролиза следят аналитически с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в отношении содержания моно-, олиго- и полисахаридов и получают следующий состав:

Моносахариды2%Олигосахариды70%Полисахариды28%

Гидролиз можно осуществлять также полунепрерывно или периодически. Затем полученный согласно примеру 1 биокатализатор в реакторе с перемешиванием вводят в контакт с раствором гуаровой камеди.

Для гидролиза также можно использовать ферментный неочищенный экстракт из Bacillus subtilis (DSM 13182). Для этого биомассу после ферментации выделяют путем центрифугирования, ресуспендируют в фосфатном буфере и затем переводят в удобную для переработки форму (ультразвук. Френч-пресс, шаровая мельница и т.д.). Клеточный дебрис удаляют путем центрифугирования и таким образом полученный неочищенный экстракт без дальнейшей очистки добавляют к гидролизуемому раствору гуаровой камеди.

Полученный после соответствующего гидролиза водный раствор, наряду с желательными галактоманноолигосахаридами со степенью полимеризации <15, в особенности со степенью полимеризации от 2 до 7, содержит также незначительную долю более высокомолекулярных компонентов. Их можно очень легко удалять с помощью известных способов разделения, например, путем хроматографии на нагруженных кальцием сильнокислых катионообменниках, или путем ракционного спиртового осаждения, или ультрафильтрации, так что получают галактоманноолигосахариды со степенью полимеризации 2-7 в чистой форме в водном растворе, из которого их можно получать в сухом состоянии с помощью известных способов (например, путем распылительной сушки).

Пример 3

Стабильность галактоманноолигосахаридов во рту, желудке и тонкой кишке Стабильность в области рта

Стабильность полученных согласно примеру 2 олигосахаридов согласно изобретению против флоры рта исследовали с помощью встречающихся в области рта штаммов бактерий Streptococcus mutans DSM 20523 и Streptococcus sobrinus NCTC 10922, а также с помощью свежего зубного налета.

Streptococcus mutans и Streptococcus sobrinus культивировали в жидкой среде DSM 92 в анаэробных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С. По окончании логарифмической фазы роста клетки отделяли путем центрифугирования в течение 15 минут при ускорении 4000 g и ресуспендировали в 10%-ном растворе первоначального 20 мМ карбонатного буфера, рН 7,5. Затем 9 мл раствора предлагаемых согласно изобретению олигосахаридов (1%-ный раствор в 20 мМ карбонатном буфере, рН 7,5) инфицировали с помощью 1 мл суспензии бактерий и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С. В различные моменты времени отбирали пробы и исследовали на содержание в них олигосахаридов (результаты см. ниже).

У трех мужчин-добровольцев, которые три дня не чистили свои зубы, отбирали пробы налета и в каждом случае 10 мг налета суспендировали в 1 мл раствора олигосахарида (1%-ный раствор в 20 мМ карбонатном буфере, рН 7,5). В течение двухчасовой инкубации при температуре 37°С отбирали текущие пробы и исследовали на содержание в них олигосахаридов.

Результат:

В то время как совместно вводимая в качестве контроля сахароза в течение 120 минут как за счет обоих штаммов стрептококков, так и за счет смешанной культуры налета полностью была подвергнута гидролизу, разложения предлагаемых согласно изобретению олигосахаридов также спустя 2 часа нельзя было обнаружить.

Стабильность в желудке

О стабильности вещества при прохождении через желудок можно судить путем определения степени гидролиза при рН 1,0, соответственно, 2,0 и путем сравнения с сахарозой в качестве контроля.

Для этого 1%-ные растворы галактоманноолигосахаридов инкубировали при значении рН 1,0 (0,1 М HCl) и значении рН 2,0 (0,01 М HCl) в течение 3 часов при температуре 37°С. Из реакционной смеси спустя 60, 120 и 180 минут отбирали пробы и анализировали их посредством НРАЕС. При этом использовали сахарозу и 1-кестозу в качестве контрольных веществ.

