СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ЭКООБУСЛОВЛЕННОЙ НЕФРОПАТИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, точнее к клинической диагностике, а именно к определению степени риска формирования нефропатий у детей из региона, загрязненного тяжелыми металлами.

Известен способ определения экопатологического воздействия на организм тяжелых металлов с помощью исследования тяжелых металлов в моче, в крови, в волосах, ногтях, тканях почек на атомно-абсорбционном спектрофотометре. Однако прохождение через организм тяжелых металлов не всегда приводит к формированию экообусловленных нефропатий, что зависит от генетически обусловленной гиперчувствительности организма к экопатогенам. При существующих допороговых уровнях загрязнения биосферы значительно часто у детей определяются мутации генов соматических клеток и митохондриальных генов. Соматические мутации не наследуются, но лежат в основе пограничных состояний, стойких нарушений состояния здоровья, хронизации патологических процессов [Вельтищев Ю. Е. и др. Экология и здоровье детей (экотоксикологическое направление). - Материнство и детство, 1992, N 12, с. 30-35).

Наследственный полиморфизм является одним из механизмов поддерживания изменчивости в популяциях, установления адаптации человека к разнообразным условиям внешней среды на биохимическом уровне, а также для выявления возможных связей между частотами распределения определенных маркеров генов и болезнями [Спицин В.П., 1985; Srivastava N. et. al., 1985].

Существует способ определения ассоциации между генетическими маркерами, которые включаются в метаболические процессы по обезвреживанию или ингибиции ксенобиотиков, и повышенной чувствительности к тяжелым металлам у детей с эконефропатиями. В качестве генетических маркеров исследованы полиморфные белки крови и, в частности, при нефропатии, обусловленной неблагоприятным воздействием тяжелых металлов, выявлена повышенная частота редкого варианта Tf C₁-C₃ по сравнению с контрольной группой (p > 0,05) [Османов И.М., 1996]. Недостатком этого способа является отсутствие доказательств непосредственного воздействия конкретного экопатогенного фактора, обуславливающего развитие нефропатии у детей.

Для определения непосредственного воздействия экопатогенов на организм, в частности на иммунную систему, используется метод определения приобретенных генных мутаций в соматических клетках, однако этот метод не был использован для выявления риска развития эконефропатий у детей.

Целью разработки способа и изобретения является повышение качества определения риска развития эконефропатии у детей из региона, загрязненного тяжелыми металлами.

Теоретическим обоснованием предлагаемого способа является возможность оценки гиперчувствительности организма к ксенобиотикам на основании определения количества соматических клеток (T-лимфоцитов), дефицитных по ГГФРТ, в качестве маркеров соматических мутаций (Becker M.A. et. al., 1992; Cameron J.S., Moro F., Simmonds H.A., 1993].

Один из ферментов биосинтеза пуриновых нуклеотидов - гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансфераза (ГГФРТ) (EC 2.4.2.8) относится к разряду наиболее лабильных белков, легко изменяющихся под действием мутагенов окружающей среды, в частности, солей тяжелых металлов, лекарственных антиметаболитов, пестицидов и некоторых других ксенобиотиков. Дефицит ГГФРТ развивается в результате мутации гена: появляются точечные мутации или малые делеции в длинном плече X-хромосомы (X 26.27.2) [Bеcker M.A., 1976].

Предлагаемый способ основывается на выявлении повышенного числа T-лимфоцитов в микроклонах дефицитных по ГГФРТ клетках с использованием метода Becker M. , et al. (1992). Выявление микроклонов дефицитных по ГГФРТ T-лимфоцитов производится в культуре ткани (48-72 часа) в присутствии мутагена 6-тиогуанина или азагуанина. В таких условиях остаются живыми только мутантные клетки, в то время как нормальные по ГГФРТ включают токсический аналог гуанина и погибают. Подсчет живых (мутантных) T-лимфоцитов в лунках производится в камере Горяева, где подсчитывается количество клеток в опытных лунках по сравнению с контролем (лунки без мутагена).

