СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ТРАВМАТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ СПИННОГО МОЗГА Российский патент 2006 года по МПК A61K35/28 A61P25/00 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в неврологии и нейрохирургии для лечения и реабилитации больных со стойким неврологическим дефицитом после перенесенной травмы спинного мозга.

Известно, что восстановление аксонов при спинальной травме может быть обусловлено образованием нервными клетками новых отростков, проникающих через зону повреждения [1]. Восстановлению связей между поврежденными нейронами могут также способствовать новые нейроны, образующиеся из стволовых клеток. При этом продуцируемые предшественниками и зрелыми клетками нейротрофические факторы способны усиливать регенерацию аксонов и защищать клетки спинного мозга от апоптоза [2, 3]. Исходя из этого, с целью репарации нервной ткани спинного мозга в последние годы предложены различные технологии нейротрансплантации.

Так, известен способ лечения последствий травматического повреждения спинного мозга путем трансплантации межреберных нервов в зону повреждения спинного мозга [4]. Однако данный подход, разработанный на экспериментальных животных (крысах), не позволяет достичь у них существенного регресса неврологического дефицита, поэтому в клинической практике в настоящее время не используется.

В качестве источника трансплантируемого материала предложено использование миелин-формирующих клеток, например Шванновских клеток или обкладочных клеток обонятельной зоны головного мозга [5, 6]. Введение указанных клеток в зону повреждения экспериментальным животных стимулирует миелинизацию, усиливает регенерацию аксонов и по предварительным данным способствует прорастанию нервных волокон через рубец в ткань спинного мозга. Тем не менее, нервные окончания не являются функционально полноценными, поскольку существенного восстановления функции спинного мозга не происходит.

Известен способ введения эмбриональных клеток нервной ткани для восстановления функций травмированного спинного мозга [7]. Однако приживление аллогенных фетальных клеток у экспериментальных животных происходит только в ранние сроки после травмы [8]. Кроме того, при данном способе не происходит прорастания аксонов за пределы трансплантата.

Известен способ лечения травматических повреждений спинного мозга путем трансплантации фетальной нервной ткани и стволовых кроветворных клеток. Метод основан на введении в полость опорожненной кисты трансплантата спинного мозга плода, обогащенного клетками выстилки луковиц обонятельного нерва, и в субарахноидальное пространство спинного мозга суспензии нервных и кроветворных клеток плода [RU 2195941 С2]. Использование фетальных клеток имеет, однако, существенные морально-этические ограничения, сложности в получении абортивных эмбрионов человека и связано с большими трудностями сохранения жизнеспособности нервных клеток после криоконсервирования. Кроме этого, приживление аллогенных клеток является весьма проблематичным в связи с развитием иммунных реакций на чужеродные антигены, а также сопряжено с высоким риском контаминации материала бактериальной и/или вирусной микрофлорой. Кроме того, в литературе активно обсуждается возможность злокачественной трансформации эмбриональных клеток.

В качестве альтернативного источника трансплантации при повреждениях нервной ткани в последние годы предложено использование стволовых клеток костного мозга, в частности прилипающих к пластику мезенхимальных стволовых клеток, способных дифференцироваться в нейрональном направлении, преодолевать гематоэнцефалический барьер и участвовать в репарации нервной ткани. На основании этого предложен способ, согласно которому в качестве источника репарации нервных клеток используются стволовые клетки костного мозга [Patent WO 0069448]. Данный подход позволяет использовать собственные стволовые клетки взрослого человека. Однако способ не может считаться достаточным в качестве метода лечения спинальной травмы, т.к.: 1) его эффективность проверена только в модели экспериментальной травмы на животных, существенно отличающейся от клинической ситуации; 2) для получения достаточного количества аутологичных мезенхимальных клеток у человека требуется продолжительное время и дорогостоящие реактивы; 3) ограничение трансплантируемого материала одним типом клеток и методом введения, например локального введения мезенхимальных клеток в зону травматического повреждения спинного мозга, исключает наличие в трансплантате других клеток-предшественников, не прилипающих к пластику, например эндотелиальных прогенеторных клеток, важных для восстановления кровоснабжения в поврежденной зоне.

Технической задачей настоящего изобретения является создание способа лечения травматических повреждений спинного мозга на основе трансплантации костномозговых стволовых клеток.

Поставленная задача решается за счет использования аутологичных мононуклеарных клеток, выделенных из аспирата костного мозга больного, которые после инкубации в течение 24 часов разделяют на 2 фракции, при этом фракцию клеток, прилипающих к пластику, вводят в полость опорожненной интрамедуллярной кисты в объеме, не превышающем размеры полости кисты; а фракцию клеток, не прилипающих к пластику, вводят внутривенно.