Таблица I
Результаты Данные в виде степени гидролиза в %:ВеществорНВремя инкубации (минуты)  60120180сахароза1245561 21271-кестоза190100100 2163043галактоманноолигосахариды1<1<1<1 2<1<1<1

Из таблицы I видно, что галактоманноолигосахариды без ущерба могут выдерживать прохождение через желудок.

Стабильность против ферментов поджелудочной железы

Секрет поджелудочной железы содержит большое количество гидролаз, в том числе также расщепляющие углеводы ферменты, как α-амилаза, которая расщепляет α-1,4-глюканы (крахмал, гликоген) предпочтительно до мальтозы и мальтоолигосахаридов.

Исследование стабильности галактоманноолигосахаридов против ферментов поджелудочной железы осуществляли следующим образом:

Необходимые растворы.

20 мМ натрийфосфатный буфер, рН 7,0, плюс 6 мМ NaCl (раствор 1);

1%-ный раствор крахмала (растворимый крахмал по Zulkowski) в растворе 1;

1%-ный раствор галактоманноолигосахаридов в растворе 1;

0,2% раствор панкреатина (фирмы Sigma) в растворе 1.

Таблица II
Реакционные смеси:КомпонентыПробаКонтрольраствор галактоманноолигосахарида3, 0 мл-раствор крахмала-3,0 млраствор фермента0,1 мл0,1 мл

После инкубации в течение 210 минут в термомиксере (периодические встряхивания) при температуре 37°С реакцию прекращали путем нагревания в течение 15 минут при температуре 95°С и пробы анализировали посредством НРАЕС. При этом содержащие крахмал пробы прежде полностью гидролизовали путем нагревания в течение 3 часов в 1 М HCl при температуре 95°С.

Таблица III
Результаты:ВеществоСтепень деструкции (%)крахмал77галактоманноолигосахарида0

Из таблицы III видно, что ферменты поджелудочной железы не разрушают предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды.

Пример 4

Деструкция за счет α-глюкозидаз тонкой кишки

Находящиеся в тонкой кишке постоянные для слизистой оболочки ферментные комплексы сахараза/изомальтаза и глюкоамилаза/мальтаза in vivo способствуют расщеплению попавших в тонкую кишку дисахаридов мальтозы и сахарозы и отчасти также мальтоолигосахаридов до моносахаридов и в качестве таковых через стенку кишки могут попадать в систему кровообращения.

Исследование стабильности предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов против этих ферментов осуществляли следующим образом.

Выделение фермента:

Ферментные комплексы сахараза/изомальтаза (СИ-комплекс) и глюкоамилаза/мальтаза (ГМ-комплекс) выделяли из тонкой кишки свиньи по методу Н.Heymann (Dissertation, Hannover, 1991).

Деструкцию предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов с помощью f-глюкозидаз тонкой кишки определяли следующим образом.

Необходимые растворы:

0,1 М буфер на основе триэтаноламина (TRA), рН 7,0;

1%-ный раствор галактоманноолигосахаридов в TRA-буфере;

1%-ный раствор мальтозы, соответственно, сахарозы, в качестве контрольных веществ, в TRA-буфере;

фермент слизистой оболочки, растворенный в TRA-буфере.

Реакционная смесь:

К 1,2 мл термостатированного при температуре 37°С раствора углевода во время t=0 добавляли 0,7 Ед. ферментного комплекса сахараза/изомальтаза, соответственно, глюкоамилаза/мальтаза, смешивали и инкубировали при температуре 37°С. Реакцию прекращали спустя 2 часа путем нагревания в течение 15 минут при температуре 95°С. Образовавшиеся моносахариды, а также используемые тестируемые вещества количественно определяли посредством НРАЕС.

Таблица IV
Результаты:УглеводФерментный комплексСтепень гидролиза (%)сахарозаСИ98мальтозаСИ95мальтозаГМ96галактоманноолигосахаридыСИ<1галактоманноолигосахаридыГМ<1

Результаты показывают, что в выбранных условиях почти полного гидролиза сахарозы, соответственно, мальтозы в случае ферментного комплекса СИ, а также мальтозы в случае ферментного комплекса ГМ галактоманноолигосахариды обоими ферментными комплексами практически не расщепляются.

