СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ СПИННОГО МОЗГА С ПОМОЩЬЮ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ЗАКЛЮЧЕННЫХ В ФИБРИНОВЫЙ МАТРИКС Российский патент 2018 года по МПК A61K35/28 A61P25/00 

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно к области медицины, в частности к методам лечения травмы спинного мозга, более точно - к методам лечения с использованием клеточной терапии в подострый период, и может быть использовано в нейрохирургии и травматологии.

Травма спинного мозга остается одной из актуальных медико-социальных проблем. Эффективных методов ее лечения у людей в острый, подострый и хронический периоды на дату представления настоящей заявки не выявлено, что является причиной инвалидизации пострадавших.

Существуют следующие технические решения, известные как таковые по назначению, а именно для стимулирования регенерации спинного мозга: фармацевтические, хирургические, физические, электростимуляция, генные и клеточные подходы. Каждый из перечисленных подходов стимулирования регенерации нервной ткани имеет как положительные, так и отрицательные стороны.

Например, короткий срок действия препарата и наличие побочных эффектов характерны для стимулирования регенерации с применением фармацевтических композиций.

Невозможность создания благоприятных условий для роста аксонов и поддержания жизнедеятельности нейронов и глиальных клеток в области повреждения характерны для стимулирования регенерации с применением хирургических и физических подходов.

Низкая эффективность в отношении двигательной функции и наличие большего влияния на купирование болевого синдрома характерны для стимулирования регенерации с применением электростимуляции.

Высокая вероятность встраивания в геном клетки и иммуногенность характерны для стимулирования регенерации с применением генных подходов.

В последнее время наилучшую возможность преодоления последствий травмы спинного мозга связывают с применением клеточной терапии, т.к. в отличие от известных технических решений данный подход характеризуется отсутствием указанных выше недостатков. С этой целью исследуют эмбриональные и нейральные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые и прогениторные клетки. Несмотря на то что доклинические испытания с указанными видами терапии, проводимые чаще всего на мелких животных (крысы, мыши) и преимущественно в острый период травмы спинного мозга, показывают необычайно позитивные и вдохновляющие результаты по восстановлению структуры и функций травмированной ткани, при этом трансляция накопленного опыта в клинику происходит медленно ввиду опасений о безопасности и эффективности клеточной терапии.

Из известного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту RU 2521225, где описан способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократной трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, предварительно трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора (gdnf). При этом несмотря на показанные авторами положительные результаты восстановления спинного мозга имеют место следующие недостатки указанного способа:

- меньшая доступность для клинического применения и проведения аутологичных трансплантаций в связи с недостаточным развитием банков пуповинной крови;

- существующий риск возникновения иммунного конфликта между клетками донора и реципиента в случае аллотрансплантаций;

- аденовирусные векторы, используемые для доставки гена gdnf, могут индуцировать клеточный и гуморальный иммунитет в ткани реципиента, в связи с этим безопасность данного вида терапии остается под вопросом.

Достаточно перспективными представляются мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые в наибольшей мере соответствуют критериям минимальной инвазивности при клеточной терапии, т.к. при введении в кровь эти клетки имеют наибольшие шансы достичь эпицентра травмы (хоминг) и интегрироваться в поврежденную ткань. МСК интенсивно исследуют для трансплантаций при травмах мозга (J. Bianco J, P. De Berdt et al. Taking a bite out of spinal cord injury: do dental stem cells have the teeth for it? Cell Mol Life Sci. 73 (7). - 2016. - P. 1413-1437; V. Sabapathy, G. Tharion et al. Cell Therapy Augments Functional Recovery Subsequent to Spinal Cord Injury under Experimental Conditions. Stem Cells Int. - 2015. Epub 2015 Jul 9. doi: 10.1155/2015/132172; A. Malgieri, E. Kantzari et al. Bone marrow and umbilical cord blood human mesenchymal stem cells: state of the art. Int J Clin Exp Med. 3 (4). - 2010. - P. 248-269). МСК обладают следующими позитивными свойствами, позволяющими этим клеткам способствовать регенерации аксонов:

- возможностью секреции различных нейротрофических факторов и цитокинов,

- возможностью дифференцировки в различных направлениях,

- иммуномодулирующим, противоапоптозным и противовоспалительным эффектами (X. Cui X, L. Chen et al. Genetic modification of mesenchymal stem cells in spinal cord injury repair strategies. Biosci Trends. 7 (5). - 2013. - P. 202-208).

