СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА Российский патент 2006 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно - к способам экспресс-диагностики свинцовой интоксикации живых биологических тканей и организма в целом, и может быть использовано в профпатологии, токсикологии, терапии и других разделах медицины.

Известны способы определения концентрации свинца в крови и в моче, а также показателей его воздействия (копропорфирина и дельта-аминолевулиновой кислоты) лабораторными методами. Например, один из способов определения свинца в крови и моче заключается в сухом озолении пробы крови и мочи, ее растворении в индифферентном электролите и последующем полярографическом определении свинца (см. «Полярографическое определение микрограммовых количеств свинца в крови» - Павловская Н.А. и др. / Лабораторное дело, №1, 1982. - с.26-29). Для анализа отбирают 1 г крови и 20 мл мочи с гепарином, производят минерализацию биосубстратов с помощью серной и азотной кислот с последующим получением сухого остатка при нагревании на плитке с асбестовой прокладкой и дальнейшем сжигании в муфельной печи. Озоленный остаток крови растворяют соляной кислотой, а мочи фоновым раствором и производят полярографический анализ, предварительно продувая исследуемые растворы инертным газом для удаления из проб окислителей. Перед каждой серией полярографического анализа следует делать контрольную пробу на наличие свинца в реактивах.

Известен способ оценки степени выраженности свинцовой интоксикации, включающий спектрофотометрическое исследование биологического материала организма (Любченко П.Н. Особенности диспансеризации рабочих свинцовых производств / Методические рекомендации. - М.: МОНИКИ, 1985.-22 с.).

При этом производят определение уровней накопления копропорфирина и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче.

В практике лабораторного клинического анализа для определения копропорфирина часто используется метод Фишера в модификации М.И.Гусева и Ю.К.Смирнова. Экстракция копропорфирина из мочи осуществляется эфиром. Смесь мочи, уксусной кислоты и эфира встряхивают на шуттельаппарате, отделяют водную и эфирную фазы. Далее извлекают копропорфирин из эфира путем добавления соляной кислоты и встряхивания в течении 5 мин пробирки, сливая соляную кислоту в мерную пробирку, повторяя эту операцию 4-5 и более раз (до полного обесцвечивания слоя соляной кислоты). Полученный раствор фотометрируют на спектрофотометре.

Определение дельта-аминолевулиновой кислоты в моче производится с применением ионообменных смол. При этом верхний слой смолы покрывают фильтровальной бумагой, пропускают дистиллированную воду, затем заливают 1 мл мочи, которая проходит через смолу в стакан, оставляя в ионообменнике мочевину и дельта-аминолевулиновую кислоту. Мочевину удаляют пропусканием через смолу воды. Далее выделяют из смолы дельта-аминолевулиновую кислоту, применяя для этого уксуснокислый натрий и ацетатный буфер. Полученный раствор также фотометрируют на спектрофотометре.

Основными недостатками данных способов являются:

1) сложность и трудоемкость методик, большая продолжительность по времени, что затрудняет частое повторение исследований при проведении мониторинга для определения эффективности проводимой терапии;

2) невозможность использования методики для скрининга при обследовании рабочих свинцовых производств непосредственно в производственных условиях;

3) исследование содержания свинца в крови осуществляется инвазивными методами, что особенно нежелательно с учетом роста заболеваемости вирусными гепатитами и другими заболеваниями, передающимися через кровь.

Задача, поставленная авторами, заключается в устранении указанных недостатков на основе разработки простого, дешевого, неинвазивного способа диагностики, базирующегося на современной технологии спектрофотометрического флюоресцентного анализа in vivo.

Кроме того, задачей явилось также расширение функциональных возможностей способа за счет определения повышенной локальной концентрации протопорфиринов на участке ткани при нормальном уровне концентрации свинца в крови и моче и оценить степени выраженности локальной свинцовой интоксикации участка ткани, что позволит обеспечить соответствующее лечение.

Эта задача достигается тем, что в способе диагностики свинцовой интоксикации организма, включающем спектрофотометрическое исследование биологического материала организма, определение концентрации порфирина в тканях биологического материала и сравнение с эталоном, предложено в качестве биологического материала использовать участок ткани на теле пациента, на котором in vivo проводить спектрофотометрическое исследование, при этом воздействовать на участок низкоинтенсивным лазерным излучением, с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения протопорфиринов, определять амплитуду излучения флюоресценции этого участка, а в качестве эталона сравнения принимать амплитуду флюоресценции протопорфирина 1X, моделирующего концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови от 100 до 1500 мкг/л и более, и при равенстве амплитуд устанавливать концентрацию протопорфирина 1X в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани.