Пример 5

Деструкция с помощью выделенных ферментных комплексов (комплекс СИ и комплекс ГМ)

Выделенные ферментные комплексы сахараза/изомальтаза (комплекс СИ) и глюкоамилаза/мальтаза (комплекс ГМ) из тонкой кишки свиньи (см. пример 4) тестировали путем исследования в отношении ингибирования при использовании предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов в присутствии субстратов сахарозы, соответственно, мальтозы в случае комплекса СИ и мальтозы в случае комплекса ГМ. Соотношение субстрат:ингибитор во всех случаях составляло 10:1.

Исходная смесь: - 0,7 мл 1,43%-ного раствора субстрата в 0,1 М натрийфосфатном буфере, рН 7,0;  - 0,1 мл 1%-ного раствора галактоманноолигосахаридов;  - 0,1 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, рН 7,0.Предынкубация:15 минут, температура 37°С;  отбор нулевой пробы.Инициирование:0,1 мл раствора фермента (0,5 Ед./мл активности мальтазы в смеси).Отбор проб:по 0,15 мл пробы спустя 30 и 60 минут.Прекращение реакции:2 минуты при температуре 95°С.Анализ:НРАЕС, стандартный раствор: по 10 ч/млн.глюкозы, фруктозы, по 20 ч/млн, сахарозы, мальтозы.

Таблица V
Результат:Ингибирование, %Продолжительность инкубации 30 минут60 минутСИ/сахароза2425СИ/мальтоза2618ГМ/мальтоза00

Как можно видеть из таблицы V, расщепление сахарозы, соответственно, мальтозы с помощью ферментного комплекса СИ ингибируется в присутствии галактоманноолигосахаридов. На расщепление мальтозы комплексом ГМ, напротив, не влияют за счет добавки галактоманноолигосахаридов.

Пример 6

Предотвращение аккумуляции патогенных микроорганизмов в эпителиальных клетках

Эпителиальные клетки

Человеческие уроэпителиальные клетки, получаемые путем центрифугирования из утренней мочи.

Микроорганизмы

Staphylococcus aureus, 2 штамма, и Е.coli, 2 штамма, соответственно, в виде суспензии с 10⁹ микроорганизмов/мл.

Осуществление теста

Эпителиальные клетки и суспензию микроорганизмов объединяли и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С. Затем эпителиальные клетки отделяли от не прилипших микроорганизмов путем фильтрации через мембранный фильтр (8 микрон). Фильтры многократно промывали, вносили в физиологический раствор хлорида натрия и суспендировали в нем эпителиальные клетки. После центрифугирования суспензии в растворе хлорида натрия осадок после центрифугирования наносили на предметное стекло и окрашивали по May-Grünwald и Giemsa. Подсчитывали количество прилипших к 50 эпителиальным клеткам микроорганизмов. Это число дает холостое значение. В качестве контроля служили эпителиальные клетки без добавки суспензии микроорганизмов.

Согласно основному опыту, эпителиальные клетки сначала инкубировали с растворами галактоманноолигосахаридов различных концентраций в течение 1, 2, соответственно, 3 часов. Затем их объединяли с суспензией микроорганизмов и обрабатывали дальше, как описано выше. Подсчет прилипших микроорганизмов к 50 эпителиальным клеткам дает измеряемое значение.

Результат:

В случае используемых в качестве сравнения "нейтральных" углеводов, как, например, рафиноза, нистоза и изомелецитоза, не установлено никакого уменьшения аккумуляции микроорганизмов в эпителиальных клетках. С помощью предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов была почти полностью (блокирование >95%) предотвращена адгезия всех тестируемых микроорганизмов.