Предложенный способ позволяет получить стволовые клетки по упрощенной и более экономичной технологии и получить клинический эффект в виде снижения выраженности неврологического дефицита у больных в отдаленном и позднем периоде травматической болезни спинного мозга.

Способ осуществляется следующим образом. У больного за сутки до операции в условиях операционной при анестезиологической поддержке специалистом-гематологом проводится процедура трепанобиопсии, во время которой из крыла подвздошной кости в стерильный флакон с раствором гепарина (10000 ЕД) забирается аспират костного мозга в объеме 200 мл. В лабораторном блоке флакон инкубируется при 37°С в течение 40 мин. После гравитационного разделения цельного костного мозга в отдельный флакон собирается «верхняя» фракция, состоящая из клеток лейковзвеси, которые затем центрифугируются и осаждаются (1200 об/мин, 15 мин). Надосадок, содержащий аутоплазму, собирают в отдельный стерильный флакон, а осадок клеток лейковзвеси ресуспендируют в 40-50 мл фосфат-забуференного физиологического раствора, содержащего 10 Ед/мл гепарина (ЗФР/гепарин). Затем клетки лейковзвеси наслаивают на градиент плотности фиколла-верографина (1,078 г/л) и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы костномозговые мононуклеарные клетки (МНК КМ) троекратно отмывают в ЗФР/гепарине. С целью характеристики выделенных клеток и подсчета стволовых кроветворных клеток определяют общее количество выделенных МНК КМ, их жизнеспособность по окраске трипановым синим, а также относительное содержание среди них CD34⁺ стволовых клеток методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson). Выделенные клетки инкубируют 24 часа в пластиковых флаконах, после чего собирают фракцию прилипающих к пластику клеток (обогащенных мезенхимальными стволовыми клетками) и фракцию не прилипающих к пластику клеток, содержащих все другие типы стволовых клеток костного мозга.

Спустя сутки после процедуры трепанобиопсии больному в условиях операционной под интубационным наркозом проводится типичная геми- или ламинэктомия на уровне повреждения спинного мозга, вскрывается твердая мозговая оболочка. Под увеличением × 6,0 проводится менингомиелорадикулолиз, вскрывается и опорожняется интрамедуллярная киста, иссекаются спайки, находящиеся в ней. После этого фракцию клеток, прилипающих к пластику, в объеме, не превышающем объем интрамедуллярной кисты (1,0-3,0 мл физиологического раствора, дополненного 10% (v/v) аутоплазмы), вводят в полость кисты, а затем герметизируют ее стенки. Фракцию клеток, не прилипающих к пластику, в объеме 100 мл физиологического раствора, дополненного 10% (v/v) аутоплазмы, вводят внутривенно.

Данный способ лечения травматической болезни спинного мозга был проверен в клинических условиях на базе нейрохирургического отделения клиники НИИТО г.Новосибирска при лечении 8 пациентов. Группа больных была представлена 4 женщинами и 4 мужчинами в возрасте от 19 до 56 (средний возраст 31,5 лет) с длительностью заболевания от 6 до 39 месяцев (в среднем 20,7 месяцев). У 4 больных регистрировалось повреждение шейного отдела позвоночника. Средний балл по Бартелю в этой подгруппе составил - 20, по Asia - А (движение 18, чувствительность - 42), уровень спастики по Эшуорту - 3. У трех больных имелось повреждение позвоночника на грудном уровне. Средний балл по Бартелю - в этой подгруппе составил 35, по Asia - А (движение 50, чувствительность 96), уровень спастики по Эшуорту - 2. У одной больной повреждение локализовалось на уровне поясничного утолщения, и соответственно оценка по Бартелю составила 80 баллов, ASIA - А (движение 50, чувствительность 120 баллов). Выявленная неврологическая картина соответствует функциональному перерыву спинного мозга на уровне повреждения. Нейрофизиологические обследования выявили полный блок проведения по соматосенсорным волокнам от нервов ног при повреждении спинного мозга на грудном и поясничном уровне и полное нарушение проведения от нервов рук при локализации повреждения на уровне шейного утолщения.

На МРТ у всех больных в зоне повреждения спинного мозга отмечалась картина его структурного перерыва с наличием кистозной дегенерации в виде интрамедуллярных кист той или иной степени выраженности.

Количество мононуклеарных клеток, выделенных из аспирата костного мозга, варьировалось от 0,65×10⁹ до 5,2×10⁹ клеток и в среднем составляло 1,5±0,3×10⁹. Количество клеток во фракции, прилипающей к пластику, варьировалось от 60 до 150×10⁶. Количество клеток во фракции, не прилипающей к пластику, составляло 0,65-2,5×10⁹ клеток и содержало в среднем 160×10⁶ CD34⁺ клеток. Фракцию клеток, прилипающих к пластику, в объеме, не превышающем объем интрамедуллярной кисты (1,0-3,0 мл физиологического раствора, дополненного 10% (v/v) аутоплазмы), вводили в полость кисты, а затем герметизировали ее стенки. Фракцию клеток, не прилипающих к пластику, в объеме 100 мл физиологического раствора, дополненного 10% (v/v) аутоплазмы, вводили внутривенно.