Основными источниками МСК являются костный мозг, жировая ткань (ЖМСК) и пульпа зуба (ПМСК).

При этом костный мозг является наиболее распространенным источником МСК, однако их количество и дифференцировочный потенциал резко уменьшается с возрастом. В связи с этим наиболее перспективным для внедрения в клинику источником является жировая ткань, в силу того что имеется большая положительная роль простого способа изоляции, очистки и размножения (высокая пролиферативная активность) МСК из жировой ткани в культуре до необходимого для эффективной трансплантации количества. Процедура липосакции (забора жировой ткани) минимально травматична, часто люди подвергаются ей добровольно с эстетической целью.

ЖМСК являются хорошей альтернативой МСК из костного мозга, они не уступают последним по свойствам и их получение не связано с техническими и медицинскими проблемами.

Так, при экспериментальной травме спинного мозга крысы показано, что внутривенное введение клеток предшественников олигодендроцитов, полученных из ЖМСК, улучшает двигательную функцию, а трансплантируемые клетки дифференцируются в нейроны и олигодендроциты (S.K. Kang, M.J. Shin et al. Autologous adipose tissue-derived stromal cells for treatment of spinal cord injury. Stem Cells Dev. 15 (4). - 2006. - P. 583-594). Ксенотрансплантация ЖМСК в область боковых канатиков спинного мозга при отрыве передних корешков способствует выживанию и синаптической стабильности двигательных нейронов (Т.В. Ribeiro, A.S. Duarte et al. Neuroprotection and immunomodulation by xenografted human mesenchymal stem cells following spinal cord ventral root avulsion. Sci Rep. - 2015. Nov 9; 5: 16167. doi: 10.1038/srep 16167).

Из исследованного уровня техники выявлены способы стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга крупных животных при помощи ЖМСК. Так, результаты на собаках свидетельствуют о том, что раннее внутривенное введение ЖМСК в острый период травмы спинного мозга может предотвратить дальнейшее его повреждение путем усиления антиоксидантных и противовоспалительных механизмов, не вызывая неблагоприятных последствий (Y. Kim, S.H. Jo et al. Antioxidant and anti-inflammatory effects of intravenously injected adipose derived mesenchymal stem cells in dogs with acute spinal cord injury. Stem Cell Res Ther. - 2015. Nov 26; 6: 229. doi: 10.1186/s13287-015-0236-5).

В последнее время особое внимание специалистов в области клеточной терапии привлекают МСК, полученные из пульпы зуба. ПМСК секретируют нейротрофические факторы:

- фактор роста нервов (NGF),

- мозговой нейротрофический фактор (BDNF),

- глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и поддерживают выживание чувствительных нейронов in vitro и двигательных нейронов in vivo (Nosrat, I.V., Smith, C.A., et al. Dental pulp cells provide neurotrophic support for dopaminergic neurons and differentiate into neurons in vitro; implications for tissue engineering and repair in the nervous system. Eur J Neurosci. - 2004. 19 (9), 2388-2398). При этом следует обратить внимание на то, что трансплантация ткани пульпы зуба в радужную оболочку крысы индуцирует васкуляризацию и появление новых нервных волокон, что доказывает потенциальную роль клеток пульпы зуба в нейро- и ангиогенезе. ПМСК обладают способностью к трансдифференцировке и нейропротекции. Поэтому разумно предположить, что данный вид источника МСК может служить альтернативой другим источникам получения стволовых клеток. Анализ профиля экспрессии генов показал, что несколько белков, связанных с подавлением опухоли, имеют более высокий уровень экспрессии в ПМСК по сравнению с МСК костного мозга (Shi, S., Robey, P.G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. - 2001. 29 (6), 532-539).

Доступность и простота получения ПМСК, отсутствие законодательных и этических противоречий позволяют рассматривать эти клетки как перспективный материал для ауто- и аллотрансплантаций при травматических повреждениях центральной нервной системы.

