КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ БАКТЕРИИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ БАЦИЛЛЕН, ИЛИ ЕГО ПРЕПАРАТЫ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A61K35/742 A23K10/18 A23K50/30 A23K50/75 A23K50/80 A01N63/22 

Изобретение относится к применению бактерий, продуцирующих бациллен, в качестве пробиотических кормовых ингредиентов, и к композициям, содержащим бактерии, продуцирующие бациллен, а также к применению бациллена или его производных для лечения бактериальных заболеваний.

Применение определенных бактериальных штаммов в качестве ингредиентов пробиотиков в кормовой промышленности было описано ранее. Функция пробиотиков (также называемых «микробами прямого кормления» или «DFM - direct-fed microbials») заключается в положительном воздействии на микрофлору кишечника, поддерживая рост полезных бактерий и/или подавляя рост патогенных бактерий. В идеале при применении пробиотиков использование антибиотиков в качестве стимуляторов роста (AGP) становится излишним. Но помимо этого желательно, чтобы пробиотик выполнял дополнительные функции, например, помогал переваривать определенные ингредиенты корма.

Таким образом, с учетом уровня техники, существует потребность в пробиотиках, которые положительно влияют на микрофлору кишечника и, кроме того, желательно выполняют по меньшей мере одну дополнительную функцию.

Бациллен вторичный метаболит, относящийся к классу полиенов, который был открыт и выделен из ферментационных бульонов штамма Bacillus subtilis (Pate1 с соавт., The Journal of Antibiotics, 48(9), 1995, 997-1003).

В соответствии с настоящим изобретением при проведении экспериментов с нокаутными мутантами было неожиданно обнаружено, что бациллен способен эффективно ингибировать рост коммерчески значимых патогенов, таких, в частности, как вырабатывающий токсин Clostridium perfringens, который является причиной некротического энтерита, Vibrio parahaemolyticus - возбудителя болезней ракообразных, таких как синдром ранней смертности, и Salmonella enterica, которая является одной из основных причин пищевых отравлений. Таким образом, установлено, что бактерии, которые продуцируют бациллен, применимы в качестве пробиотических кормов и пищевых ингредиентов, а бациллен или его производные применимы для лечения бактериальных заболеваний.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения являются композиции, в частности пищевые, кормовые и терапевтические композиции, а также композиции для лечения растений, содержащие бациллен или его производное, в частности, микроорганизмы, продуцирующие бациллен, и/или их препараты, содержащие бациллен.

В соответствии с настоящим изобретением понятие «производное бациллена», в частности, относится к гидрогенизированным вариантам бациллена, в частности к дигидробацилленам, согласно описанию в литературе.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также является применение микроорганизмов, продуцирующих бациллен, или их препаратов в качестве пробиотических кормов или пищевых ингредиентов.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются, в частности, микроорганизмы, продуцирующие бациллен, которые применимы в качестве пробиотиков. Для применения в качестве пробиотиков, микроорганизмы по настоящему изобретению должны предпочтительно в полной мере удовлетворять определенным критериям, таким как устойчивость к желчи, термостойкость и/или способность расти в анаэробных условиях.

Бациллен-продуцирующие бактерии по настоящему изобретению, в частности, способны ингибировать такие штаммы, как выбранные из Clostridium, предпочтительно С. perfringens, в частности С. perfringens АТСС 13124, Salmonella, предпочтительно Salmonella enterica, в частности Salmonella enterica subsp.enterica enteritidis DSM 14221, E.coli, в частности E. coli ATCC11775, и Vibrio, предпочтительно Vibrio parahaemolyticus, в частности Vibrio parahaemolyticus DSM10027 и/или Vibrio parahaemolyticus TW01.

Микроорганизмы, продуцирующие бациллен, по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой бактерии, предпочтительнее относящиеся к Bacillus, в частности В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. methylotrophicus и В. atropheus, а также Paenibacillus, в частности P. polymixa и P. durus. В высоко предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмом, продуцирующим бациллен, является В. amyloliquefaciens или В. subtilis.

Микроорганизмы, продуцирующие бациллен, согласно настоящему изобретению предпочтительно дополнительно характеризуются тем, что они способны расти в присутствии 2 мМ желчи, предпочтительно в присутствии 4 мМ желчи, в частности, характеризуются величиной AUC5, равной по меньшей мере 0,5, предпочтительно по меньшей мере 0,65, наивысшей величиной не менее 0,8, и величиной AUC10 не менее 1,2, предпочтительно не менее 1,4, наивысшей величиной не менее 1,6, в присутствии 2 мМ желчи и/или в том случае, если они способны расти в присутствии 0,3 мас. % желчи, в частности, в присутствии 0,3 мас. % куриной желчи и/или в присутствии 0,3 мас. % свиной желчи, предпочтительно характеризуются способностью выдерживать воздействие 0,3 мас. % желчи, в частности 0,3 мас. % куриной желчи и/или 0,3 мас. % свиной желчи в течение по меньшей мере 3 ч, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 или 8 ч.

Микроорганизмы, продуцирующие бациллен, по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно характеризуются способностью к анаэробному росту, в частности способностью разлагать нерастворимую в воде целлюлозу и белок в анаэробных условиях.

Микроорганизмы, продуцирующие бациллен, по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно характеризуются тем, что по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 70 или 90% спор выдерживают воздействие 99°С в течение 20 мин.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens, который оказался продуцирующим бациллен и применимым в качестве пробиотика, был выявлен путем скрининга встречающихся в природе изолятов и депонирован в DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур Института Лейбница, DSMZ-Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток, Инхоффенштрассе 7 В, 38124 Брауншвейг, Германия) 7 февраля 2019 г. в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры под регистрационным номером DSM 33014 от фирмы Evonik Degussa GmbH.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий бациллен, выбран из следующей группы:

а) Штамм Bacillus amyloliquefaciens DSM 33014;

б) Мутант штамма Bacillus, депонированный в коллекции как DSM 33014, предпочтительно с идентичностью последовательности не менее 98%, в частности 99 или 99,5% последовательности генома штамма Bacillus, депонированного в коллекции как DSM 33014, где мутант предпочтительно проявляет устойчивость к желчи, и/или термостойкость, и/или способен расти в анаэробных условиях.

У штамм В. amyloliquefaciens DSM 33014 последовательностью 16S рДНК является SEQ ID NO: 1, последовательность yqfD является SEQ ID NO: 2, последовательность gyrB является SEQ ID NO: 3, последовательность rpoB является SEQ ID NO.: 4 и последовательность groEL является SEQ ID NO: 5.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные штаммы Bacillus, продуцирующие бациллен, в частности штамм Bacillus amyloliquefaciens DSM 33014, имеют по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно все из числа следующих характеристик:

а) последовательность 16S рДНК идентична по меньшей мере на 98, предпочтительно по меньшей мере 99, 99,5 или 99,8%, более предпочтительно на 100% последовательности 16S рДНК штамма DSM 33014 и/или SEQ ID NO: 1;

б) последовательность yqfD идентична по меньшей мере на 98, предпочтительно по меньшей мере 99, 99,5 или 99,8%, более предпочтительно на 100% последовательности yqfD штамма DSM 33014 и/или SEQ ID NO: 2;

в) последовательность gyrB идентична по меньшей мере на 98, предпочтительно по меньшей мере 99, 99,5 или 99,8%, более предпочтительно на 100% последовательности gyrB штамма DSM 33014 и/или SEQ ID NO: 3;

г) последовательность rpoB идентична по меньшей мере на 98, предпочтительно по меньшей мере 99, 99,5 или 99,8%, более предпочтительно на 100% последовательности rpoB штамма DSM 33014 и/или SEQ ID NO: 4;

д) последовательность groEL идентична по меньшей мере на 98, предпочтительно по меньшей мере 99, 99,5 или 99,8%, более предпочтительно на 100% последовательности groEL штамма DSM 33014 и/или SEQ ID NO: 5.

Бактерии, продуцирующие бациллен, согласно настоящему изобретению содержат генный кластер, который позволяет продуцировать бациллен. Кластер предпочтительно включает гены baeJ, baeL, baeM, baeN и baeR, кодирующие субъединицы белкового комплекса, синтезирующего бациллен, который также называется поликетидсинтазой или белком PKS (polyketide synthase).