Причем длины волн, соответствующие максимумам спектра поглощения порфиринов, составляют 337, 370, 405, 532, 632 нм.

Известно, что порфирины и их различные химические соединения и производные обладают выраженными спектрами флюоресценции в диапазоне длин волн 600-800 нм (Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. - М.: Мир, 1965). Возбуждение флюоресценции порфиринов вызывается их освещением светом с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения порфиринов (337, 370, 405, 532, 632 нм). Известно также, что такие биологические ткани, как кожа и слизистые оболочки органов, являются для оптического излучения полупрозрачными и светорассеивающими средами (Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. - Саратов: СГУ, 1998). Следовательно, при освещении биотканей оптическим излучением оно проникает внутрь ткани, взаимодействует с ее биохимической и морфологической структурой и за счет актов многократного рассеяния частично выходит наружу со стороны освещаемой поверхности, составляя так называемый поток вторичного рассеянного излучения с этой поверхности. Если внутри биологической ткани содержатся флюоресцирующие вещества, например порфирины, то вместе с потоком вторичного рассеянного излучения из биологической ткани будет выходить и поток излучения флюоресценции этих веществ. Этот поток будет отличаться от потока обычно рассеянного излучения своим характерным спектром и интенсивностью. Спектр излучения флюоресценции будет указывать на то, какие флюоресцирующие вещества вызвали эту флюоресценцию, а интенсивность излучения флюоресценции будет коррелировать с количеством флюоресцирующих веществ, содержащихся в объеме биоткани, подвергшейся освещению.

Для того чтобы по интенсивности флюоресценции можно было in vivo количественно оценить уровень накопления флюоресцирующих веществ в биоткани (в данном случае порфиринов), необходимо спектрофотометрической аппаратурой зарегистрировать амплитуду сигнала флюоресценции порфиринов живой биологической ткани и сравнить полученную амплитуду с какими-либо эталонными значениями амплитуд сигнала, соответствующих тем или иным уровням накопления порфиринов в биологической ткани.

Способ осуществляют следующим образом.

На выбранном участке ткани пациента in vivo проводят спектрофотометрическое исследование. При этом воздействуют на участок низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения порфиринов (337, 370, 405, 532 или 632 нм), регистрируют амплитуду выходящего из биологической ткани излучения флюоресценции и сравнивают ее с эталонной амплитудой флюоресценции протопорфиринов 1X в диапазоне концентрации 100-1500 мкг/л и >1500 мкг/л. При равенстве этих амплитуд устанавливают концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани - ППэр. Затем в соответствии с общепринятыми градациями степени выраженности свинцовой интоксикации (А.М.Монаенкова, О.Г.Архипова, Н.С.Сорокина и др. Клиника, диагностика, лечение, вопросы экспертизы трудоспособности и профилактика свинцовых интоксикаций / Методические рекомендации - М.: МЗ РФ, 1986. - 25 с.) определяют степень выраженности свинцовой интоксикации:

- начальная (100 мкг/л<ППэр.<500 мкг/л),

- легкая (500 мкг/л<ППэр.<1500 мкг/л)

- и выраженная (ППэр.> 1500 мкг/л),

где ППэр. - концентрация протопорфирина в эритроцитах крови.

Конкретный пример способа.