Известны способы стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга лабораторных животных при помощи ПМСК. Так, показано, что ПМСК способствуют увеличению сохранности белого вещества спинного мозга, усилению миелинизации аксонов, поддержанию высокого уровня экспрессии нейротрофических факторов в ткани после инъекции при помощи Гамильтоновского шприца в область повреждения спинного мозга (de Almeida, F.M., Marques, S.A., et al. Human dental pulp cells: a new source of cell therapy in a mouse model of compressive spinal cord injury. J Neurotrauma. - 2011. 28 (9), 1939-1949). Трансплантация ПМСК человека в область полной перерезки спинного мозга крысы способствует ингибированию апоптоза и дифференцировке в зрелые олигодендроциты, что положительно влияет на процессы нейрорегенерации (Sakai, K., Yamamoto, A. et al. Human dental pulp-derived stem cells promote locomotor recovery after complete transection of the rat spinal cord by multiple neuroregenerative mechanisms. J Clin Investig. - 2012. 122 (1), 80-90.). При этом показано, что ПМСК способны напрямую блокировать ингибиторы аксонального роста, что не исследовано у других клеток.

Известны способы стимулирования регенерации различных тканей и органов при помощи стволовых клеток, заключенных в биополимерные матриксы. Такие технологии используют для поддержания и направленной дифференцировки, заключенных в матрикс клеток, создания для них специфического микроокружения, соответствующего естественному. Кроме того, системное, интраспинальное и интратекальное введения имеют важные недостатки, связанные с количественными ограничениями и низкой жизнеспособностью стволовых клеток in situ. Принимая во внимание вышесказанное, заявленное техническое решение лишено указанных недостатков.

Таким образом, использование биоматериалов, способных инкапсулировать и поддерживать стволовые клетки, в том числе МСК в целом, представляет собой перспективный подход для преодоления этих ограничений, потенциально улучшая эффективность используемой терапии.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлено большое количество гидрогелей (натурального или синтетического происхождения), используемых для замещения поврежденной нервной ткани, а также в качестве матриксов для стволовых клеток (О. Jeon, Е. Alsberg. "Regulation of stem cell fate in a three-dimensional micropatterned dual-crosslinked hydrogel system". Adv Funct Mater 23 (38): 23. - 2013. - P. 4765-4775; J. Thiele, Y. Ma et al. "25th anniversary article: designer hydrogels for cell cultures: a materials selection guide". Adv Mater 26 (1). - 2014. - P. 125-147; A. Moshaverinia, C. Chen et al. "Regulation of the stem cell-host immune system interplay using hydrogel coencapsulation system with an antiinflammatory drug". Adv Funct Mater 25 (15). - 2015. - P. 2296-2307).

В изобретении по патенту RU 2471437 описан способ получения сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля для производства имплантата, способствующего нейропротекции и восстановлению соединения в спинном мозге после повреждения. Краткая сущность заключается в имплантации в острый период в область полной перерезки спинного мозга куска полимерной таблетки (3 мм в диаметре) и дальнейшей оценки по функциональным и морфологическим критериям возможности нейрорегенерации. Таким образом, было обнаружено, что синтезированные в плазме полимеры способствуют улучшению двигательной функции, а имплантированный полимер способен соединять нервную ткань спинного мозга. При этом наблюдались воспалительные клетки, Т-лимфоциты и макрофаги, которые превращались в гигантоциты.

В изобретении по патенту RU 2597085 описан способ получения биосовместимых имплантируемых материалов, обладающих низкой скоростью биодеградации и способностью стимулировать регенеративный процесс, в частности восстановление нервных проводников после травмы мозга, что было изучено на модели полной перерезки спинного мозга крыс (с дефектом 2 мм шириной). В результате исследований было выявлено, что на сегодняшний день известные гидрогели, используемые в качестве замещения поврежденной ткани, не приводят к полному восстановлению структуры и функции поврежденной нервной ткани.

Основываясь на изложенном, по мнению заявителя, наиболее перспективным направлением можно считать применение гидрогелей в качестве матрикса для стволовых клеток. Потенциал используемых матриксов чаще всего оценивается по поддержанию жизнеспособности заключенных в них клеток в течение короткого времени in vitro (S. Ribeiro-Samy, N.A. Silva et al. "Development and characterization of a PHB-HV-based 3D scaffold for a tissue engineering and cell-therapy combinatorial approach for spinal cord injury regeneration". Macromol Biosci 13 (11). - 2013. - P. 1576-1592; J. Wang, J. Zhang et al. "A protein-based hydrogel for in vitro expansion of mesenchymal stem cells". PLoS One 8 (9). - 2013. e75727 doi: 10.1371/journal.pone.0075727), и на дату представления заявочных материалов продемонстрировано небольшое количество исследований in vivo. Так, показано, что интраспинальная инъекция в область компрессии спинного мозга крысы нейральных стволовых и прогениторных клеток, заключенных в гидрогель на основе гиалуроновой кислоты и метилцеллюлозы и ковалентно модифицированным с рекомбинантным крысиным тромбоцитарным фактором роста-А, улучшает двигательную функцию и выживаемость трансплантируемых клеток, снижает патологическую кавитацию, усиливает дифференцировку олигодендроцитов и способствует большей сохранности нейронов на расстоянии 600 мкм ростральнее и каудальнее эпицентра повреждения (A.J. Mothe, R.Y. Tam et al. "Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel". Biomaterials 34 (15). - 2013. - P. 3775-3783).