Штамм В. amyloliquefaciens DSM 33014 содержит последовательность baeJ SEQ ID NO: 6, последовательность baeL SEQ ID NO: 7, последовательность baeM SEQ ID NO: 8, последовательность baeN SEQ ID NO: 9 и последовательность baeR SEQ ID NO: 10.

Таким образом, по настоящему изобретению генный кластер белка PKS предпочтительно включает следующие гены:

а) последовательность гена baeJ, которая идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85, 90 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99%, лучше всего на 100% последовательности baeJ штамма DSM 33014 и/или последовательности SEQ ID NO: 6;

б) последовательность гена baeL, которая идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85, 90 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99%, лучше всего на 100% последовательности baeL штамма DSM 33014 и/или последовательности SEQ ID NO: 7;

в) последовательность гена baeM, которая идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85, 90 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99%, лучше всего на 100% последовательности baeM штамма DSM 33014 и/или последовательности SEQ ID NO: 8;

г) последовательность гена baeN, которая идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85, 90 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99%, лучше всего на 100% последовательности baeN штамма DSM 33014 и/или последовательности SEQ ID NO: 9;

д) последовательность гена baeR, которая идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85, 90 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99%, лучше всего на 100% последовательности baeR штамма DSM 33014 и/или последовательности SEQ ID NO: 10.

Микроорганизмы по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой природные изоляты, но они также могут быть мутантами природных изолятов, в частности спонтанными мутантами. Кроме того, микроорганизмы по настоящему изобретению также могут быть получены с помощью генной инженерии, в частности, путем включения генов, кодирующих субъединицы фермента, продуцирующего бациллен, в частности, генов baeJ, baeL, baeM, baeN и baeR, как упоминалось ранее, в микроорганизм, предпочтительно в микроорганизм, упомянутый ранее, более предпочтительно в штамм В. subtilis или В. amyloliquefaciens, где до включения генов микроорганизм предпочтительно был неспособен продуцировать бациллен.

Термин «спонтанный мутант» относится к мутантам, которые возникают из природных изолятов без преднамеренного использования мутагенов. Такие спонтанные мутанты могут быть получены классическими методами, такими как выращивание природного изолята в присутствии УФ-света, и/или путем применения высокой температуры, или образования протопластов, и/или в присутствии определенного антибиотика, к которому чувствителен родительский штамм, и затем тестирование каких-либо устойчивых мутантов на улучшенную биологическую активность или улучшенную способность повышать один или несколько показателей здоровья животных, в частности здоровья кишечника. Другие методы идентификации спонтанных мутантов известны рядовым специалистам в данной области. Но помимо этих предпочтительных спонтанных мутантов все другие виды мутантов природных изолятов, такие как мутанты, полученные с помощью генной инженерии, также относятся к настоящему изобретению.

Таким образом, одним конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения являются неприродные мутанты, в частности спонтанные мутанты, как определено выше, природных штаммов, продуцирующих бациллен, предпочтительно характеризующиеся признаками, упомянутыми выше в описании.

Таким образом, еще одним конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения являются микроорганизмы, продуцирующие бациллен, которые были получены путем включения генов, кодирующих субъединицы ферментов, продуцирующих бациллен, в частности генов baeJ, baeL, baeM, baeN и baeR, как упоминалось в описании выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмы и препараты настоящего изобретения вводят перорально животным или людям.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения являются композиции, такие как корма, пищевые продукты, вода для питья и сельского хозяйства, а также терапевтические композиции, содержащие микроорганизмы, продуцирующие бациллен, и/или их препараты, и/или бациллен или их производные.

Другим объектом настоящего изобретения является также применение микроорганизмов, продуцирующих бациллен, и/или их препаратов в качестве пробиотических ингредиентов (DFM) в кормах или пищевых продуктах.

Предпочтительными пищевыми продуктами по настоящему изобретению являются молочные продукты, в частности йогурт, сыр, молоко, масло и творог.

Клетки микроорганизмов по настоящему изобретению могут содержаться, в частности, в композициях по настоящему изобретению, в виде спор (которые находятся в состоянии покоя), в виде вегетативных клеток (которые растут), в виде клеток переходного состояния (которые переходят из фазы роста в фазу споруляции) или в виде комбинации по крайней мере двух, в частности, всех этих типов клеток. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает в основном или исключительно споры.

Дополнительно или в качестве альтернативы клетки микроорганизмов также можно применять в неживой, инактивированной форме, так как также ожидается, что неживые клетки все сохраняют пробиотическую активность. Способы инактивировать клетки известны специалистам в данной области.

Продуцирующие бациллен микроорганизмы по настоящему изобретению и содержащие их композиции при введении животным предпочтительно улучшают здоровье таких животных, и/или улучшают общее физическое состояние таких животных, и/или улучшают коэффициент конверсии корма таких животных, и/или снижают уровень смертности таких животных, и/или увеличивают выживаемость таких животных, и/или улучшают набора веса такими животными, и/или повышают продуктивность таких животных, и/или повышают устойчивость таких животных к болезням, и/или усиливают иммунный ответ таких животных, и/или устанавливают или поддерживают здоровую микрофлору кишечника у таких животных, и/или уменьшают выделения патогенов с фекалиями у таких животных. В частности, микроорганизмы и композиции по настоящему изобретению могут быть применены как вспомогательное средство в восстановлении здорового баланса микрофлоры кишечника после введения антибиотиков в терапевтических целях.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ улучшения здоровья животных, и/или улучшения общего физического состояния животных, и/или повышения степени конверсии корма, и/или снижения уровня смертности животных, и/или увеличения выживаемости животных, и/или увеличения веса животных, и/или увеличения продуктивности животных, и/или повышения устойчивости животных к болезням, и/или усиления иммунного ответа животных, и/или установления или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у животных, и/или уменьшения выделения патогенов через фекалии животных, при этом микроорганизмы по настоящему изобретению и/или их препараты, и/или композиции по настоящему изобретению и/или бациллен или его производное вводят животным, в частности водным животным.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также являются микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции настоящего изобретения, как упоминалось ранее, и/или бациллен или его производное для улучшения здоровья животных и/или для улучшения общего физического состояния животных, и/или для повышения коэффициента конверсии корма, и/или для снижения уровня смертности животных, и/или для увеличения выживаемости животных, и/или для улучшения набора веса животных, и/или для увеличения продуктивности животных, и/или для повышения устойчивости животных к болезням, и/или для увеличения иммунного ответа животных, и/или для создания или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у животных, и/или для уменьшения выделения патогенов через фекалии животных.

Понятие «повышение продуктивности животных» относится, в частности, к любому из следующий положений: производство большего количества или лучшего качества яиц, молока или мяса, или увеличение производства отлученного от матери потомства.

Способы и применения микроорганизмов, препаратов и композиций по настоящему изобретению могут быть терапевтическими или не терапевтическими. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способы и применения не являются терапевтическими, в частности применения для кормления.

Необработанный навоз животных от патогенных бактерий и других составляющих может иметь пагубное воздействие на окружающую среду, в частности, в отношении самих животных и/или людей, контактирующих с навозом, но этого можно избежать путем кормления животных или непосредственной обработки навоза или подстилки животных микроорганизмами, композициями или препаратами по настоящему изобретению, поэтому дополнительным предметом изобретения является способ контроля и/или предотвращения вредного воздействия навоза или загрязненных жидкостей на окружающую среду, способ, включающий стадию внесения в навоз, загрязненные жидкости, подстилку, яму или пруд для навоза по меньшей мере одного микроорганизма, продуцирующего бациллен, и/или его препарата, и/или композиции в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно микроорганизмы, препараты или композиции применяются в жидкой форме, например, путем распыления, или в виде порошка, например, путем посыпания.

Поскольку вредные бактерии могут оказывать негативное влияние на консистенцию подстилки и, в частности, могут влиять на довольно жидкую или очень текучую подстилку, что может привести к поражению подушечек лап у домашней птицы и чего можно избежать, скармливая животным микроорганизмы, композиции или препараты по настоящему изобретению, поэтому следующим предметом настоящего изобретения является способ контроля и/или улучшения консистенции подстилки, в частности, способ обеспечения твердой консистенции подстилки и/или способ предотвращения повреждений подушечек конечностей, способ включающий стадию кормления животных, в частности домашней птицы, по меньшей мере, одним микроорганизмом, одним препаратом и/или одной композицией по настоящему изобретению.