Пример 7

Повышение слизистой секреции в толстой кишке

Из подвергнутой резекции толстой кишки свиньи свежего убоя после тщательной очистки вырезали куски величиной 1 см² из дистального участка. Таким образом препарированные куски инкубировали в буфере Хэнкса, к которому были добавлены по 50 мкг/мл хлорамфеникол и ампициллин, при аэрации кислородом и перемешивании в течение 5 часов при температуре 37°С. Буфер содержал, кроме того, 1% тестируемых на их стимулирующее воздействие в отношении слизистой секреции получаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов. Использовали, соответственно, 10 кусков кишки для контроля в тестируемой исходной смеси. Одна из исходных смесей содержала обычно применяемый для терапии воспалительных кишечных заболеваний гидрокортизон.

В качестве меры повышения слизистой секреции определяли увеличение общего содержания углеводов в супернатанте. Для этого во время инкубации в различные моменты времени отбирали пробы, добавляли, соответственно, к 10 мкл пробы 20 мкл раствора резорцина (6 мг/мл) и 100 мкл 75%-ной серной кислоты и после инкубации в течение 60 минут при температуре 80°С измеряли экстинкцию при длине волны 450 нм.

Результат:

Предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды повышают слизистую секрецию примерно в 2,4 раза по сравнению с контролем, в то время как повышение за счет гидрокортизона составляет примерно 5,3-кратную величину. Согласно проведенным недавно исследованиям для таких веществ, как кортикостероиды, показано, что в клеточных культурах, происходящих из биопсий эпителия толстой кишки, они вызывают стимуляцию эндогенной слизистой секреции (Finnie I.A. et al. Clinical Science, 91 (1966), 359-364). Таким образом, появляется возможность благоприятно влиять на воспалительные кишечные заболевания с помощью компонентов пищевых продуктов, которые состоят из предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов.

Пример 8

Влияние на микрофлору в толстой кишке

Для исследования влияния предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов на состав микрофлоры в толстой кишке различные чистые культуры встречающихся в кале человека бактерий культивировали с галактоманноолигосахаридами в качестве единственного источника углеводов в следующей среде:

триптиказа/триптон1,50 гдрожжевой экстракт1,00 гКН₂PO₄0,24 гNa₂HPO₄0,24 г(NH₄)₂SO₄1,24 гNaCl0,48 гMgSO₄·7H₂O0,10 гCaCl₂·2Н₂O0,06 гFeSO₄·7Н₂02 мгрезазурин 1 мг цистеин/HCl0,50 граствор витамина (согласно DSM 141)0,50 млраствор микроэлементов(согласно DSM 141)9,00 млNaHCO₃2,00 ггалактоманноолигосахариды5,00 гдистиллированная вода до общего количества 1000 мл,

рН 7,0

Тест осуществляли при использовании следующих микроорганизмов:

Bacteroides asaccharolyticus

Bacteroides distasonis

Bacteroides fragilis

Bacteroides tetaiotaomicron

Bifidobacterium adolescentis

Bifidobacterium bifidum

Bifidobacterium breve

Bifidobacterium infantis

Bifidobacterium longum

Eubacterium lentum

Eubacterium limosum

Lactobacillus casei

Lactobacillus fermentum

Clostridium butyricum

Clostridium difficile

Clostridium perfringens

Enterobacter cloacae

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Salmonella typhimurium

Serratia marcescens

Staphylococcus aureus

Микроорганизмы культивировали в течение 24 часов при температуре 37°С в анаэробных условиях. Во время всей продолжительности опыта в определенные моменты времени отбирали пробы и исследовали их на значение рН и концентрацию олигосахаридов. Кроме того, с помощью оптической плотности определяли увеличение числа клеток.

Только бифидобактерии и обе лактобациллы оказались способными к обмену веществ в случае предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов и расти на них. В случае всех других исследованных бактерий не установлено никакого роста в среде. Таким образом, оказывается, что пищевые продукты, которые содержат предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды, могут положительно изменять состав микрофлоры толстой кишки.