Имплантация в область полной перерезки (с дефектом 2 мм шириной) спинного мозга крыс МСК из костного мозга, заключенных в желатиновый матрикс, в острый период - снижает воспаление, стимулирует ангиогенез и уменьшает патологическую кавитацию (X. Zeng, Y.S. Zeng et al. "Bone marrow mesenchymal stem cells in a three-dimensional gelatin sponge scaffold attenuate inflammation, promote angiogenesis, and reduce cavity formation in experimental spinal cord injury". Cell Transplant 20 (11-12). - 2011. - P. 1881-1899), в подострый период - способствует регенерации нервных волокон (Zeng X, Ma YH et al. "Autocrine fibronectin from differentiating mesenchymal stem cells induces the neurite elongation in vitro and promotes nerve fiber regeneration in transected spinal cord injury". J Biomed Mater Res A. - 2016 Mar 17. doi: 10.1002/jbm.a.35720).

Основываясь на изложенном анализе исследованного уровня техники по научно-технической литературе и патентным базам данных, на дату представления заявочных материалов заявителем не выявлены технические решения по исследованию эффективности клеточной терапии при травме спинного мозга в условиях наложения на область повреждения мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани или пульпы зуба, и заключенных в фибриновый гидрогель Tissucol.

Наиболее близким к заявленному техническому решению, выбранным заявителем в качестве прототипа, по совпадающей совокупности признаков и назначению является способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, примененный в исследовании (Caron I, Rossi F et al. "A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury". Biomaterials 75. - 2016. - P. 135-147), согласно которому выделенные из клеток крови пуповины человека МСК имплантировали в составе гидрогеля (матрикса) на область повреждения тотчас после умеренной компрессии спинного мозга мыши в нижнегрудном отделе. Показано, что данный вид терапии способен значительно иммуномодулировать провоспалительное окружение в области травмы спинного мозга, увеличивая популяцию М2 макрофагов и способствуя созданию комфортной среды для регенерации.

При этом следует обратить внимание на то, что примененный в прототипе способ доставки клеток при помощи матрикса, проведенный в острый период, имеет следующие недостатки:

- способ доставки МСК при помощи гидрогеля на основе агарозы, карбомера 974р (разветвленная поли акриловая кислота), полиэтиленгликоля, аргинина, глицина и аспарагиновой кислоты исследован в острый период травматического повреждения спинного мозга мыши, в связи с этим не представляется возможным трансляции накопленного опыта в клинику;

- указанный способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, по сравнению с примененной заявителем в заявленном техническом решении комбинацией фибринового гидрогеля и МСК из жировой ткани и пульпы зуба, был протестирован на мелких лабораторных животных (мыши) и в течении короткого промежутка времени (9 дней), что не позволяет в полной мере оценить терапевтический потенциал используемой конструкции (прототипа) и возможную эффективность в клинических условиях в силу короткого постоперационного периода наблюдения;

- применение МСК, выделенных из клеток крови пуповины человека, по сравнению с МСК, полученными из жировой ткани и пульпы зуба, на дату предоставления заявленного технического решения представляется менее доступным для клинического применения и проведения аутологичных трансплантаций, так как банки пуповинной крови пока не развиты повсеместно и существует риск возникновения иммунного конфликта между клетками донора и реципиента в случае аллотрансплантаций.

Целью заявленного технического решения является повышение эффективности стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга в подострый период в клинических условиях, а именно более полное восстановление структур спинного мозга человека, ответственных за выполнение двигательной функции, и повышение доступности способа лечения, заключающегося в возможности проведения аутологичных трансплантаций.

Цель достигается посредством использования заявленного способа стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающегося в однократном наложении мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в матрикс, на область повреждения, характеризующегося тем, что мезенхимальные стволовые клетки выделяют из жировой ткани или пульпы зуба, заключают в фибриновый матрикс Tissucol, через 6 недель после травматического процесса спинного мозга наносят несколько продольных надсечек в твердой мозговой оболочке и накладывают мезенхимальные стволовые клетки, заключенные в фибриновый матрикс Tissucol, на область повреждения.