Микроорганизмы и препараты по настоящему изобретению могут также использоваться для улучшения качества кормов и пищевых композиций, а также для улучшения качества воды и водных растворов. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ контроля и/или улучшения качества кормов или пищевых композиций, а также качества воды или водных растворов, в частности питьевой воды и/или воды для животноводства, включающий стадию внесение в корм, пищу, воду или водный раствор по меньшей мере одним микроорганизма и/или по меньшей мере одного препарата и/или по меньшей мере одной композиции по настоящему изобретению.

Кроме того, микроорганизмы и препараты по настоящему изобретению также можно использовать для лечения микробных заболеваний растений. Таким образом, дополнительным предметом изобретения также является способ лечения и/или профилактики микробных заболеваний растений, в частности культурных растений, включающий стадию нанесения на растения по меньшей мере одного микроорганизма, и/или по меньшей мере одного препарата, и/или по крайней мере, одну композицию настоящего изобретения. Нанесение может быть выполнено в жидкой форме, такой как распыление, или в твердой форме, в частности в виде порошка, предпочтительно в виде переработанного порошка.

При использовании микроорганизмов, препаратов и композиций по настоящему изобретению предпочтительно достигается улучшение по меньшей мере одного из упомянутых выше признаков, причем проявление признака предпочтительно означает улучшение по меньшей мере на 1%, более предпочтительно по меньшей мере на 3 или минимум 5% по сравнению с адекватным отрицательным контролем. В качестве отрицательного контроля можно использовать средние значения, известные в области животноводства, но предпочтительно в качестве отрицательного контроля используют животных, которые подвергаются такому же лечению, как и тестируемые животные, но без введения микроорганизмов и/или препаратов по настоящему изобретению.

Помимо их способности из-за продукции бациллена подавлять рост патогенных бактерий, как упоминалось выше, микроорганизмы и препараты, используемые по настоящему изобретению, предпочтительно способны подавлять рост других патогенных бактерий.

В частности, микроорганизмы, препараты и композиции по настоящему изобретению можно вводить или скармливать животному в количестве, эффективном для подавления и/или уменьшения роста патогенных бактерий в кишечнике животного. Такие патогенные бактерии включают, помимо Clostridia, Salmonella, Vibrio и Escherichia coli, также, в частности, Listeria, Enterococci, Staphylococci, Aeromonas, Streptococci, Campylobacter, Shigella, Haemophilus и Brachyspira. Соответственно, способы по настоящему изобретению можно применять для уменьшения количества патогенных бактерий, вирусов и простейших, выделяемых с фекалиями животных. Способы по настоящему изобретению также можно использовать для поддержания или усиления роста полезных бактерий, таких как молочнокислые бактерии, в кишечнике животных. Уменьшая количество патогенных бактерий и/или увеличивая или поддерживая полезные бактерии, композиции по настоящему изобретению способны поддерживать в целом здоровую микрофлору кишечника.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также является способ подавления и/или уменьшения роста патогенных бактерий и/или поддержания и/или усиления роста полезных бактерий, в частности, в кишечнике животного или человека, при этом микроорганизмы, препараты и/или композиции по настоящему изобретению вводят животным или людям, и при этом патогенные бактерии предпочтительно выбраны из Clostridia, в частности из С. perfringens, С. difficile, С. novyi, С. septicum и С. colinum, из Listeria, в частности из L. monocytogenes, L. seeligeri и L. welshimeri, из Salmonella, в частности из S. enterica, включая подвиды S. enterica, S. arizonae, S. bongori и в частности их серовары, S. gallinarum, S. pullorum, S. typhimurium, S. enteritidis, S. cholerasuis, S. heidelberg, S. dublin, S. hadar, S. typhi, S. paratyphi и S. infantis, из Enterococci, в частности из E. faecalis, E. faecium и E. cecorum, из Staphylococci, в частности из S. aureus, из Aeromonas, из Streptococci, в частности из S. suis и S. gallinaceus, из Campylobacter, в частности из С. jejuni и С. coli, из Escherichia coli, из Haemophilus, в частности из Haemophilus parasuis, из Brachyspira, в частности из Brachyspira hyodysenteriae и из Vibrio, в частности из V. parahaemolyticus и V. harveyi, и полезные бактерии предпочтительно выбраны из молочнокислых бактерий, в частности из лактобацилл и бифидобактерий. Патогенные микроорганизмы выбраны в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения из Clostridia, в частности из С. perfringens, Salmonella, в частности S. enterica, и Vibrio, в частности V. parahaemolytic.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения количество по меньшей мере одной патогенной бактерии, в частности количество С. perfringens, S. enterica и/или V. parahaemolyticus, уменьшается по меньшей мере на 0,5 log, более предпочтительно по меньшей мере на 1 log, 2 log, или 3 log.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также являются микроорганизмы, препараты и композиции по настоящему изобретению для ингибирования и/или уменьшения роста патогенных бактерий, и/или для поддержания, и/или увеличения роста полезных бактерий, в частности, в кишечнике животного или человека, причем патогенных бактерий предпочтительно выбирают из Clostridia, в частности из С. perfringens, С. difficile, С. novyi, С. septicum и С. colinum, из Listeria, в частности из L. monocytogenes, L. seeligeri и L. welshimeri, из Salmonella, в частности S. enterica, включая подвиды S. enterica, S. arizonae, S. bongori и в частности их серовары, S. gallinarum, S. pullorum, S. typhimurium, S. enteritidis, S. cholerasuis, S. heidelberg, S. dublin, S. hadar, S. typhi, S. paratyphi и S. infantis, из энтерококков, в частности Е. faecalis, Е. faecium и Е. cecorum, из стафилококков, в частности S. aureus, из Aeromonas, из Streptococci, в частности S. suis и S. gallinaceus, из Campylobacter, в частности С. jejuni и С. coli, из Escherichia coli, из Haemophilus, в частности Haemophilus parasuis, из Brachyspira, в частности Brachyspira hyodysenteriae, и из Vibrio, в частности V. parahemolyticus и V. harveyi, и полезные бактерии предпочтительно выбирают из молочнокислых бактерий, в частности из лактобацилл и бифидобактерий. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения патогенные микроорганизмы выбраны из Clostridia, в частности из С. perfringens, Salmonella, в частности S. enterica, и Vibrio, в частности V. parahaemolyticus.

Возникновение и/или усиление роста патогенных бактерий приводит или может привести к вспышке определенных заболеваний. Например, появление и/или усиление роста Clostridium perfringens может привести к вспышке заболеваний кишечника, в частности, к вспышке некротического энтерита у свиней и домашней птицы. Возникновение и/или усиление роста С. perfringens также может привести к вспышке других заболеваний, таких как бактериальный энтерит, гангренозный дерматит и колангиогепатит. Даже самая легкая форма заражения С. perfringens уже может сопровождаться диареей, которая приводит к мокрой подстилке и, таким образом, может привести к вторичным заболеваниям, таким как дерматит подушечек конечностей. Хотя С. perfringens типа С обычно считают основной причиной некротического энтерита и некрогеморрагического энтерита у поросят, тип А связан с кишечным заболеванием у подсосных и кормящих свиней с умеренным некротическим энтероколитом и атрофией ворсинок.

Clostridium difficile - важный распространяющийся патоген, вызывающий диарею в первую очередь у новорожденных поросят. У пораженных поросят может наблюдаться одышка, вздутие живота и отек мошонки.

Staphylococcus aureus subsp.aureus может вызывать ножную чесотку у цыплят, стрептококковый мастит у свиноматок и способен вырабатывать токсины, вызывающие пищевое отравление в организме человека.

Известно, что Е. cecorum вызывает хромоту, артрит и остеомиелит у бройлеров, обычно вызванные воспалением суставной и/или костной ткани. В дальнейшем Е. cecorum может вызвать воспаление перикарда.

Бактерии Salmonella являются важной причиной пищевого отравления человека, которое часто связано с потреблением мяса, например мяса птицы, свинины или продуктов, полученных из них. Соответственно, уничтожение Salmonella является серьезной проблемой для мясной промышленности. В Европе базовое исследование распространенности Salmonella в яйцекладках, проведенное в 2005 году, показало, что на глобальном уровне ЕС 20,3% крупных хозяйств кур-несушек являются бактериологически положительными на S. enteritidis. В некоторых странах распространенность была даже выше 80% [Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (2006), «Предварительный отчет: анализ базового исследования распространенности сальмонеллы в стадах кур-несушек Galius gallus»].

S. gallinarum является причиной брюшного тифа птиц, a S. pullorum -возбудителем пуллорума, оба заболевания наносят большой ущерб птицеводству.