Выполнение метода. Забор венозной крови (5 мл) осуществляется стерильным одноразовым шприцом, в котором присутствует гепарин (50 ЕД). В условиях стерильного ламинарного бокса гепаринизированная кровь переносится в стерильную центрифужную пробирку и к ней добавляется фитогемагглютинин (ФГА) - 0,05 мл. Затем плотно закрытая пробирка экспозируется 45 минут при 4^oC, а по окончании времени кровь центрифугируется в режиме 1000 об/мин в течение 3 минут. Отобранная надосадочная жидкость (плазма) помещается в CO₂-инкубатор на 24 часа для перевода лимфоцитов в митозный цикл клеточного деления. Для устранения клеток, оставшихся в G₁ фазе, суспензия подвергается облучение гамма-лучами в дозе 1000 рад, 55 сек. По окончании клетки отмываются 3 раза средой Игла, предварительно перед каждой отмывкой осадок разбивается. Далее плотность клеток доводится до 1 млн клеток на 1 мл полной среды на основе RPMI₁₆₄₀ (смесь 3). Из доведенной суспензии по 200 мкл заполняются 2 лунки на 96 луночной плашке: в 1-ю лунку - без 6-тиогуанина (контроль) и во 2-ю - с добавлением 20 мкл раствора 6-тиогуанина (1 реактив). Инкубация плашки протекает в стерильном CO₂-инкубаторе с режимом работы: CO₂ 5%, влажность 98%, t 37^oC). Через 72 часа культуры клеток подсчитывается количество лимфоцитов в камере Горяева с использованием суправитального красителя (равные части: трипановый синий 0,1% и эозин-II 0,1%) (реактива 4) - в опытных и контрольных лунках. Клетки подсчитываются во всей камере Горяева. Расчет проводится по формуле
опыт/контроль • 1 млн клеток.

У практически здоровых детей число T-лимфоцитов, мутированных по ГГФРТ, составляет 0 - 0,2 • 10⁶ кл/мл.

Клинические примеры
Предложенный способ позволяет с большой долей вероятности определять риск формирования экообусловленной нефропатии, которая фенотипически протекает аналогично дизметаболической нефропатии (см. таблицу).

Пример 1. Дима Ч., 7 лет. Проживает в зоне, приближенной к предприятию электронной промышленности, с высокой степенью загрязнения тяжелыми металлами. В родословной со стороны матери имеются почечные заболевания, у матери - гематурия. Микрогематурия у пробанда случайно выявлена в 1 год. При обследовании в стационаре в возрасте 7 лет на основании данных анамнеза, клинико-лабораторных, иммунологических и морфологических исследований был поставлен диагноз: Эконефропатия с гематурией. Тубуло-интерстициальный нефрит с выраженными деструктивно-дизметаболическими изменениями в эпителии извитых канальцев.

Проведенное у ребенка обследование с определением соматических мутаций T-лимфоцитов в локусе ГГФРТ показало, что число живых клеток по сравнению с контролем, инкубированных без мутагена, составляло 5•10⁶ кл/мл.

Пример 2. Катя В., 5 лет. Постоянно проживает в сельской местности, вдали от промышленных районов. В родословной большое число родственников имеет патологию обменного характера, в том числе и мочекаменную болезнь. Впервые изменения в анализах мочи в виде микрогематурии и кристаллурии выявлены при профилактическом осмотре в возрасте 2 лет. При обследовании в отделении с применением клинико-лабораторных методов, рентгено-контрастного исследования и характера изменений цитомембран поставлен диагноз: Дизметаболическая нефропатия с оксалатно-кальциевой кристаллурией.

Определение приобретенных генных мутаций в соматических клетках свидетельствует о нормальном их количестве и составляет 0,4 • 10⁶ кл/мл.

Таким образом, приведенные клинические примеры свидетельствуют о том, что предложенный способ определения риска развития нефропатий у детей из региона, загрязненного тяжелыми металлами, является адекватным для детей с эконефропатиями.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической диагностике. Способ обеспечивает повышение качества определения риска развития эконефропатии у детей из региона, загрязненного тяжелыми металлами. Определяют количества мутантных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазе (ГГФРТ) T-лимфоцитов в культуре клеток в присутствии 6-тиогуанина. Дефицит ГГФРТ развивается в результате мутации гена: появляются точечные мутации или малые делеции в длинном плече Х-хромосомы. Отработан метод выявления микроклонов дефицитных по ГГФРТ Т-лимфоцитов. В таких условиях остаются живыми только мутантные клетки, в то время как нормальные по ГГФРТ включают токсический аналог гуанина и погибают. Повышение числа мутантных клеток более чем в 1,5-5 раз по сравнению с контрольным позволяет установить высокий риск формирования эконефропатии у детей. 1 табл.

Способ определения риска формирования экообусловленной нефропатии у детей из региона, загрязненного тяжелыми металлами, с помощью клинико-генетического анализа, отличающийся тем, что проводят определение количества мутантных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы (ГГФРГ) Т-лимфоцитов в культуре клеток в присутствии 6-тиогуанина и по повышению числа мутантных клеток более чем в 1,5 - 5 раз (опытный вариант) по сравнению с контрольным вариантом устанавливают высокий риск формирования эконефропатии у детей.