Заявленный способ стимулирования регенерации спинного мозга реализуется путем наложения на область повреждения мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани или пульпы зуба свиньи и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol. Используемый фибриновый матрикс Tissucol (Baxter) является коммерческим препаратом, который заявитель приобретает у официальных представителей фирмы производителя для последующего применения в составе предлагаемой терапии.

Эксперименты проведены на вьетнамских вислобрюхих свиньях, половозрелых самках весом 9-12 кг (возраст 3-4 месяца). Содержание и работу с животными проводили в соответствии с требованиями закона «О ветеринарии» (с изменениями от 13 июля 2015 N 243-ФЗ), а также в соответствии с требованиями локального этического комитета при Казанском (Приволжском) федеральном университете. Животных содержали в отдельных загонах со стандартным суточным режимом, в соответствии с зоогигиеническими и ветеринарно-санитарными требованиями.

Заявленный способ иллюстрируется Фиг. 1 (А, Б) и Фиг. 2 (В, Г), на которых показаны зависимости суммарной площади патологических полостей (ось Y на Фиг. 1А, Б) и площади сохранной ткани (ось Y на Фиг. 2В, Г) в мкм² на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении (ось X) от эпицентра травмы от вида применяемой терапии или ее отсутствия. При этом линиями с ромбами изображена контрольная группа (наложение на область повреждения Tissucol без клеток), а линиями с квадратами изображены опытные группы (А, В - наложение на область повреждения МСК из жировой ткани, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol; Б, Г - наложение на область повреждения МСК из пульпы зуба, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol).

Статистическую обработку результатов тестирования проводили с использованием пакета программ Origin7 Pro. Статистическую достоверность разницы определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Во всех статистических данных уровень достоверности был принят меньше 0,05 (р<0,05). * - Статистически достоверные различия были обнаружены при Р≤0,05.

На Фиг. 1 (А) показана суммарная площадь патологических полостей (ось Y) в мкм² на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении (ось X) от эпицентра травмы в 1 опытной группе (наложение МСК из жировой ткани, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, линия с квадратами) и контрольной группе (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами).

На Фиг. 1 (Б) показана суммарная площадь патологических полостей (ось Y) в мкм² на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении (ось X) от эпицентра травмы во 2 опытной группе (наложение МСК из пульпы зуба, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, линия с квадратами) и контрольной группе (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами).

На Фиг. 2 (В) показана площадь сохранной ткани (ось Y) в мкм² на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении (ось X) от эпицентра травмы в 1 опытной группе (наложение МСК из жировой ткани, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, линия с квадратами) и контрольной группе (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами).

На Фиг. 2 (Г) показана суммарная площадь патологических полостей (ось Y) в мкм² на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении (ось X) от эпицентра травмы во 2 опытной группе (наложение МСК из пульпы зуба, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, линия с квадратами) и контрольной группе (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами).

Заявленный способ выполнен по известной последовательности этапов и детально описан в следующих примерах.

Пример 1.

Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани.

Для забора жировой ткани свиньи проводят антисептическую обработку операционного поля в области живота.

Выполняют инфильтрацию подкожной клетчатки раствором (общий объем 200-300 мл), содержащим 1 мл адреналина гидрохлорида (1 мг/мл) в 200 мл 0,9% хлорида натрия. Далее осуществляют разрез кожи длиной 0,5-1,0 см.

Перед забором жировой ткани выполняют "канюлирование" - разбивают жировые клетки с помощью специального инструмента - канюли. После этого закаченную жидкость вместе с жировыми отложениями отсасывают вакуумным методом по известной методике (Y.G. Illouz. Refinements in the lipoplasty technique. Clin Plast Surg. 16 (2). - 1989. - P. 217-233.). Собранный таким образом подкожный жир общим объемом 50 мл доставляют в культуральную лабораторию при 4°С для последующего культивирования. Собранный в 50 мл флакон подкожный жир центрифугируют 5 мин при 500g. Дальнейшие манипуляции проводят в ламинарном боксе. После центрифугирования отбирают солевой раствор и осадок, содержащий преимущественно клетки крови. Сохраняют жировую ткань и добавляют к ней в соотношении 1:1 стерильный сбалансированный солевой раствор с последующей тщательной механической гомогенизацией ткани (стерильными ножницами или скальпелем). Далее повторяют центрифугирование и отбор солевого раствора и осадка с клетками крови, таким образом получая требуемый гомогенизат жировой ткани.