Пример 9

Усиление иммунной защиты

Усиление фагоцитоза

Влияние предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов на функцию фагоцитов (моноциты, гранулоциты) можно определять посредством теста на фагоцитоз. В случае стимуляции фагоцитоза фагоциты предварительно инкубировали с галактоманноолигосахаридами (100 мкг гликана/ 0,11 мл цельной крови, 37°С, 10 минут). Соответствующие холостому значению пробы инкубировали, соответственно, в течение 10 минут на бане со льдом. Затем осуществляли собственно тест на фагоцитоз в следующих условиях: 0,11 мл раствора от предварительной инкубации выдерживали в течение 10 минут на бане со льдом, затем добавляли 0,01 мл неопсонированной Е.coli (маркированная флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), 10⁹ на мл, ORPEGEN) или 0,01 мл неопсонированного Staphylococcus aureus (15×10⁶ на мл, FITC-маркированный, MOLECULAR PROBES). Смеси инкубировали (двойные определения) при температуре 37°С в течение 10 минут. Смеси промывали два раза по 3 мл буфером для промывки (ORPEGEN) и центрифугировали каждый раз в течение 5 минут при температуре 4°С при ускорении 250 g.

Лизис эритроцитов в осадке осуществляли с помощью 2 мл буфера для лизиса (ORPEGEN) в течение 20 минут при комнатной температуре и затем смесь один раз промывали. К осадку добавляли 0,2 мл окрашенного раствора ДНК (пропидийиодид) и выдерживали в течение 10 минут на бане со льдом.

Измерения осуществляли в проточном цитометре (возбуждение: 488 нм, эмиссия FL-1: 520 нм), причем между моноцитами и гранулоцитами без разделения можно обнаружить различия (прямо направленный рассеянный свет (FSC) в сравнении с боковым рассеянным светом (ESC)). Результаты выражены в виде доли в % фагоцитозпозитивных клеток (см. следующую таблицу VI):

В качестве контрольного вещества без воздействия фагоцитоза использовали рафинозу.

Таблица VI
Тест на фагоцитозВлияние галактоманноолигосахаридов (100 мкг/смесь)Тип клеткиМоноцитыГранулоциты (% позитивных(% позитивных клеток) клеток) Тип бактерийЕ. coliЕ. coliStaph. aureus неопсонированонеопсонированонеопсонированоконтроль, 4°С8,01,00,5контроль, 37°С21,519,527,0галактоманно-35,033,542,5олигосахариды   рафиноза22,017,030,0

Результаты показывают, что после предварительной инкубации моноцитов, соответственно, гранулоцитов с предлагаемыми согласно изобретению галактоманноолигосахаридами достигали стимуляции фагоцитоза.

Тест на адгезию

Согласно тесту на адгезию определяли влияние предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов на адгезионные свойства В-клеточных линий (например, Reh) и нормальных человеческих В-лимфоцитов в эпителиальных клетках (линия опухоли толстой кишки НТ 29). В случае используемого Overlay-теста лимфоциты внутриклеточно маркировали с помощью кальцеина, чтобы можно было осуществлять измерение флуорометрически.

Сначала осуществляли покрытие с помощью липкой эпителиальной клеточной линии толстой кишки (НТ 29) титрационных микропланшетов (24-луночные планшеты Costar®). Инкубировали в течение ночи при температуре 37°С вплоть до образования конфлюентного налета. Это осуществляли, насколько возможно, в не содержащей сыворотки среде. Посев: 1×10⁴ клеток. Липкие клетки затем промывали три раза с помощью забуференного фосфатом физиологического раствора хлорида натрия (ЗФР) перед последующим анализом и соответственно блокировали с помощью ЗФР +1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре.

Тестируемые В-клеточные линии или выделенные В-лимфоциты в необработанном состоянии флуоресцентно маркировали с помощью кальцеина (1×10⁷ клеток в 2 мл среды RPMI + ГЕПЕС + 10 мкл кальцеина AM, в течение 30 минут при температуре 37°С; затем промывали 2 раза с помощью буфера Хэнкса (HBSS) + 0,25% BSA) и 1×10⁶ клеток в 0,5 мл ЗФР + 0,25% HBSS на лунку инкубировали в течение 1 часа. Культуральный планшет помещали на 10 секунд на встряхиватель, затем добавляли на лунку 0,5 мл 0,2% раствора глутарового альдегида в ЗФР + 0,2% BSA и инкубировали в течение 10 минут на встряхивателе. Флуоресценцию планшета определяли в устройстве для измерения флуоресценции (494 нм, 517 нм).