Все больные хорошо переносили трансплантацию стволовых клеток. У них не было отмечено углубления исходной очаговой неврологической симптоматики и возникновения оболочечных симптомов. Субфебрильная температура регистрировалась только у 3 пациентов в течение первых суток. По данным проспективного наблюдения, через 1-3 месяца после трансплантации у 5 из 8 пациентов (62,5%) отмечается субъективное улучшение состояния в виде снижения выраженности спастического и болевого синдромов, улучшения жизненной активности и стремления к реабилитации. Объективно увеличение уровня чувствительности на 3 сегмента ниже уровня повреждения отмечено у 37,5% (3/8) больных. Также у 2 больных отмечалось появление контроля над функцией мочевого пузыря, что свидетельствовало о восстановлении проводниковой функции спинного мозга. Ухудшения состояния ни у одного больного не отмечалось.

Таким образом, предложенный способ лечения травматической болезни спинного мозга с использованием трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга позволяет добиться положительной динамики клинико-неврологических показателей. При этом лечение с использованием предложенного способа является хорошо переносимым и не вызывает углубления неврологической симптоматики, развития инфекционных и токсических реакций.

Ниже приведен клинический пример, поясняющий данный способ лечения.

Больная Л., 24 лет.

Диагноз при поступлении: травматическая болезнь шейного отдела спинного мозга. Поздний период. Артифициальный костно-металлический блок на уровне С4-С5, состояние после передней декомпрессии, переднего спондилодеза С4-С5 позвонков. Верхний дистальный парапарез, нижняя спастическая параплегия. Нарушение функции тазовых органов по центральному типу. Стадия А по шкале Франкеля.

Из анамнеза. 29.07.03 перенесла автодорожную травму, при которой получила удар головой о крышу легкового автомобиля. После травмы была госпитализирована в краевую больницу Владивостока, где диагностирован осложненный перелом позвоночника на уровне С4-С5 позвонков с клиникой полного функционального перерыва спинного мозга на уровне его повреждения. В связи с этим больной выполнена операция: передняя декомпрессия спинного мозга, передний спондилодез С4-С5 позвонков имплантатом из никелида титана. После операции больная отметила лишь частичное восстановление чувствительности в верхних конечностях, а также неполное восстановление движений в пальцах рук. Сохранялась плегия в ногах центрального типа.

В НИИ травматологии и ортопедии г.Новосибирска больная поступила спустя 8 месяцев после травмы. При поступлении в НИИТО жалобы на отсутствие активных движений и повышенный мышечный тонус в ногах, слабость в руках, онемение тела ниже уровня сосков. Объективно: Состояние больной удовлетворительное. Адекватна. В легких дыхание везикулярное, проводится по всем полям, хрипов нет. Тоны сердца ритмичные, АД 130/70 мм рт. ст., пульс 72 удара в минуту. Живот при пальпации мягкий, безболезненный, умеренно вздут. Перистальтика кишечника выслушивается.

Неврологический статус: в сознании, ориентирована, адекватна. К состоянию отношение критическое. Признаков выпадения со стороны черепно-мозговых нервов не отмечается. В руках гипотония, гипотрофия мышц кисти, предплечья. Сила рук в сгибателях предплечья 4 балла, сгибателях запястья 3 балла, разгибатели предплечья 2 балла, в кистях 0 баллов, с 2-х сторон (общая сумма баллов по двигательной шкале ASIA - 18). В ногах спастическая плегия, с выраженным гипертонусом, при раздражении отмечаются клонусоиды. Брюшные рефлексы, рефлексы с ног отсутствуют с обеих сторон. Анестезия с уровня D3-D4 сегмента с захватом аногенитальной зоны (60 баллов по чувствительной шкале ASIA). Выраженность спастики до 3 баллов по Эшуорту. Нарушение функции тазовых органов по центральному типу, гиперрефлекторный мочевой пузырь.

Вызванные соматосенсорные потенциалы: с ног ответов нет. С рук - корковые ответы. Справа - 18-23,4 миллисекунд (м/с), слева - 18-21 м/с. Блок проведения по соматосенсорным волокнам от нервов ног, умеренное нарушение проведение от нервов правой руки. Электромиография: в покое повышение тонуса ног, медианус справа - 70,1 м/с, слева - 72,3 м/с, перонеус справа - 45 м/с, слева - 45 м/с.