С. coli - это бактерия, распространяющаяся с пищей, большинство людей обычно заражаются, употребляя в пищу свинину, содержащую эти бактерии. У человека вызывает гастроэнтерит и острый энтероколит, а также острые диарейные заболевания. Свиньи являются основным хозяином, но они также могут инфицировать людей, виды птиц и множество других животных.

S. gallinaceus может вызвать сепсис у домашней птицы. Крупные поражения включают спленомегалию, гепатомегалию, реномегалию и застойные явления. Также наблюдались множественные участки некроза и/или инфаркта печени и селезенки, связанные с клапанным эндокардитом.

S. suis является важным патогеном у свиней и одной из наиболее важных причин бактериальной смертности поросят после отъема от свиноматки, вызывая сепсис, менингит и многие другие инфекции.

Бактерия Vibrio parahaemolyticus, в частности, ответственна за заболевания ракообразных, такие как синдром ранней смертности (EMS - Early Mortality Syndrome), также известный как болезнь острого гепатопанкреатического некроза (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease), который поражает как гигантскую тигровую креветку (Penaeus monodon), так и белоногую креветку (Penaeus vannamei).

Патогены могут вызывать другие заболевания, такие как полиартрит, фибринозный полисерозит, кишечные расстройства после отъема от матери, такие как диарея и отеки после отъема, а также дизентерия свиней.

Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения является также терапевтическая композиция, содержащая микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции настоящего изобретения, и/или бациллен, или его производное, в частности терапевтическая композиция для лечения водных животных.

Таким образом, предпочтительным объектом настоящего изобретения является терапевтическая композиция для лечения заболевания, в частности заболевания кишечника, в частности, связанного с бактериальной инфекцией, вызываемой Clostridia, в частности С. perfringens, и/или Salmonella, в частности S. enterica, предпочтительно S. enterica subsp.enterica enteritidis и/или Vibrio, частности Vibrio parahaemolyticus.

Таким образом, дополнительным предпочтительным объектом в данном контексте является терапевтическая композиция для лечения и/или профилактики некротического энтерита, и/или некрогеморрагического энтерита в частности субклинического некротического энтерита, и/или некрогеморрагического энтерита у животных, предпочтительно свиней или домашней птицы, содержащая штаммы и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, и/или бациллен или его производное.

Таким образом, дополнительным предпочтительным объектом в данном контексте является терапевтическая композиция для лечения, и/или предотвращения синдрома ранней смертности у животных, предпочтительно животных, содержащихся в аквакультуре, более предпочтительно ракообразных в частности настоящих креветок и пильчатых креветок, содержащая микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, и/или бациллен или его производное.

Таким образом, дополнительным предпочтительным объектом в данном контексте является терапевтическая композиция для лечения и/или предотвращения заболеваний, вызванных пищевым отравлением, содержащая микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, и/или бациллен или его производное.

Другим предпочтительным объектом в данном контексте, следовательно, является терапевтическая композиция для лечения и/или профилактики бактериального энтерита, гангренозного дерматита, колангиогепатита, клостридиоза, диареи, одышки, вздутия живота, отека мошонки, ножную чесотку, дерматита подушечек конечностей, стрептококкового мастита, хромоты, полиартрита, фибринозного полисерозита, кишечных расстройств после отъема, таких как диарея и отеки после отъема, дизентерии, остеомиелита воспаления суставов и/или костной ткани, воспаления перикарда, спленомегалии, гепатомегалии, реномегалии, застоя крови, некроза, инфаркта печени или селезенки, клапанный эндокардита, сепсиса и/или менингита у животных, предпочтительно у свиней или домашней птицы, включая микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, и/или бациллен, или его производное.

Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения также является лечение и/или профилактика заболевания, в частности заболевания кишечника, связанного с бактериальной инфекцией, вызываемой Clostridia, в частности С. perfringens, и/или Salmonella, в частности S. enterica, предпочтительно S. enterica subsp. enterica enteritidis и/или Vibrio, в частности Vibrio parahaemolyticus, при этом микроорганизм, и/или препарат, и/или композиция по настоящему изобретению, и/или бациллен, или его производное вводят животному, нуждающемуся в этом, причем животными предпочтительно являются свиньи или птицы.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также является лечение и/или профилактика заболевания, в частности заболевания кишечника, предпочтительно некротического энтерита или некрогеморрагического энтерита, в частности субклинического некротического энтерита или субклинического некрогеморрагического энтерита, при котором микроорганизм, и/или препарат, и/или композицию по настоящему изобретению, и/или бациллен, или его производное вводят животному, нуждающемуся в этом, причем животное предпочтительно животными предпочтительно являются свиньи или птицы.

Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения также является лечение и/или профилактика заболевания водных животных, в частности синдрома ранней смертности, при котором микроорганизм, и/или препарат, и/или композиция по настоящему изобретению, и/или бациллен, или его производное вводят нуждающемуся в этом животному, причем животные предпочтительно являются животными, содержащимися в аквакультуре, более предпочтительно ракообразными, в частности настоящими креветками и пильчатыми креветками.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является лечение и/или профилактика заболеваний, вызванных пищевым отравлением, при этом микроорганизм, и/или препарат, и/или композиция по настоящему изобретению и/или бациллин или его производное вводят животному или человеку, нуждающемуся в этом.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения также является лечение и/или профилактика заболеваний, вызванных пищевым отравлением, при этом микроорганизм, и/или препарат, и/или композиция по настоящему изобретению и/или бациллен или его производное наносят на продукт животного происхождения, в частности, на мясо или яйца, чтобы избежать отравления людей.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения также является лечение и/или профилактика заболевания, предпочтительно заболевания свиней или домашней птицы, выбранного из бактериального энтерита, гангренозного дерматита, колангиогепатита, клостридиоза, диареи, одышки, вздутия живота, отека мошонки, пододерматина, дерматит подушечек стопы, стрептококкового мастита, хромоты, артрита, полиартрита, фибринозного полисерозита, кишечных расстройств после отлучения от груди, такие как диарея после отлучения от груди и отечной болезни, дизентерия, остеомиелита, воспаления суставов и/или костной ткани, воспаления перикарда, спленогалии, гепатомегалии, реномегалии, застоя, некроза, инфаркта печени или селезенки, клапанного эндокардита, сепсиса и/или менингита, при которых микроорганизм и/или препарат, и/или композиция по настоящему изобретению и/или бациллен или его производное вводят животное, нуждающееся в этом.

Микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению можно вводить животным с кормом и/или питьевой водой в течение нескольких дней на протяжении всей жизни животного или на определенных стадиях или этапах жизни животного. Например, микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции можно вводить только в стартовый рацион или только в финишный рацион сельскохозяйственных животных.

Объектом настоящего изобретения также является способ улучшения здоровья людей, и/или улучшения общего физического состояния людей, и/или повышения устойчивости человека к болезням, и/или усиления иммунного ответа человека, и/или создания или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у людей, при этом микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, и/или бациллен или его производное вводят людям.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также является применение микроорганизмов, и/или препаратов, и/или композиций по настоящему изобретению для улучшения здоровья людей, и/или для улучшения общего физического состояния людей, и/или для усиления, резистентности людей к заболеваниям, и/или для повышения иммунного ответа людей, и/или для создания или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у людей, при этом микроорганизмы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, и/или бациллен, или их производные вводят людям.

Композиции по настоящему изобретению, в частности кормовые, пищевые и фармацевтические композиции, а также вода для питья или сельского хозяйства, предпочтительно содержат микроорганизмы по настоящему изобретению и вводят животным в количестве примерно от 1×10³ до примерно 2×10¹² КОЕ/г корма или мл воды, в частности, из расчета примерно 1×10³, или примерно 1×10⁴, или примерно 1×10⁵, или примерно 1×10⁶, или примерно 1×10⁷, или примерно 1×10⁸, или примерно 1×10⁹, или примерно 1×10¹⁰, или примерно 1×10¹¹, или примерно 1×10¹² КОЕ/г корма, или мл воды, предпочтительно в количество от примерно 1×10⁴ до примерно 1×10¹⁰ КОЕ/г корма или мл воды, более предпочтительно в количестве от 1×10⁴ до 1×10⁷ КОЕ/г корма или мл воды.