К полученному гомогенизату жировой ткани добавляют свежеприготовленный стерильный раствор коллагеназы из печени камчатского краба (Collagenase А) в DPBS (фосфатно-солевой буфер Dulbecco, стерильный без ионов Са2+ и Mg2+, БиолоТ) в соотношении 1:1.

Конечная концентрация коллагеназы в смеси с жиром составляет 0,2%. Далее гомогенизат жировой ткани инкубируют 60 мин при 37°С при постоянном помешивании (на качающейся платформе). Полученный в результате ферментации раствор центрифугируют в течение 5 мин при 500g. В результате раствор разделяется на 3 фракции: верхняя (белого цвета), содержащая зрелые адипоциты; средняя (прозрачная), с раствором коллагеназы, и нижняя (бурая), содержащая различные клетки стромально-сосудистой фракции жировой ткани и остатки клеток крови. После этого аккуратно удаляют две верхние фракции, сохранив нижнюю.

Далее производят посев клеток полученной стромально-сосудистой фракции жировой ткани на выбранную культуральную посуду и культивируют в среде, содержащей (общий объем 1 мл) α-МЕМ (α модификация среды Игла, ПанЭко), дополненной 10% FBS (фетальная телячья сыворотка, Invitrogen), L-глутамином (146 мг /500 мл среды, ПанЭко), 100 мкМ L-acкopбaт-2-фocфaтa (500 мкл/500 мл среды, Wаko), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen). Далее полученные клетки инкубируют 24-48 ч, после чего питательную среду меняют и удаляют не прикрепившиеся клетки. Прикрепившиеся клетки являются фракцией ЖМСК, которые далее культивируют в указанной выше среде до необходимого количества для проведения дальнейшей терапии травмы спинного мозга.

Пример 2.

Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из пульпы зуба.

Для получения МСК из пульпы зуба проводят экстракцию верхних и нижних резцов. Для этого проводят лигаментотомию с последующим наложением щипцов и фиксацией зуба. Извлечение зуба из лунки (тракцию) проводят плавно, без рывков. Полученные таким образом зубы доставляют в культуральную лабораторию при 4°С в растворе (общий объем 50 мл) α-МЕМ (ПанЭко, Россия) с гентамицином (40 мг/мл) для последующего культивирования. Из полученных зубов свиней выделяют пульпу и подвергают ее ферментативному расщеплению при помощи коллагеназы I типа (3 мг/мл) и диспазы (4 мг/мл) в 1 мл PBS (фосфатно-солевой буфер, ПанЭко) в течение 1 часа при 37°С и 5% CO₂. Полученный раствор центрифугируют в течение 5 минут при 200g, супернатант и ферменты удаляют, а оставшиеся клетки культивируют в среде, содержащей (общий объем 1 мл) α-МЕМ, дополненной 10% FBS (фетальная телячья сыворотка, Invitrogen), L-глутамином (146 мг /500 мл среды, ПанЭко), 100 мкМ L-аскорбат-2-фосфата (500 мкл/500 мл среды, Wаko), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen). Далее полученные клетки инкубируют 24-48 ч, после чего питательную среду меняют и удаляют не прикрепившиеся клетки. Прикрепившиеся клетки являются фракцией ПМСК, которые далее культивируют в указанной выше среде до необходимого количества для проведения дальнейшей терапии травмы спинного мозга.

Пример 3.

Изучение влияния на нейрорегенерацию наложения на область повреждения мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани или пульпы зуба и заключенных в фибриновый гидрогель Tissucol, на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга свиньи (подострый период).

Хирургические манипуляции на свиньях проводят после их наркотизирования с использованием интубационного наркоза и соответствующей предоперационной подготовкой и адекватным обезболиванием. Премедикацию осуществляют ксилазином (в/м, 0,6 mg/kg) и кетамином (5 mg/kg). После индукции пропофолом (2-6 mg/kg) проводят эндотрахеальную интубацию с поддержкой изофлюраном (1,3%) в течение всего хода операции.

Свиньям под наркозом на уровне Th11 спинного мозга после ламинэктомии наносят дозированную контузионную травму вертикально падающим металлическим стержнем весом 50 г с высоты 20 см с последующей компрессией тем же грузом в течение 10 минут. Через 6 недель после нанесения травмы на область повреждения (после удаления спаек и проведения нескольких продольных надсечек в твердой мозговой оболочке: 2-3 надсечки длиной 2-3 мм на расстоянии 2-3 мм друг от друга) накладывают мезенхимальные стволовые клетки (8 миллионов) из жировой ткани (1 опытная группа) или пульпы зуба (2 опытная группа), заключенные в фибриновый гидрогель Tissucol (Baxter) (150 мкл). Животным контрольной группы в аналогичных условиях эксперимента накладывают Tissucol без клеток.