При МРТ шейного отдела спинного мозга определяется посттравматическая кистозно-дегенеративная миелопатия с образованием интрамедуллярной кисты на уровне С4-С5 сегментов спинного мозга общим объемом 3,0 мл.

Больной проведена операция: Гемиламинэктомия С5 справа, менигомиелорадикулозиз, вскрытие и опорожнение интрамедуллярной кисты. Фракция клеток, прилипающих к пластику, в дозе 60×10⁶ в объеме 3,0 мл, введена в кистозную полость, которая сразу же была герметизирована; фракция не прилипающих к пластику клеток (общее количество клеток 0,8×10⁹, количество CD34⁺ клеток - 70×10⁶) в объеме 100 мл введена внутривенно. На этом оперативное вмешательство закончено.

Послеоперационный период у больной протекал без углубления неврологической симптоматики и каких-либо осложнений.

Через 2 месяца у больной отмечается расширение уровня чувствительности с двух сторон на 4 сегмента ниже уровня поражения спинного мозга. Появились активные движения в пальцах обоих кистей. Пациентка стала контролировать акт мочеиспускания, стоит с опорой на ногах до 10 минут. Отмечено исчезновение спастики в ногах, что свидетельствует о значительном улучшении не только сегментарной, но и проводниковой функции спинного мозга.

Таким образом, проверка предложенного подхода в клинических условиях позволяет сделать вывод, что данный способ, включающий трансплантацию аутологичных стволовых клеток при травматическом повреждении спинного мозга в позднем периоде позволяет добиться значимого улучшения клинико-неврологических показателей за счет улучшения сегментарной и проводниковой функции спинного мозга. При этом лечение с использованием предложенного способа является хорошо переносимым, не вызывает ухудшения исходной неврологической симптоматики и развития каких-либо побочных или токсических реакций.

Литература

1. Huang D.W., McKerracher L., Braun P.E., David S. A therapeutic vaccine approach to stimulate axon regeneration in the adult mammalian spinal cord // Neuron.- 1999. - Vol.24, N 3. - P.639-647.

2. Борщенко И.А., Басков А.В., Коршунов А.Г., Сатанова Ф.С. Некоторые аспекты патофизиологии травматического повреждения и регенерации спинного мозга // Вопросы нейрохирургии. - 2000. - №2. - С.28-32.

3. Станков Д.С., Катунян П.И., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Нейротрансплантация в лечении травмы спинного мозга // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2003. - №1.- С.44-52.

4. Cheng H., Yihai С., Olson L. Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function // Science. - 1996. - Vol.273. - P.510-513.

5. Xu X.M., Chen A., Guenard V., Kleitman N., Bunge M.B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord // J. Neurocytol. - 1997. - Vol.26. - P.1-16.

6. Kato Т., Honmou O., Uede Т., Hashi К. Transplantation of human olfactory ensheathing cells elicits remyelination of demyelinated rat spinal cord // Glia. - 2000. - Vol.30. - P.209-218.

7. Bunge R.P., Johnson M.I., Tholine D. Spinal cord reconstruction using cultured embryonic spinal cord strips // Spinal Cord Reconstruction, edited by C.C.Kao, R.P.Bunge, and P.J.Reier. - Raven Press, New York. - 1983. - P.341-359.

8. Shibayama M., Matsui N., Himes B.T., Murray M., Tessler A. Critical interval for rescue of axotomized neurons by transplants // Neuroreport. - 1998. - Vol.9. - P.11-14.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в нейрохирургии для лечения и реабилитации больных со стойким неврологическим дефицитом после перенесенной травмы спинного мозга. Способ включает трансплантацию стволовых костномозговых клеток, в качестве которых используют аутологичные мононуклеарные клетки костного мозга больного. После 24-часовой инкубации клетки разделяют на две фракции. При этом фракцию клеток, прилипающих к пластику, вводят в полость опорожненной интрамедуллярной кисты в объеме, не превышающем размеры полости кисты, а фракцию клеток, не прилипающих к пластику, вводят внутривенно. Способ позволяет снизить выраженность неврологического дефицита у больных в отдаленном и позднем периоде травматической болезни спинного мозга за счет комплексного влияния на репарацию нервной ткани всех типов используемых стволовых клеток, которые дифференцируются в нейрональном направлении непосредственно в организме больного без длительной культивации in vitro.

Способ лечения травматических повреждений спинного мозга, включающий трансплантацию стволовых костно-мозговых клеток, отличающийся тем, что используют аутологичные мононуклеарные клетки костного мозга больного, которые после 24-часовой инкубации разделяют на две фракции, при этом фракцию клеток, прилипающих к пластику, вводят в полость опорожненной интрамедуллярной кисты в объеме, не превышающем размеры полости кисты, а фракцию клеток, не прилипающих к пластику, вводят внутривенно.