Соответственно, предпочтительные количества штаммов и/или препаратов по настоящему изобретению в кормах, пищевых продуктах и водных композициях по настоящему изобретению составляют предпочтительно от 0,1 до 10 мас. %, более предпочтительно от 0,2 до 5 мас. %, в частности от 0,3 до 3 мас. %.

Способы по настоящему изобретению можно применять для всех видов животных, в частности, для всех видов животных, кроме человека и насекомых, более предпочтительно для всех видов позвоночных, таких как млекопитающие, водные животные и птицы.

Животные, которым может быть полезно настоящее изобретение, включают, но ими перечень не ограничивают, сельскохозяйственных животных, домашних животных, экзотических животных, животных из зоопарков, водных животных, животных, используемых для занятий спортом, отдыха или работы.

Домашними животными предпочтительно являются собаки, кошки, домашние птицы и домашние экзотические животные.

Водных животных предпочтительно выбирают из рыб и ракообразных, которые предпочтительно предназначены для питания человека. К ним, в частности, относятся карп, тилапия, сом, тунец, лосось, форель, баррамунди, лещ, окунь, треска, креветки, омары, крабы, креветки и раки. Предпочтительными видами лосося в этом контексте являются атлантический лосось, красный лосось, лосось масу, королевский лосось, кетовый лосось, кижуч, дунайский лосось, тихоокеанский лосось и горбуша.

Другими предпочтительными водными животными являются искусственно выращиваемая рыба, которую впоследствии перерабатывают с получением рыбной муки или рыбьего жира. В этой связи предпочтительнее используют сельдь, минтая, менхадена, анчоусов, мойву или треску.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения животными являются сельскохозяйственные животные, такие как домашняя птица, свиньи и жвачные животные.

Домашняя птица может быть выбрана из сельскохозяйственной птицы, а также из декоративной птицы или дикой птицы.

В этом контексте предпочтительными сельскохозяйственными птицами являются куры, индейки, утки и гуси. Продуктивное поголовье в этом контексте предпочтительно представляет домашняя птица, оптимизированная для производства молодняка, или домашняя птица, оптимизированная для получения мяса.

Предпочтительными декоративными домашними птицами или дикими птицами являются павлины, фазаны, куропатки, азиатская каменная куропатка, цесарки, перепела, глухари, куропатки, голуби и лебеди, причем особенно предпочтительны перепела.

Другими предпочтительными домашними птицами являются бескилевые птицы, в частности африканские страусы и эму, а также попугаи.

Жвачными животными по настоящему изобретению предпочтительно являются крупный рогатый скот, козы и овцы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению можно скармливать преджвачным животным для улучшения их здоровья и, в частности, для снижения случаев диареи у этих животных. Преджвачные животные - это жвачные животные, включая телят, в возрасте от рождения до примерно двенадцати недель.

Поэтому в более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ кормления животных, предпочтительно наземных животных, в частности свиней или птиц, или водных животных, в частности ракообразных, таких как настоящие креветки и пильчатые креветки, включает введение животным микроорганизма, продуцирующего бациллен, или его препарата, или кормовой композиции, содержащей микроорганизмы, продуцирующие бациллен, или его препарат.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один носитель или типичный ингредиент корма или их комбинации.

Соответствующие носители представляют собой инертные ингредиенты препарата, добавленные для улучшения извлечения, эффективности или физических свойств и/или для облегчения упаковки и введения. Такие носители можно добавлять по отдельности или в комбинации. Эти носители могут быть выбраны из агентов, препятствующих слеживанию, антиокислительных агентов, наполнителей и/или защитных агентов. Примеры полезных носителей включают полисахариды (в частности, крахмалы, мальтодекстрины, метилцеллюлозы, камеди, хитозан и/или инулины), источники белка (в частности, сухое обезжиренное молоко и/или порошок из сыворотки), пептиды, сахара (в частности, лактозу, трегалоза, сахарозу и/или декстрозу), липиды (в частности, лецитин, растительные масла и/или минеральные масла), соли (в частности, хлорид натрия, карбонат натрия, карбонат кальция, мел, известняк, карбонат магния, фосфат натрия, фосфат кальция, фосфат магния и/или цитрат натрия) и силикаты (в частности глины, в частности беолитовая глина, аморфный кремнезем, коллоидный/осажденный кремнезем, цеолиты, фуллерова земля, байлит, клинтполит, монтмориллонит, диатомитовая земля, тальк, бентониты и/или силикатные соли, такие как силикат алюминия, магния и/или кальция). Подходящие носители для кормовых добавок указаны в официальном ежегодном издании American Feed Control Officials, Inc. См., например, официальную публикацию официальных органов по контролю за кормами США, под ред. Sharon Krebs, издание 2006 г., ISBN 1-878341-18-9. Носители могут быть добавлены после концентрирования ферментационного бульона и/или во время и/или после сушки. Предпочтительные носители согласно изобретению выбирают из карбоната кальция, диатомовой земли и растительного масла.

Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются композиции концентратов, в частности композиции кормовых добавок, то есть композиции, применимые для приготовления кормовой композиции, которые содержат по меньшей мере один микроорганизм по настоящему изобретению и по меньшей мере один носитель, согласно указанному выше, где по меньшей мере один микроорганизм предпочтительно содержится в количестве от 0,1 до 10 мас. %, более предпочтительно в количестве от 0,2 до 5 мас. %, в частности в количестве от 0,3 до 3 мас. %, прежде всего в количестве от 0,4 до 2,2 мас. %, и по меньшей мере один носитель предпочтительно содержится в количестве, по меньшей мере, 90 мас. %, предпочтительно в количестве от 90 до 99,9 мас. %, более предпочтительно в количестве от 95 до 99,8 мас. %., в частности, в количестве от 97 до 99,7 мас. %, прежде всего в количестве от 97,8 до 99,6 мас. %, и где носитель предпочтительно состоит в основном из известняка, в частности, из известняка с меньшими долями диатомитовой земли и/или растительного масла.

Такие предпочтительные композиции по настоящему изобретению, которые содержат стабилизированные микроорганизмы, могут использоваться для приготовления кормов и фармацевтических композиций, а также для получения питьевой воды и воды для сельского хозяйства, которые предпочтительно содержат штаммы по настоящему изобретению в количестве, указанном в описании выше. В предпочтительном варианте осуществления от 50 до 1000 грамм такой композиции концентрата, в частности 50, 100, 250, 500 или 1000 грамм такой композиции концентрата, используют на тонну корма, питьевой воды или воды для сельского хозяйства для получения композиций, которые могут быть использованы, для кормления животных. Эти композиции концентратов предпочтительно содержат по меньшей мере один штамм по настоящему изобретению в количестве от 1×10⁹ до 2×10¹¹ КОЕ, в частности от 2×10⁹ до 1×10¹¹ КОЕ, на грамм композиции концентрата.

Исходя из композиций этих концентратов, кормовые и пищевые композиции могут быть приготовлены путем смешивания композиций концентратов с типичными кормовыми или пищевыми ингредиентами, соответственно.

Соответствующие типичные ингредиенты кормов для животных, которые могут содержаться в композициях согласно настоящему изобретению и/или применяться при приготовлении кормовых композиций, начиная с композиций концентратов согласно настоящему изобретению, включают один или несколько из следующих компонентов: белков, углеводов, жиров, других пробиотиков, пребиотиков, ферментов, витаминов, иммуномодуляторов, заменителей молока, минералов, аминокислот, кокцидиостатиков, продуктов на основе кислот и/или лекарств, таких как антибиотики.

Компоненты, содержащие углеводы, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, представляют собой, например, фураж, грубые корма, пшеничную муку, подсолнечную муку или соевую муку и их смеси.

Компоненты, содержащие белки, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, представляют собой, например, соевый белок, гороховый белок, пшеничный глютен или кукурузный глютен и их смеси.

Жиры, содержащие компоненты, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, представляют собой, в частности, масла как животного, так и растительного происхождения, такие как растительные масла, например, соевое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло, льняное масло или пальмовое масло, рыбий жир и их смеси.

Белки, содержащие компоненты, которые дополнительно содержат жиры, которые могут использоваться согласно настоящему изобретению, представляют собой, например, рыбную муку, муку криля, муку двустворчатых моллюсков, муку кальмаров или панцири креветок, а также их комбинации.

