Способ определения биогенных порфиринов Советский патент 1992 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к способам определения порфиринов и может быть использовано в медицине, биотехнологии, биохимических исследованиях.

Определение уровней порфиринов в биологических образцах (моча, сыворотка крови и т.п.) важно при диагностике некоторых нарушений обмена веществ (порфирину- рии, порфирии), ряда патологических заболеваний животных и человека, химических интоксикаций, а также в ряде биотехнологических производств (микробиологический синтез биогенных порфиринов и некоторых витаминов с родственной структурой).

Известны способы определения порфиринов с использованием спектрофотомет- рии, спектроскопии магнитного кругового дихроизма, дифференциальной спектрофо- тометрии.

Недостатками этих способов являются невысокая чувствительность, ограниченная чувствительностью фотометрической детекции порфиринов (около 1 мкг/мл), влиянием оптических свойств исследуемого образца на результаты определения, и невысокая селективность определения порфиринов (влияние примесей пигментов). Это приводит к необходимости дополнительных стадий (разбавление образца, экстракция, концентрирование, фракционное разделение и т.п.), что усложняет анализ, делает его многостадийным и требует большого расхода исходного материала, затрудняет автоматизацию.

Наиболее близок к предлагаемому способ определения уровней порфиринов путем прямого флуориметрического определения порфиринов в тканях или тканевых жидкостях.

Однако чувствительность метода ограничена высокими фоновыми сигналами, обусловленными светорассеянием тканей и тканевых жидкостей (благодаря высокому содержанию белков и других макромолекул), а также собственной флуоресценцией биологических жидкостей. Примеси флуоресцирующих пигментов мешают определению порфиринов. Обычно чувствительность данного метода не превышает 1 нг/мл порфи- ринов.

Цель изобретения - повышение чувствительности, точности анализа, его упроще- ние и повышение специфичности определения порфиринов.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемые водные растворы биогенных порфиринов обрабатывают в определенных условиях водными растворами и растворимой соли двухвалентного палладия таким образом, чтобы количественно перевести содержащиеся в них порфирины в их палладиевые комплексы, после чего содержание порфиринов определяют по высокотемпературнойфосфоресценциипалладиевых комплексов порфиринов. Измерение фосфоресценции Pd-порфиринов проводят в обескислороженных водных растворах при комнатной температуре.

Pd-порфирины обладают уникальной способностью интенсивно фосфоресцировать в водных растворах при комнатной температуре и могут быть селективно определены в сложных биологических системах с высокой чувствительностью методом импульсной флуориметрии с миллисекундным временным разрешением. Режим регистрации люминесценции с временным разрешением практически полностью исключает влияние оптических свойств образца и лю- минесцирующих примесей на результаты определения Pd-порфиринов.

Получаемые при химической обработке палладиевые комплексы порфиринов являются индивидуальными соединениями (константа диссоциации Pd(ll) из порфиринового макроцикла очень высокая ( 10-34 М), которые обладают высокой химической стабильностью, Следовательно, процесс включения палладия в порфирины является практически необратимым и неподвержен влиянию последующих стадий манипуляции с образцом.

Спектральные свойства палладиевых комплексов различных биогенных порфиринов (ди-, тетра-, октакарбоксильных) практически идентичны. Следовательно, при определении различных порфиринов или их смесей условия регистрации идентичны.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение палладиевых комплексов порфиринов.

К 1 мл раствора копропорфирина 1 (концентрация 10 нМоль/л) в 0,05М ацетатном буфере, рН 5,0, добавляли 0,01 мл раствора хлорида палладия (II) (0,01 М) в 0,01 М HCI и инкубировали на водяной бане при 80°С 3 мин. После охлаждения раствора реакцию

останавливали добавлением 0,1 мл водного раствора сульфита натрия (100 мг/мл), при этом рН системе устанавливался в районе 7,0. Записывали спектры люминесценции

растворов на спектрофлуориметре LS-50 (Perkin Elmer) в диапазоне длин волн 550- 750 нм при возбуждении на длине волны 395 нм. Исчезновение полос флуоресценции порфиринов (в области 620 нм) и появление

0 полос фосфоресценции Pd-порфиринов (в области 670 нм) в спектрах люминесценции свидетельствует о том, что порфирин полностью переходит в форму палладиевого комплекса.

5 Предпочтительные условия получения палладиевых комплексов: 2-15-минутная инкубация в ацетатном буфере, рН 3,0-5,0, при 60-80°С в присутствии 20-500 мкМ Pd (2+).

0 Спектральные свойства копропорфирина и его Pd-комплекса приведены в таблице. Пример 2. Измерение высокотемпературной фосфоресценции Pd-порфиринов. Копропорфирин 1 переводили в форму

5 Pd-комплексов согласно примеру 1, используя различные исходные концентрации копропорфирина (0,1-100 нм), и измеряли интенсивности фосфоресценции растворов в режиме с субмиллисекундным временным

0 стробированием.