Больной Я., 1958 г. рожд., и/б №16007, находился в отделении профпатологии МОНИКИ с 10.09. по 16.10.2003 г. Поступил с жалобами на общую слабость, боли в руках, мышцах ног, ограничение движений, боли в животе, субфебрилитет. С 1994 г. по настоящее время работает на Подольском аккумуляторном заводе сборщиком-паяльщиком. В обязанности паяльщика входит пайка межэлементных соединений аккумуляторных батарей свинцовыми прутками с помощью газовой горелки при движении свинцовых батарей по конвейеру. Вредными производственными факторами при работе паяльщика являются свинец и его неорганические соединения, шум. Длительность времени их воздействия в смену составляет 83%. Концентрации свинца в воздухе рабочей зоны в разные годы составлял 0,307-1,5 мг/м³ при ПДК 0,01 мг/м³ (превышение ПДК в 30-40-55 раз). С 1997 г стало отмечаться повышение дельта-АЛК (50-80-94 мкмоль/л), появились вышеописанные жалобы, усиление которых в августе 2003 г. послужило причиной госпитализации в отделение профпатологии МОНИКИ. Объективно: Общее состояние средней тяжести. Рост 172 см. Вес 50 кг. Кожные покровы и видимые слизистые бледные. В полости рта много искусственных и сломанных зубов, коронок, на зубах - камни, свинцовая кайма отчетливо не определяется. Сила в мышцах плечевого пояса резко снижена. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. ЧД 18 в 1 мин. Тоны сердца приглушены, учащены, ЧСС 100 в 1 мин. АД 110/70 мм рт.ст. Язык обложен белым налетом. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень не увеличена. С-ом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Анализы: 1) Свинец в крови 110 мкмоль/Уо (норма до 40). 2) Свинец в моче 278 мкмоль/% (норма до 40). 3) Копропорфирин в моче 1939,2 мкг/г креатинина (норма 20-80). 4) дельта-АЛК в моче 31,5 мг/г креатинина (норма до 2,5). Определение степени выраженности свинцовой интоксикации предлагаемым методом флюоресцентной спектрофотометрии in vivo на коже пальцев рук показало, что амплитуда сигнала флюоресценции находится в диапазоне концентраций протопорфирина в эритроцитах от 500 до 1500 мкг/л, что соответствует легкой степени выраженности интоксикации.

Использование данного способа в клинической практике позволит существенно упростить исследование показателей, косвенно характеризующих концентрацию свинца в тканях, а следовательно, и общую степень выраженности свинцовой интоксикации у лиц с подозрением на свинцовую интоксикацию. Данный способ позволяет в кратчайшие по времени сроки проводить необходимое динамическое наблюдение больных со свинцовой интоксикацией при назначении им этиотропной и патогенетической терапии, кроме того, возможен массовый скрининг в условиях производства при проведении профилактических медицинских осмотров. Предложенный способ также позволяет исследовать повышенную локальную концентрацию протопорфиринов в тканях при нормальном уровне концентрации свинца в крови и моче и оценивать степень выраженности локальной свинцовой интоксикации тканей.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики свинцовой интоксикации организма. Путем спектрофотометрии исследуют биологический материал организма. Определяют концентрацию порфирина в тканях биологического материала и сравнивают ее значения с эталонным. В качестве биологического материала используют участок ткани на теле пациента, на котором in vivo проводят спектрофотометрическое исследование. При этом воздействуют на участок низкоинтенсивным лазерным излучением. Длина волны соответствует одному из максимумов спектра поглощения протопорфиринов. Определяют амплитуду излучения флюоресценции этого участка. В качестве эталона сравнения принимают амплитуду флюоресценции протопорфирина IX, моделирующего концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови от 100 до 1500 мкг/л и более. При равенстве амплитуд устанавливают концентрацию протопорфирина IX в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани. При этом длины волн, соответствующие максимумам спектра поглощения протопорфиринов, составляют 337, 370, 405, 532, 632 нм. Способ позволяет существенно упростить исследование показателей, косвенно характеризующих концентрацию свинца в тканях, а следовательно, и общую степень выраженности свинцовой интоксикации у лиц с подозрением на свинцовую интоксикацию. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ диагностики свинцовой интоксикации организма, включающий спектрофотометрическое исследование биологического материала организма, определение концентрации порфирина в тканях биологического материала и сравнение ее значения с эталонным, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют участок ткани на теле пациента, на котором in vivo проводят спектрофотометрическое исследование, при этом воздействуют на участок низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения протопорфиринов, определяют амплитуду излучения флюоресценции этого участка, а в качестве эталона сравнения принимают амплитуду флюоресценции протопорфирина IX, моделирующего концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови от 100-1500 мкг/л и более, и при равенстве амплитуд устанавливают концентрацию протопорфирина IX в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани.2. Способ диагностики свинцовой интоксикации организма по п.1, отличающийся тем, что длины волн, соответствующие максимумам спектра поглощения протопорфиринов, составляют 337, 370, 405, 532, 632 нм.