Другие пробиотики (DFM), которые можно использовать согласно настоящему изобретению в комбинации с микроорганизмами и препаратами по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой бактерии, выбранные из видов Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus pumilus, Bacillus laterosporus, Bacillus coagulans, Bacillus alevi, Bacillus cereus, Bacillus badius, Bacillus thurigiensis, Enterococcus faecium и Pediococcus acidilactici. Предпочтительными примерами являются штамм Bacillus subtilis DSM 32539 (депонированный в коллекции DSMZ 14 июня 2017 г. в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры) и его производные, Bacillus licheniformis DSM 32314 и Bacillus subtilis DSM 32315 (оба штамма депонированы в DSMZ 12 мая 2016 г. в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры) и их производные, штамм Bacillus subtilis РВ6 (штамм описан в US 7247299 и депонирован в коллекции АТСС под номером РТА-6737), который продается фирмой Kemin под торговой маркой CLOSTAT®, штамм Bacillus subtilis С-3102 (описанный в US 4919936 и депонированный как FERM BP-1096 Исследовательским институтом ферментации Агентства промышленной науки и технологий в Японии), который продается Calpis как продукт CALSPORIN®, Bacillus subtilis DSM 17299, который продается фирмой Chr. Hansen под торговой маркой GalliPro®, штамм Bacillus licheniformis DSM 17236, который продается фирмой Chr. Hansen под торговой маркой GalliProTect®, смесь спор Bacillus licheniformis DSMZ 5749 и Bacillus subtilis DSMZ 5750, которая продается фирмой Chr. Hansen под торговой маркой BioPlus®YC, В. subtilis DSM 29784, который продается фирмой Adisseo/Novozymes под торговой маркой Alterion®, Bacillus subtilis, который продается фирмой Chr. Hansen под торговой маркой PORCBOOST®, или штаммы Bacillus coagulans, описанные в US 6849256. Другие, не бациллярные пробиотики, такие как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae или Hansenula, также могут быть применены в композициях по настоящему изобретению. В частности, в пищевых композициях могут использоваться другие пробиотики, которые, как известно, полезны для здоровья человека, такие как бактерии, продуцирующие молочную кислоту, в частности лактобациллы или бифидобактерий. Если указанные дополнительные пробиотики не входят в состав композиций по настоящему изобретению, их можно вводить вместе (в одно и то же время или в разное время) с композициями по настоящему изобретению. Если указанные дополнительные пробиотики не входят в состав композиций по настоящему изобретению, их можно вводить вместе (в одно и то же время или в разное время) с композициями по настоящему изобретению.

Пребиотики, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представляют собой олигосахариды, в частности выбранные из галактоолигосахаридов, силаилолигосахаридов, лактулозы, лактосукрозы, фруктоолигосахаридов, олигосахаридов палатинозы или изомальтозы, олигосахаридов изомальтозы, гликозилсахарозы, мальтоолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, циклодекстринов, гентиоолигосахаридов, олигосахаридов соевых бобов, ксилоолигосахаридов, декстранов, пектинов, полигалактуронана, рамногалактуронана, маннана, гемицеллюлозы, арабиногалактана, арабинана, арабиноксилана, стойкого крахмала, мехбиоза, хитозана, агарозы, инулина, тагатозы, полидекстрозы и альгината.

Ферменты, которые могут использоваться в кормовых композициях по настоящему изобретению и которые могут способствовать перевариванию корма, предпочтительно выбирают из фитаз (ЕС 3.1.3.8 или 3.1.3.26), ксиланаз (ЕС 3.2.1.8), галактаназ (ЕС 3.2..1.89), галактозидаз, в частности альфа-галактозидазы (ЕС 3.2.1.22), протеазы (ЕС 3.4), фосфолипазы, в частности фосфолипазы А1 (ЕС 3.1.1.32), А2 (ЕС 3.1.1.4), С (ЕС 3.1.4.3) и D (ЕС 3.1.4.4), лизофосфолипазы (ЕС 3.1.1.5), амилазы, в частности альфа-амилазы (ЕС 3.2.1.1); лизоцимов (ЕС 3.2.1.17), глюканазы, в частности бета-глюканазы (ЕС 3.2.1.4 или ЕС 3.2.1.6), глюкоамилазы, целлюлазы, пектиназы или любых их смесей.

К примерам коммерчески доступных фитаз относятся продукты Bio-Feed™ Phytase (фирма Novozymes), Ronozyme® Р и HiPhos™ (фирма DSM Nutritional Products), Natuphos™ (фирма BASF), Finase® и Quantum® Blue (фирма AB Enzymes), Phyzyme® XP (фирма Verenium/DuPont) и Axtra® PHY (фирма DuPont). К другим предпочтительным фитазам относятся, например, фитазы, описанные в WO 98/28408, WO 00/43503 и WO 03/066847.

К примерам коммерчески доступных ксиланаз относятся продукты Ronozyme® WX и G2 (фирма DSM Nutritional Products), Econase® XT и Barley (фирма AB Vista), Xylathin® (фирма Verenium) и Axtra® XB (ксиланаза/бета-глуканаза, фирма DuPont). К примерам коммерчески доступной протеазы относится продукт Ronozyme® ProAct (фирма DSM Nutritional Products).

Витамины, которые можно применять по настоящему изобретению, представляют собой, например, витамин А, витамин D3, витамин Е, витамин K, например витамин K3, витамин В12, биотин, холин, витамин В1, витамин В2, витамин В6, ниацин, фолиевую кислоту и пантотенат, например, Ca-D-пантотенат или их комбинации.

Иммунными модуляторами, которые можно применять, являются, например, антитела, цитокины, высушенную распылением плазму, интерлейкины или интерфероны или их комбинации.

Минералы, которые можно использовать по настоящему изобретению, представляют собой, например, бор, кобальт, хлорид, хром, медь, фторид, йодид, железо, марганец, молибден, селен, цинк, кальций, магний, калий или натрий или их комбинации.

Аминокислоты, которые можно использовать по настоящему изобретению, представляют собой, например, лизин, аланин, треонин, метионин или триптофан или их комбинации.

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ приготовления композиции корма для животных, включающий смешивание по меньшей мере одного микроорганизма, и/или по меньшей мере одного препарата, и/или по меньшей мере одной композиции концентрата по настоящему изобретению, в частности, в количестве, эффективном для улучшения здоровья животных, в частности здоровья кишечника, с ингредиентами корма, такими как белки, липиды и/или углеводы, и, необязательно, другими полезными веществами, предпочтительно, как упомянуто ранее, для получения корма. Этот способ может включать, например, также стадию гранулирования.

Могут применяться стандартные процессы гранулирования, известные специалистам в данной области, включая экструзионную обработку сухих или полувлажных кормов. Предпочтительные температуры гранулирования составляют от примерно 65°С до примерно 120°С.

Микроорганизмы и композиции по настоящему изобретению могут быть получены путем культивирования микроорганизмов по настоящему изобретению в соответствии со способами, хорошо известными в данной области, в том числе с использованием среды и других методов, как описано, например, в US 6060051, ЕР0287699 или US2014/0010792. Обычные процессы крупномасштабного микробного культивирования включают ферментацию в погруженном состоянии, ферментацию в твердом состоянии или культивирование на жидкой поверхности. К концу ферментации, когда питательные вещества истощаются, клетки начинают переход от фазы роста к фазе споруляции, так что конечным продуктом ферментации в основном являются споры, метаболиты и остаточная среда ферментации. Споруляция является частью естественного жизненного цикла этих микроорганизмов и обычно инициируется клеткой в ответ на ограничение питательных веществ. Ферментация предназначена для получения высоких концентраций колониеобразующих единиц клеток и для стимулирования споруляции. Бактериальные клетки, споры и метаболиты в культуральной среде, полученные в результате ферментации, можно использовать напрямую или концентрировать обычными промышленными методами, такими как центрифугирование, фильтрация с тангенциальным потоком, глубинная фильтрация и выпаривание. Концентрированный ферментационный бульон можно промывать, например, с помощью процесса диафильтрации, для удаления остаточного ферментационного бульона и метаболитов.

Ферментационный бульон или концентрат бульона можно сушить с добавлением носителей или без них, используя обычные процессы или способы сушки, такие как распылительная сушка, сублимационная сушка, сушка на лотках, сушка в псевдоожиженном слое, барабанная сушка или выпаривание. Полученные сухие продукты можно дополнительно обрабатывать, например, измельчением или гранулированием, для достижения определенного размера или физического формата частиц. Носители, как описано выше, также могут быть добавлены после сушки.