Оптимальные условия измерения следующие: возбуждение при 395 нм (спектральная полуширина фильтра около 50 нм), регистрация при 665 нм (полуширина около

5 50 нм). Частота вспышек лампы 1 кГц (полуширина вспышки - не более 10 мкс), время задержки после вспышки 100 мкс; ворота счета 800 мкс; время накоппения сигнала 1 с.

0 В условиях измерения фосфоресценции Pd-копропорфирина в отличив от условий измерения флуоресценции копропорфирина практически отсутствует фоновый сигнал светорассеяния и свечения образца. Поэто5 му может быть достигнута значительно более высокая чувствительность детекции Pd-копропорфирина (порядка 0,1 пмоль/л). Эта величина соответствует чувствительности определения порфиринов, поскольку

0 степень их превращения в палладиевые комплексы практически 100%.

Пример 3. Способ проводят аналогично примеру 1, но вместо хлорида палладия используют ацетат палладия в той же

5 концентрации. Результаты аналогичны.

Пример 4. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют 10 мин при 60°С. Результаты аналогичны.

Пример 5. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют с солью

палладия 2 ч при 37°С. Результаты аналогичны.

Пример 6. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубацию проводят в 0,025 М ацетатном буфере, рН 3,0. Интенсивность фосфоресценции снижается примерно в 1,5 раза вследствие неполного перехода порфирина в форму Pd-комплек- са.

Пример 7. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубацию проводят в 0,05 М ацетатном буфере, рН 6,5. Интенсивность сигнала снижается в 2 раза вследствие неполного перехода порфирина в Pd-комплекс.

Пример 8. Способ осуществляют аналогично примерам 1-2, но вместо копро- порфирина I используют копропорфирин III. Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.

Пример 11. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо копропор- фирина 1 используютуропорфирин III. Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.

Пример 12. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо копропор- фирина I используют протопорфирин IX. Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.

Пример 13. Определение порфири- нов в биологических образцах.

В пробирках делают серию разведений стандартного (1 мкм) раствора копропорфи- рина 1 в О.ОЬ М ацетатном буфере, рН 5,0: 1/1; 1/3; 1/9; 1/27;... Добавляют во все пробирки по 0,01 мл раствора PdCI (0,01 М) в 0,01 М HCI и инкубируют при 80°С 2 мин на водяной бане. Растворы охлаждают до комнатной температуры и добавляют во все пробирки по 0,1 мл водного раствора

К 1 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0, содержащего 0,1 мМ соли палладия, добавляют по 0,05 мл исследуемых образцов мочи пациентов (разведение 1:20-1:100 необходимо для снятия влияния компонентов образца на процесс получения Pd-комплексов). Инкубируют 5 мин при 80°С. Затем охлаждают раствор, добавляют

0,1 мл водного раствора сульфата натрия (100 мг/мл). По 0,2 мл растворов переносят в лунки микропланшета и измеряют интенсивности фосфоресценции образцов на импульсном флуоресцентном ридере Arcus-1231 (Wallak, Финляндия). Условия измерения аналогичны описанным в примере 2. По результатам измерения оценивают уровни порфиринов в моче, используя в качестве контроля мочу здоровых пациентов или калибровку по копропорфирину I (см. пример 2). Завышенные уровни порфиринов говорят о нарушениях порфиринового обмена.

Производительность способа - около 100 образцов в 1 ч.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает значительное увеличение чувствительности по сравнению с прототипом

(примерно на 2 порядка), позволяет повысить производительность анализа в несколько раз, поскольку время одного измерения мало (секунды), так как нет необходимости записывать спектры. Способ не

подвержен влиянию оптических свойств образца и примесей (фоновый сигнал практически отсутствует), легко может быть автоматизирован.

Формула изобретения

1.Способ определения биогенных порфиринов, включающий обработку содержащего порфирины образца, измерение его люминесценции и количественную оценку

содержания порфиринов по интенсивности люминесценции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения, упрощения и ускорения анализа, образец обрабатывают в буфере с рН 3-6,5 избытком растворимой соли палладия (Pd(ll)-) при температуре 37-100°С до полного превращения порфиринов в их палладиевые комплексы, после чего добавляют сульфит в конечной концентрации 5-15

мг/ мл, а количественную оценку осуществляют по фосфоресценции полученных растворов при рН 6,5-8,0 при комнатной температуре.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что обработку проводят 2-15 мин при

60-80°С в 0,05 М ацетатном буфере с рН 5,0 при концентрации Pd(ll) 50-500 мкМ.

Сущность способа заключается в том, что содержащиеся в образце порфирины предварительно переводят в форму их пал- ладиевых комплексов и затем количественную оценку уровней порфиринов проводят по высокотемпературной фосфоресценции их палладиевых комплексов в водных растворах. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.