Первое измерение соответствует 100%-ному значению. Затем планшет промывали 4 раза и снова измеряли. Это измерение соответствует специфической адгезии, которую указывают в процентах к 100%-ному значению за вычетом значения автофлуоресценции (немаркированные клетки). В качестве контрольных веществ использовали галактозу, соответственно, глюкозу.

Адгезия Reh (пре-В) в случае клеточной линии толстой кишки НТ 29;

Таблица VII
Влияние галактоманноолигосахаридов (10 мкг/смесь)СахарСреднее значение (%)SDИндексбез углевода466,31,00D-глюкоза476,01,11D-галактоза517,01,12галактоманноолигосахариды939,72,02

По сравнению с контрольными веществами D-глюкозой и D-галактозой в присутствии галактоманноолигосахаридов достигают отчетливо усиленных адгезионных свойств В-клеточной линии (Reh) в отношении клеточной линии толстой кишки НТ 29.

Пример 10

Повышение поступления кальция

Подготовка опыта

Самцов крыс Sprague-Dawley массой примерно по 100 г содержали в условиях свободного доступа к деминерализованной воде и следующей стандартной диеты в фазе привыкания в течение 4 дней, г:

казеин250 масло из кукурузного зародыша50 смесь минеральных солей (без Са и Fe)25 карбонат кальция7,5 смесь витаминов10 витамин Е1 холинбитартарат4 сахароза до общего количества1000

Затем их подразделяли на две группы. В первой группе у животных полностью удаляли желудок (группа с резекцией желудка), вторая группа служила в качестве контроля (контрольная группа). После операции крыс содержали в течение 24 часов без пищи и воды, затем в течение 2-3 дней давали коровье молоко и после этого в течение 14-16 дней их держали на стандартной диете в фазе привыкания в течение 4 дней.

Осуществление опыта

Тестируемые группы снова подразделяли на, соответственно, две подгруппы. Соответственно, одну из подгрупп держали далее на стандартной диете, в то время как другая подгруппа получала рацион с добавкой галактоманноолигосахаридов (50 г/кг рациона). В продолжение опыта в течение 3 недель, начиная с третьего дня, собирали пробы кала и исследовали на содержание выделившегося кальция. По окончании опыта анализировали содержимое слепой кишки.

Результаты;

При использовании стандартной диеты поступление кальция в случае группы с резекцией желудка составляло только примерно четвертую часть от поступления кальция в контрольной группе.

За счет примешивания предлагаемых согласно изобретению галактоманноолигосахаридов смогли примерно удвоить поступление кальция в случае группы с резекцией желудка, так что оно повысилось примерно до 50% поступления кальция в контрольной группе.

В случае крыс, содержащихся в условиях включающей предлагаемые согласно изобретению галактоманноолигосахариды диеты, анализ содержания кальция показал сильно повышенную концентрацию пропионовой кислоты. Она в значительной степени связана с определяемым поступлением кальция.

Пример 11.

Физико-химические свойства олигосахаридов

Распределение степени полимеризации Определяли распределение степени полимеризации (DP) продукта, реакции примера 2 с помощью гельпроникающей хроматографии (GPC) на Fractogel^R HW 40 S при 50°С и полностью обессоленной воде в качестве элюента. В качестве сравнительного вещества использовалась Raftilose^R.

Таблица VIII
Результаты
Площади в % для каждой степени полимеризации:DPплощадь, %12213364115968712811>828

Основываясь на методике разделения GPC удалось осуществить разделение только DP, равной 8. Для степени полимеризации >8 разделение осуществить не удалось. Диапазон DP от 2 до 8 составлял 70% от общей площади.