Препараты микроорганизмов по настоящему изобретению, которые являются объектом настоящего изобретения, могут быть бесклеточными препаратами или препаратами, содержащими клеточный дебрис, или препаратами, содержащими смесь интактных клеток и клеточного дебриса. Конкретными примерами препаратов микроорганизмов являются супернатант ферментационного бульона, полученный после завершения ферментации, а также препараты цитозоля, которые могут быть получены путем разрушения микробных клеток.

Бесклеточные препараты микроорганизмов по настоящему изобретению можно получить, например, центрифугированием и/или фильтрацией ферментационного бульона, и/или центрифугированием, и/или фильтрацией суспензии, полученной после разрушения микробных клеток. В зависимости от используемой методики эти бесклеточные препараты могут быть не полностью лишенными клеток, но все же могут содержать меньшее количество клеток или клеточного дебриса. Поскольку клетки секретируют такие соединения, как метаболиты, ферменты и/или пептиды, в окружающую среду, супернатант клеток содержит смесь таких соединений, в частности метаболитов, ферментов и/или пептидов, секретируемых клетками. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат микроорганизмов представляет собой супернатант ферментированного бульона.

Композиции, содержащие клеточный дебрис микроорганизмов, могут быть получены путем разрушения клеток с применением методов, известных специалистам в данной области, например, механическими средствами или приложением высокого давления. В зависимости от степени приложенной силы получают композицию, содержащую только разорванные клетки, или композицию, содержащую смесь клеточного дебриса и интактных клеток. Гомогенизация клеток может быть реализована, например, с использованием пресса для ячеек French, ультразвукового устройства, гомогенизатора, микрофлюидизатора, шаровой мельницы, стержневой мельницы, галечной мельницы, бисерной мельницы, измельчающего валка высокого давления, ударного механизма с вертикальным валом, промышленного смесителя, смесителя с большими сдвиговыми усилиями, лопастной смеситель и/или гомогенизатор Polytron. Допустимыми альтернативами являются ферментативная и/или химическая обработка клеток.

Бесклеточные препараты по настоящему изобретению включают также препараты, которые получают сначала путем разрушения клеток с применением упомянутых ранее методик и последующим удалением клеточного дебриса и оставшихся интактных клеток. Удаление клеточного дебриса и оставшихся неповрежденных клеток можно проводить, в частности, центрифугированием и/или фильтрацией.

Препараты микроорганизмов по настоящему изобретению могут содержать помимо бациллена в качестве активных соединений по меньшей мере один дополнительный метаболит, предпочтительно смесь дополнительных метаболитов, как дополнительно описано ниже, и/или по меньшей мере один фермент, выбранный из протеаз, в частности, субтилизина, ксиланаз и/или целлюлаз, и/или по меньшей мере одного пептида, и/или их комбинации.

Препарат, содержащий эффективную смесь метаболитов из микроорганизмов по настоящему изобретению и/или содержащихся в клеточных препаратах, как упомянуто ранее, может быть получен, например, способами, изложенными в патенте US 6060051. В частности, препарат может быть получен путем осаждения метаболитов, содержащихся в препаратах, упомянутых выше, с использованием органических растворителей, таких как этилацетат, и последующим повторным растворением осажденных метаболитов в подходящем растворителе. Метаболиты впоследствии могут быть очищены фильтрацией исключения по размеру, которая группирует метаболиты в различные фракции на основе отсечения по молекулярной массе.

Препарат, содержащий бациллен и эффективную смесь других метаболитов по настоящему изобретению, предпочтительно содержит по меньшей мере три, более предпочтительно по меньшей мере 4, 5, 6, 8, 10 или 12, в частности все метаболиты микроорганизмов по настоящему изобретению. Метаболиты обладают предпочтительно молекулярной массой от 400 до 4000 Да, более предпочтительно от 500 до 3500 Да.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно всегда применять эффективное количество микроорганизмов, и/или препаратов, и/или композиций по настоящему изобретению, и/или бациллена, или его производного в вариантах осуществления настоящего изобретения. Термин «эффективное количество» относится к количеству, которое оказывает по крайней мере один положительный эффект на животное и/или окружающую среду, в частности, в отношении характеристик, как уже упоминалось ранее, по которым сравнивают с животными, которым не вводят штаммы, и/или препараты, и/или композиции по настоящему изобретению, но которые помимо этого получают ту же диету (включая корм и другие соединения).

В случае терапевтического применения предпочтительно используют терапевтическое количество микроорганизмов, и/или препаратов, и/или композиций по настоящему изобретению. Термин «терапевтическое количество» относится к количеству, достаточному для облегчения, исчезновения или предотвращения болезненного состояния у животного. Оптимальные уровни дозировки для различных животных могут быть легко определены специалистами в данной области путем оценки, среди прочего, способности композиции (i) подавлять или уменьшать количество патогенных бактерий в кишечнике при различных дозах, (ii) повышать или поддерживать уровни полезных бактерий и/или (iii) улучшать здоровье животных, в частности здоровье кишечника, в различных дозах.

Рабочие примеры

Пример 1. Оценка способности пробиотических штаммов В. amyloliquefaciens, кодирующих кластер биосинтеза бациллена, подавлять патогены

Исследуют предполагаемое действие бациллена на подавление патогена пробиотическим штаммом Bacillus, используя тест с лунками для оценки антагонизма (Parente с соавт., 1995). Штамм DSM 33014 и другой пробиотический штамм В. amyloliquefaciens, продуцирующий бациллен («B. amyloliquefaciens штамм А») применяют в качестве тестов. Для В. amyloliquefaciens штамма А осуществляют нокаут гена baeJ и разрушают его, что делает этот штамм неспособным продуцировать бациллен (Chen с соавт., 2006). Кроме того, был протестирован штамм В. subtilis («В. subtilis штамм В»), который не несет генного кластера бациллена.

Осуществляют тестирование методом диффузии из лунок для определения антагонизма в отношении разных патогенов: S. enterica subsp.enterica enteritidis DSM 14221, E. coli ATCC 11775, Vibrio parahaemolyticus DSM 10027 и С. perfringens ATCC 13124.

Штаммы Bacillus выращивают в 10 мл среды LB Kelly, содержащей в расчете на 1 л, 40 г соевого пептона, 40 г декстрина 10, 1,8 г KH₂PO₄, 4,5 г K₂HPO₄, 0,3 г MgSO₄ • 7Н₂О и 0,2 мл раствора микроэлементов KellyT (согласно описанию Scholz с соавт., 2011), в течение 16 ч при 37°С в качалочных колбах при объемом 100 мл при скорости 200 об/мин. Патогенные штаммы выращивают в соответствующих условиях в жидкой среде до оптической плотности не менее 1 при 600 нм, затем 130 мкл распределяют стерильным шпателем по поверхности агара в чашках. Для всех патогенов используют чашки с агаром TSBYE (30 г/л TSB+6 г/л дрожжевого экстракта). В чашках с застывшим агаром вырезают лунки диаметром 9 мм. Первую лунку используют в качестве контроля с незасеянной средой, в другие лунки вносят по 100 мкл культуры Bacillus с оптической плотностью при 600 мм, доведенной до 5. Для анализов с Е. coli ATCC 11775 и S. enterica subsp.enterica enteritidis DSM 14221 чашки инкубируют в течение 24 ч в анаэробных условиях и затем дополнительно 16 ч в аэробных условиях. В каждой чашке смотрят наличие зон отсутствия роста вокруг лунок. Размер диаметра зон отсутствия роста определяют в мм. Каждую зону измеряют дважды в двух взаимно перпендикулярных направлениях и по ним усредняют итоговый результат размера зоны. Результаты представлены в табл.1 и 2. Для анализа с тест-штаммом V. parahaemolyticus DSM 10027 культуры Bacillus выращивают только в течение 10 ч в среде LB Kelly, оптическую плотность при 600 нм доводят до 10; чашки с лунками в агаре инкубируют в анаэробных условиях 24 ч (см. табл. 3). Для анализа в чашках с агаром методом лунок для определения подавления роста тест-штамма С. perfringens ATCC 13124 культуры Bacillus выращивают в течение 16 ч, при 600 нм оптическую плотность доводят до 5, затем чашки инкубируют в анаэробных условиях 24 ч и сразу анализируют (табл. 4).

Представленные данные показывают, что штаммы В. amyloliquefaciens, которые продуцируют бациллен, ингибируют рост S. enterica subsp.enterica enteritidis DSM 14221, тогда как мутант с нокаутом baeJ и штамм В. subtilis, которые не продуцируют бациллен, не ингибируют патоген.