Для оценки эффективности восстановления двигательной функции используют поведенческую шкалу «PTIBS» (Lee, J.Н.Т., Jones, С.F. et al." A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury." Journal of Neurotrauma 30. - 2013. - P. 142-159). «PTIBS» представляет собой 10-бальную шкалу, где наименьший балл «1» соответствует отсутствию движений в конечностях, крестец и колени не отрываются от пола, а наибольший балл «10» соответствует нормальной ходьбе с поддержанием веса тела.

Через 4 месяца после проведения терапии выделяют спинной мозг. Криостатные поперечные срезы спинного мозга на протяжении 1 см от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлении окрашивают при помощи азурэозина. Окрашенные срезы заключают в витрогель и изучают при помощи светового сканирующего микроскопа APERIOCS2 (Leica).

1. Тестирование двигательной функции при помощи поведенческой шкалы «PTIBS».

Показатель восстановления двигательной функции (PTIBS) через 4 месяца после наложения на область повреждения спинного мозга аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol (1 опытная группа), возрастает более чем в 2 раза (статистически достоверные различия были обнаружены при Р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем у свиней контрольной группы (наложение Tissucol без клеток).

На аналогичном сроке показатель восстановления двигательной функции (PTIBS) после наложения на область повреждения спинного мозга аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol (2 опытная группа), по сравнению с контрольной группой (наложение Tissucol без клеток), возрастает более чем в 1,5 раза (Р<0,05).

2. Морфометрия области повреждения спинного мозга

Через 4 месяца после контузионной травмы спинного мозга свиньи в 1 опытной группе (см. Фиг. 1 (А) линия с квадратами) при наложении на область повреждения спинного мозга аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, суммарная площадь патологических полостей меньше по сравнению с контрольной группой (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами) на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы - Фиг. 1 (А).

Анализ Фиг. 1 (А) позволяет сделать следующие выводы:

- обнаружена статистически достоверная разница (Р<0,05) по критерию суммарной площади патологических полостей между 1 опытной (наложение МСК из жировой ткани, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, линия с квадратами) и контрольной группами (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами):

- на расстоянии 4 и 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении - в опытной группе (линия с квадратами) данный показатель был меньше в 6,6 и 4,8 раз по сравнению с контрольной группой (линия с ромбами) соответственно;

- на расстоянии 2 и 3 мм в ростральном направлении - в опытной группе (линия с квадратами) данный показатель был меньше в 1,4 и 2,7 раз по сравнению с контрольной группой (линия с ромбами) соответственно.

Сравнительный анализ указанных экспериментальных групп был также проведен по критерию сохранности ткани. Так, обнаружено:

- в 1 опытной группе (линия с квадратами) при наложении на область повреждения спинного мозга аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, площадь сохранной ткани на расстоянии 3, 4 и 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении в 1,9, 1,7 и 1,4 раза (Р<0,05) соответственно превышает аналогичный показатель в контрольной группе (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами) - Фиг. 2 (В);

- в ростральном направлении достоверная разница (Р<0,05) между 1 опытной (наложение на область повреждения МСК из жировой ткани, заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, линия с квадратами) и контрольной (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами) группами по критерию сохранности ткани была обнаружена на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы и составила 16,27 мм² и 22,75 мм² соответственно.

Через 4 месяца после контузионной травмы спинного мозга свиньи и наложении на область повреждения спинного мозга аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol (2 опытная группа, см. Фиг. 1Б, линия с квадратами), суммарная площадь патологических полостей меньше на расстоянии от 3 до 5 мм в ростральном и от 2 до 5 мм в каудальном направлении от эпицентра травмы по сравнению с контрольной группой (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами) - Фиг. 1 (Б). При этом статистически достоверная разница (Р<0,05) по критерию суммарной площади патологических полостей между 2 опытной (линия с квадратами) и контрольной (линия с ромбами) группами была обнаружена в каудальном направлении (от 2 до 5 мм от эпицентра травмы), где указанный показатель был меньше на 6661110 мм² (в 3,7 раз), 9403316,5 мм² (в 7,8 раз), 8862440,5 мм² (в 9 раз) и 5977903,5 мм² (в 9,2 раза) соответственно - Фиг. 1 (Б).