Определение количества соединений с одинаковой длиной цепи

Определение количества соединений с одинаковой длиной цепи осуществляли посредством НРАВС (ионно-обменной хроматографией высокого разрешения) при следующих условиях:

Разделительные колонки: 1 × Carbopac PA 1 (4 мм × 250 мм);

предварительная колонка PA 1 (4 мм × 50 мм), анионообменник фирмы Dionex; элюент: 100 мм NaOH, 1 М Na-ацетат, от 2 до 900 мМ в течение времени удерживания 75,5 мин при скорости пропускания 1мл/мин. Определение проводили с помощью пульсирующего амперометрического детектора (золотые электроды). Потенциалы Е и время пульсации t:

El=0,05 Вт и t1=400 мс,

El=0,6 Вт и t2=300 мс,

El=0,6 Вт и t3=240 мс.

Таблица IX
Результаты
Доли поверхностей основных и побочных компонентовDPОсновные компоненты, площадь %Побочные компоненты, площадь %Число компонентов210001382183460403565353684162772283864362

Основные компоненты составляли площадь от 60 до 100%. При этом могли определять от 1 до 3 компонентов на DP.

Содержание маннозы/галактозы

Содержание маннозы, а также галактозы в олигосахариде с определенной степенью полимеризции определяли путем кислого гидролиза (0,5% углевода в 1 М HCl, 3 часа при 95°С) и последующей ионно-обменной хроматографии НРАВС.

Таблица Х
РезультатыDPСодержание маннозыСодержание галактозы22032,80,243,01,053,11,964,02,073,93,185,03,0

Молекулы со степенью полимеризации 2-3 являются гомоолигомерными олигосахаридами, которые состоят только из молекул маннозы. С увеличивающейся длиной цепи олигомеры содержат возрастающую долю галактозы.

Высокая стабильность по отношению к кислотам, показанная в примере 3, и обусловленная этим высокая стабильность в отношении оснований позволяет также применять предлагаемые олигосахариды в качестве добавок для соответстующих продуктов питания.

Полученные в примере 2 олигосахариды проявляют сильно пониженную вязкость по сравнению с исходным веществом, гуаровой камедью. Это позволяет использовать олигосахариды, например, в продуктах питания в более высоких концентрациях.

Пример 12

Продукт питания

Продуктом питания, содержащим галактоманнаноолигосахариды согласно изобретению, могут быть, например, хлебобулочные изделия.

Рогалики для завтрака: 25 г дрожжей, 300 г сливок, 25 г сахара,

50 г галактоманнаноолигосахарида, 400 г пшеничной муки Тур 550, 0,15 г соли, 200 г маргарина, 50 г желтка. Дрожжи, теплые сливки, 1 щепотку соль и щепотку муки перемешивают и 10 минут выдерживают, затем смешивают с остальными компонентами и выдерживают 20 минут, чтобы подошло тесто. Тесто размешивают и раскатывают. Нарезают 15 треугольников и сворачивают в рогалики. Кратковременно выдерживают и выпекают в течение 10 минут при 200°С.

Пример 13

Вкусовой продукт

Вкусовым продуктом, содержащим галактоманнаноолигосахариды согласно изобретению, могут быть, например, батончики мюсли. Батончик мюсли: 200 г овсяных хлопьев, 100 г кукурузных хлопьев, 100 г лесного ореха, 50 г семян подсолнечника, 30 г кокосовой стружки, 150 г галактоманнаноолигосахарида, 150 г меда, 50 г масла, 20 г лимонного сока, 20 г воды. Мед, масло, лимонный сок и воду карамелизировали. Овсяные и кукурузные хлопья, кокосовую стружку, орехи, семена подсолнечника и галактоманнаноолигосахарид смешивали и добавляли к карамелизированной массе. Массу хорошо перемешивали и выкладывали на противень. Затем нарезали батончики, упаковывали и сушили.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Способ получения олигосахаридов из галактоманнанов включает гидролиз водного раствора или суспензии с использованием ферментативно действующего агента из бактерий штамма Bacillus subtilis DSM 13182. Получают водный раствор смеси из галактоманнаноолигосахаридов со степенью полимеризации <15. Кроме того, предложен галактоманнаноолигосахарид, фермент, неочищенный экстракт, штамм Bacillus subtilis DSM 13182, лекарственное средство, пищевой продукт и вкусовой продукт. Предложенная группа изобретений позволяет получить продукт, используемый в пищевых продуктах и лекарственных средствах для увеличения поступления кальция в организм. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 табл.