Данные показывают, что штаммы В. amyloliquefaciens, продуцирующие бациллен, ингибируют рост E.coli ATCC 11775, тогда как мутант с нокаутом гена baeJ и штамм В. subtilis, которые не продуцируют бациллена, не подавляют патоген.

Данные показывают, что штаммы В. amyloliquefaciens, продуцирующие бациллен, ингибируют рост V. parahaemolyticus DSM 10027, тогда как мутант с нокаутом гена baeJ, не продуцирующий бациллен, не ингибирует патоген.

Данные показывают, что штаммы В. amyloliquefaciens, продуцирующие бациллен, ингибируют рост С. perfringens ATCC 13124, тогда как мутант с нокаутом гена baeJ, не продуцирующий бациллен, уменьшает подавление С. perfringens ATCC 13124.

Подавление С. perfringens ATCC 13124 штаммом В. amyloliquefaciens DSM 33014 анализируют в жидкой среде. В. amyloliquefaciens DSM 33014 выращивают в течение ночи в 10 мл среды LB Kelly. Культуру центрифугируют и фильтруют через мембрану из ацетата целлюлозы с порами 0,2 мм для удаления клеток и спор. Супернатант без клеток и спор, смешивают в соотношении 1:10 с сердечно-мозговым экстрактом двойной концентрации (бульон GranuCultTM BHI, фирма Merck). В качестве отрицательного контроля используют среду LB Kelly вместо супернатанта, свободного от клеток и спор. С. perfringens ATCC 13124 выращивают в анаэробных условиях при 37°С в течение ночи в среде 2xBHI и вносят в пропорции 1:10 в смесь супернатант/2xBHI и отрицательный контроль при разведении 1:100. При росте в течение ночи при 37°С признаков роста С. perfringens ATCC 13124 не было (прозрачная среда) в присутствии супернатанта В. amyloliquefaciens DSM 33014, свободного от клеток и спор, но наблюдают обильный рост в отрицательном контроле (мутная среда). Таким образом, штамм В. amyloliquefaciens DSM 33014, имеющий бацилленовый кластер, способен ингибировать С. perfringens ATCC 13124 в жидкой среде.

Литература

Parente Е., Brienza С, Moles М., Ricciardi A. A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity. Journal of microbiological methods, 22(1), 1995, 95-108.

Chen X.-H., Vater J., Piel J., Franke P., Scholz R., Schneider K., Koumoutsi A., Hitzeroth G., Grammel N., Strittmatter A.W., Gottschalk G., Süssmuth R., Borriss R. Structural and Functional Characterization of Three Polyketide Synthase Gene Clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB 42. Journal of Bacteriology, 188(11), 2006, 4024-4036.

Пример 2. Характеристики штамма, влияющие на его выживаемость в желудочно-кишечном тракте.

В. amyloliquefaciens DSM 33014 подвергают скринингу на устойчивость к различным условиям окружающей среды и кишечника, чтобы иметь возможность полностью раскрыть свой потенциал в кишечнике целевого животного, свойства лучшего штамма для прямого кормления животных в качестве микробов/пробиотиков.

В. amyloliquefaciens DSM 33014 выращивают в течение ночи в среде Difco для споруляции для формирования спор (DSM, состав на литр: 8 г питательного бульона бакто, 10 мл 10% (мас./об.) KCl, 10 мл 1,2% (мас./об.) MgSO₄ ⋅ 7H₂O и 1 мл 1М Ca(NO₃)₂, 1 мл 0,01М MnCl₂, 1 мл 1 мМ FeSO₄) при 37°С (Monteiro с соавт., 2005). Этот раствор используют для оценки термостабильности спор для определения устойчивости к гранулированию путем выдержки спор при температуре 80°С в течение 10 мин (Leuschner, Bew, 2003) и устойчивости к желчи. Образец суспензии спор наносят в чашки со средой VIB (Difco™ Veal Infusion Broth, BD), pH 7. Планшеты инкубируют при 37°C и анализируют на модели прорастания спор.

Кроме того, исследуют выживаемость спор и дают качественную оценку устойчивости вегетативных клеток к желчи. 3 мкл термически обработанного раствора спор вносят в планшеты VIB, содержащие 0,3% куриной желчи или 0,3% свиной желчи (фирма Sigma). Планшеты инкубируют в течение ночи при 37°С и исследуют на рост штамма.

Споры штамма DSM 33014 остаются жизнеспособными после термической обработки при 80°С в течение 10 мин. Кроме того, штамм DSM 33014 может расти в присутствии 0,3% куриной желчи или 0,3% свиной желчи.

Литература

Monteiro S.M., Clemente J.J., Henriques А.О., Gomes R.J., Carrondo M.J., Cunha A.E. A procedure for high-yield spore production by Bacillus subtilis. Biotechnology Progress, 21(4), 2005, 1026-1031.

Scholz R., Molohon K.J., Nachtigall J., Vater J., Markley A.L., Süssmuth R.D., Mitchell D.A. Borriss R. Plantazolicin, a novel microcin B17/streptolysin S-like natural product from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Journal of Bacteriology, 193(1), 215, 2011,24.

Leuschner R.G.K., Bew J. Enumeration of Probiotic Bacilli Spores in Animal Feed: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International, 86(3), 2003, 568-575.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Bacillus amyloliquefaciens, продуцирующий бациллен и депонированный как DSM 33014 в DSMZ - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур Института Лейбница, 7 февраля 2019 г. Штамм подавляет рост C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus. Штамм используют в способе кормления животных, способе улучшения состояния здоровья, способе улучшения общего физического состояния животных, способе снижения уровня смертности животных, способе установления или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у животных, способе предотвращения вредного воздействия навоза или загрязненных жидкостей на окружающую среду, способе контроля и/или улучшения качества воды или водных растворов, способе лечения или профилактики микробного заболевания культурных растений. 9 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

1. Штамм Bacillus amyloliquefaciens, продуцирующий бациллен, депонированный как DSM 33014 в DSMZ - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур Института Лейбница, 7 февраля 2019 г.

2. Штамм по п. 1, отличающийся тем, что подавляет рост C. perfringens, в частности C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica, в частности Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli, в частности E. coli ATCC11775, и/или Vibrio parahaemolyticus, в частности Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

3. Способ кормления животных, включающий введение животным штамма по любому из пп. 1 или 2.

4. Способ по п. 3, в котором животными являются наземные животные, в частности свиньи или птицы, или водные животные, в частности ракообразные, такие как настоящие креветки и пильчатые креветки.

5. Способ улучшения состояния здоровья, включающий введение животному или человеку штамма по любому из пп. 1 или 2, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

6. Способ по п. 5, в котором улучшается состояние здоровья кишечника животного или человека.

7. Способ по п. 5, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

8. Способ улучшения общего физического состояния животных, в котором штамм по любому из пп. 1 или 2 вводят животным, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

9. Способ по п. 8, в котором животными являются водные животные.

10. Способ по п. 8, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

11. Способ снижения уровня смертности животных, в котором штамм по любому из пп. 1 или 2 вводят животным, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

12. Способ по п. 11, в котором животными являются водные животные.

13. Способ по п. 11, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

14. Способ установления или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у животных, в котором штамм по любому из пп. 1 или 2 вводят животным, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

15. Способ по п. 14, в котором животными являются водные животные.

16. Способ по п. 14, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

17. Способ предотвращения вредного воздействия навоза или загрязненных жидкостей на окружающую среду, который включает стадию внесения в навоз или загрязненные жидкости штамма по любому из пп. 1 или 2, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

18. Способ по п. 17, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

19. Способ контроля и/или улучшения качества воды или водных растворов, включающий стадию внесения в воду или водный раствор штамма по любому из пп. 1 или 2, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

20. Способ по п. 19, в котором водой является питьевая вода или вода для сельского хозяйства.

21. Способ по п. 19, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.

22. Способ лечения или профилактики микробного заболевания культурных растений, включающий стадию нанесения на культивируемое растение штамма по любому из пп. 1 или 2, причем действие вызвано ингибирующим действием на C. perfringens, Salmonella enterica, E. coli и/или Vibrio parahaemolyticus.

23. Способ по п. 22, в котором C. perfringens является C. perfringens ATCC 13124, Salmonella enterica является Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis DSM 14221, E. coli является E. coli ATCC11775 и/или Vibrio parahaemolyticus является Vibrio parahaemolyticus DSM 10027.