Во 2 опытной группе (линия с квадратами) при наложении на область повреждения спинного мозга аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol, площадь сохранной ткани была статистически достоверно больше (более чем в 2,6 раза) по сравнению с контрольной группой (наложение Tissucol без клеток, линия с ромбами) также в каудальном направлении (от 1 до 5 мм) от эпицентра травмы - Фиг. 2 (Г).

Таким образом, основываясь на результатах исследования, представляется возможным сделать вывод о том, что заявленный способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократном наложении мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в матрикс, на область повреждения, отличающийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки выделяют из жировой ткани или пульпы зуба, заключают в фибриновый матрикс Tissucol, в подострый период травматического процесса спинного мозга наносят несколько продольных надсечек в твердой мозговой оболочке и накладывают мезенхимальные стволовые клетки, заключенные в фибриновый матрикс Tissucol, на область повреждения, позволяет эффективно стимулировать посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в виде улучшения показателя восстановления двигательной функции, а также увеличения сохранности ткани и снижения посттравматической кавитации.

Улучшение указанных выше структурных показателей свидетельствует о позитивном влиянии применяемой терапии на посттравматическую регенерацию в спинном мозге свиней и обеспечении более полного восстановления структур спинного мозга, ответственных за выполнение двигательной функции.

Заявителем впервые:

применен способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократном наложении мезенхимальных стволовых клеток (МСК), заключенных в матрикс, на область повреждения, характеризующийся тем, что МСК выделяют из жировой ткани или пульпы зуба, заключают в фибриновый матрикс Tissucol, в подострый период травматического процесса наносят нескольких продольных надсечек в твердой мозговой оболочке и накладывают МСК, заключенные в фибриновый матрикс Tissucol, на область повреждения спинного мозга;

показано стимулирующее влияние клеточной терапии, сочетающей доставку в область повреждения мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани или пульпы зуба, и матрикса из фибринового гидрогеля Tissucol, в который заключены используемые клетки, на посттравматическое восстановление структур спинного мозга, ответственных за выполнение двигательной функции.

Использование заявленного способа стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга методом наложения на область повреждения мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани или пульпы зуба и заключенных в фибриновый гидрогель Tissucol, позволяет улучшить результаты посттравматической регенерации спинного мозга в виде более полного восстановления функции и структуры органа (Пример 3).

Заявленное техническое решение позволяет обеспечить реализацию поставленных целей, а именно более полное восстановление структур спинного мозга человека, ответственных за выполнение двигательной функции, и повышение доступности способа лечения, заключающегося в возможности проведения аутологичных трансплантаций.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как на дату предоставления заявочных материалов заявителем из подвергнутых анализу источников патентной и непатентной информации РФ и стран зарубежья не выявлена заявленная совокупность признаков с идентичными заявленному техническому решению признаками.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. совокупность заявленных признаков обеспечивает получение неочевидных для специалиста технических результатов.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «промышленная применимость», предъявляемого к изобретениям, т.к. было апробировано на практике в условиях лаборатории института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета, в результате чего были реализованы все цели, поставленные в заявленном техническом решении, а именно реализовано более полное восстановление структур спинного мозга, ответственных за выполнение двигательной функции.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может быт использовано для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга. Способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга заключается в однократном наложении мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в матрикс, на область повреждения. Мезенхимальные стволовые клетки выделяют из жировой ткани или пульпы зуба, заключают в фибриновый матрикс Tissucol. Через 6 недель после травматического процесса спинного мозга наносят несколько продольных надсечек в твердой мозговой оболочке и накладывают мезенхимальные стволовые клетки, заключенные в фибриновый матрикс Tissucol, на область повреждения. Использование данного способа позволяет улучшить показатели восстановления функции спинного мозга, эффективно поддерживая структуру ткани в области повреждения, способствуя успешному протеканию процессов нейрорегенерации. 3 пр., 2 ил.

Способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократном наложении мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в матрикс, на область повреждения, отличающийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки выделяют из жировой ткани или пульпы зуба, заключают в фибриновый матрикс Tissucol, через 6 недель после травматического процесса спинного мозга наносят несколько продольных надсечек в твердой мозговой оболочке и накладывают мезенхимальные стволовые клетки, заключенные в фибриновый матрикс Tissucol, на область повреждения.