1. Способ получения содержащих маннозу и галактозу олигосахаридов из галактоманнанов, при этом готовят водный раствор или суспензию галактоманнана, гидролизуют при использовании ферментативно действующего агента из бактерий штамма Bacillus subtilis DSM 13182 и получают водный раствор смеси из галактоманноолигосахаридов со степенью полимеризации <15.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что степень полимеризации галактоманноолигосахарида составляет от 2 до 7.3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что ферментативно действующим агентом являются живые или инактивированные клетки штамма Bacillus subtilis DSM 13182.4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что ферментативно действующим агентом является фермент из клеток штамма Bacillus subtilis DSM 13182, гидролизующий галактоманнан, или неочищенный экстракт из клеток штамма Bacillus subtilis DSM 13182.5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз осуществляют с помощью иммобилизированных клеток штамма Bacillus subtilis DSM 13182, иммобилизированных неочищенных экстрактов или иммобилизированных ферментов из штамма Bacillus subtilis DSM 13182.6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что высокомолекулярные компоненты удаляют из полученной смеси галактоманноолигосахаридов путем ионообменной хроматографии.7. Галактоманноолигосахарид, получаемый из гуаровой камеди по способу согласно пп.1-6, включающий β-1,4-связанные маннозные структурные единицы и α-1,6-связанные с ними галактозные структурные единицы, со степенью полимеризации <15, в особенности от 2 до 7.8. Галактоманноолигосахарид по п.7, отличающийся тем, что он пригоден в качестве терапевтического или диагностического средства.9. Галактоманноолигосахарид по п.7, отличающийся тем, что он пригоден для получения вкусовых и/или пищевых продуктов и/или для снижения гликемического индекса вкусовых и/или пищевых продуктов.10. Галактоманноолигосахарид по п.7, отличающийся тем, что он пригоден для предотвращения инфекционных заболеваний, кишечных заболеваний и канцерогенеза толстой кишки, для усиления иммунной защиты против общих инфекций, для предотвращения воспалительных заболеваний и/или остеопороза.11. Галактоманноолигосахарид по п.7, отличающийся тем, что он пригоден для получения лекарственного средства для предотвращения инфекционных заболеваний, кишечных заболеваний и канцерогенеза толстой кишки, усиления иммунной защиты против общих инфекций, предотвращения воспалительных заболеваний и/или остеопороза.12. Фермент, способный гидролизовать различного рода галактоманнаны, предпочтительно гуаровую камедь, камедь кассии коричной и камедь плодов рожкового дерева, в каждом случае с примерно одинаковой эффективностью, получаемый из штамма Bacillus subtilis DSM 13182.13. Неочищенный экстракт из клеток штамма Bacillus subtilis DSM 13182, способный гидролизовать различного рода галактоманнаны, предпочтительно гуаровую камедь, камедь кассии коричной и камедь плодов рожкового дерева, в каждом случае с примерно одинаковой эффективностью, получаемый путем переведения клеток штамма Bacillus subtilis DSM 13182 в удобную для переработки форму.14. Штамм Bacillus subtilis DSM 13182, продуцирующий фермент, гидролизующий галактоманнаны.15. Лекарственное средство для профилактики и лечения сахарного диабета II, инфекционных заболеваний, кишечных заболеваний, рака толстой кишки, воспалительных заболеваний и остеопороза, содержащее галактоманноолигосахарид по п.7, в случае необходимости, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.16. Пищевой продукт, содержащий галактоманноолигосахарид по п.7.17. Пищевой продукт по п.16, отличающийся тем, что он пригоден для предотвращения инфекционных заболеваний, кишечных заболеваний и канцерогенеза толстой кишки, для усиления иммунной защиты против общих инфекций, для предотвращения воспалительных заболеваний и/или остеопороза.18. Вкусовой продукт, содержащий галактоманноолигосахарид по п.7.