СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА Azotobacter Российский патент 2006 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12R1/65 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть реализовано в микробиологической промышленности для получения различных бактериальных удобрений.

Широко известно использование штаммов азотобактера при производстве удобрений, например штамм Azotobacter chroococcum T12, штамм Azotobacter chroococcum В-3173, депонированный в ЦМПМ ВНИИГенетики (см. пат. РФ №2074159, C 05 F 11/08, 1997). Недостатком указанных штаммов является отсутствие положительного эффекта в повышении урожайности зеленых культур, а также довольно высокое содержание нитратов в них, в случае использования для их возделывания бактериального удобрения на базе данного штамма.

Известно, что для стимулирования роста бактерий в питательную среду добавляют триптофан (см. Патент РФ №2035442, C 05 F 11/08, 1992). Используют его в сочетании со средой Муромцева для бактерий Achromobacter.

В качестве прототипа может быть рассмотрен способ синтеза штамма бактерий Azotobacter chroococcum ВКПМ В 6010, используемого для получения бактериального удобрения под зеленые культуры (см. патент РФ №2074159, C 08 F 11/08, 1997). Выращивают штамм в ферментере на питательной среде Берка до концентрации клеток 10⁸-10⁹ клеток/мл.

Продукты синтеза на питательной среде Берка (после 4 суток инкубации при 28-30°С): биотин - 0,07, пиридоксин - 0,59, тиамин - 1,9 мг/л, гетероауксин - 65,0 мг/л. Азотфиксация - 0,26 мкг азота/мл в час.

Штамм Azotobacter chroococcum B35 обладает способностью прикрепляться к поверхности корней ряда зеленых культур, в частности сельдерея (Apium), петрушки (Petrocelinum) и салата (Lactuca sativa), где функционирует в течение 5 месяцев после инокуляции. В этом случае повышается урожайность зеленых культур и снижается содержание нитратов.

Однако известный способ не всегда позволяет получить быстрый прирост биомассы бактерий из-за особенностей физиологической активности определенного штамма. В состав известной среды для культивирования азотфиксаторов не входят соединения - предшественники синтеза фитогормонов (индолил-3-уксусной кислоты (ИУК)), а также ростовые факторы - стимуляторы прироста биомассы (витамины, аминокислоты). Для создания бактериального удобрения используется конкретный штамм, проявляющий свою активность при определенных условиях и используемый для выращивания определенных растений.

Решаемая задача - расширение возможностей использования широкого спектра штаммов бактерий рода Azotobacter для приготовления бактериальных удобрений.

Технический результат - повышение ростовой активности клеток бактерий и улучшение адаптации удобрений к конкретным условиям.

Этот технический результат достигается тем, что в способе приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter, включающем культивирование бактерий на питательной среде Берка, культивирование бактерий ведут предварительно на плотной среде Эшби в течение 24-28 часов, при температуре 26-28°C; затем ими инокулируют жидкую среду Берка с добавлением экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) в количестве 0,3-0,7 г/л (для получения биомассы клеток в экспоненциальной фазе), выдерживают в термостате при той же температуре в течение 20-24 часов при перемешивании; полученную накопительную культуру вносят в рабочий объем свежей среды Берка с добавлением триптофана 0,2-1,0 г/л и ЭКД, культивируют в течение 40-48 часов при той же температуре; затем помещают в холодильник для дальнейшего хранения.

Получают накопительную культуру штаммов азотобактера, обогащенную присутствием индолил-3-уксусной кислоты.

Предварительное культивирование бактерий на среде Эшби активирует азотфиксирующую способность.

Среда Берка имеет более богатый минеральный состав.

Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) содержит комплекс витаминов и аминокислот, что оказывает стимулирующее влияние на скорость размножения и азотфиксирующую активность. Использование ЭКД позволяет получить значительный прирост биомассы уже в первые 4-6 часов культивирования, независимо от количества внесенной культуры. Триптофан стимулирует синтез ИУК до количеств 40 мкг/мл культуральной жидкости, однако максимальное количество зависит от особенностей штамма.

ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

1. Культивируемый штамм высевают на плотную среду Эшби и культивируют в течение 24-28 часов, при температуре 26-28°С для накопления большой массы активно делящихся азотфиксирующих клеток.

2. Полученную массу клеток смывают с поверхности плотной среды 2-5 мл жидкой среды Берка и инокулируют в 0,5 литра среды Берка с добавлением 0,3-0,7 г/л ЭКД для получения популяции клеток с концентрацией 10⁹-10¹¹ кл/мл. Культивируют в течение 20-24 часов при той же температуре.

3. Полученную суспензию вносят в рабочий объем среды Берка (10-50 литров) с ЭКД и с добавлением триптофана (0,2-1,0 г/л). Триптофан вносят для интенсивного накопления ИУК в рабочем объеме среды. Культивируют в течение 40-48 часов, при температуре 26-28°С.

4. Готовый продукт хранят в холодильнике при температуре от 0 до 10°С.

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА.

1. Культивируемый штамм высевают на плотную среду Эшби и культивируют в течение 26 часов, при температуре 27°С для накопления большой массы активно делящихся азотфиксирующих клеток.

Уменьшение времени культивирования не позволяет получить достаточную массу клеток, а увеличение - приводит к возрастанию сроков приготовления конечного продукта. Культивирование при температуре ниже 26°С продлевает сроки развития микробных клеток, повышение температуры может привести к преждевременному отмиранию части бактерий.

2. Полученную массу клеток смывают с поверхности плотной среды 2-5 мл жидкой среды Берка и инокулируют в 0,5 литра среды Берка с добавлением 0,5 г/л ЭКД для получения популяции клеток с концентрацией 10⁹-10¹¹ кл/мл. Культивируют в течение 22 часов. Сокращение сроков культивирования не позволяет получить достаточных концентраций клеток, а продление сроков приводит к общему увеличению времени для приготовления конечного продукта. Снижение количества вносимого экстракта кормовых дрожжей менее 0,3 г/л не позволяет получить достаточных концентраций бактерий в среде, а внесение избыточных количеств экстракта повышает стоимость конечного продукта, не давая существенных преимуществ препарату.

В таблице 1 приведены концентрации клеток разных штаммов бактерий Azotobacter в мл среды Берка. Все они давали значительный прирост биомассы.

3. Полученную суспензию вносят в рабочий объем среды Берка (10-50 литров) с ЭКД, с добавлением триптофана (0,6 г/л). Культивируют в течение 44 часов, при температуре 27°С. Увеличение дозы вносимого триптофана ведет к удорожанию процесса, уменьшение - не создает благоприятных условий для накопления фитостимулятора. Культивирование менее 40 часов не позволяет накопить достаточных концентраций фитогормона в конечном продукте, увеличение времени приводит к удорожанию процесса. Выбранный ранее температурный режим культивирования наиболее оптимален для развития клеток азотобактера.

В таблице 2 приведены концентрации ИУК, накапливаемой в среде Берка различными штаммами бактерий Azotobacter. Все они продуцировали достаточно высокие концентрации ИУК.

4. Через 44 часа полученный готовый продукт переносят в холодильник для хранения.

Для обоснования приведенных в формуле параметров проводили испытания на их крайних и запредельных значениях, на основании чего сделаны приведенные выше выводы.

Полученными препаратами обрабатывали семена различных культур и наблюдали активность их прорастания, а также прирост биомассы у выросшей 3-недельной рассады разных видов растений. Результаты исследований приведены в таблицах 3, 4 (таблица 3 - прорастание семян, таблица 4 - увеличение биомассы).

Таким образом, предлагается способ получения накопительной культуры для приготовления препарата из штаммов азотобактера, обитающих в почве конкретной территории и адаптированных к данным условиям среды.

Предложенный способ позволяет использовать в качестве основы для приготовления удобрения разные штаммы бактерий Azotobacter. При этом установлено, что они наиболее активны, если вносятся в ту же почву, откуда были выделены. О повышении урожайности можно судить по всхожести семян и эффективному накоплению биомассы растений (таблицы 3, 4).

Таблица 1Исследуемые штаммыКоличество клеток в 1 мл среды Берка: без ЭКДс ЭКД.Az.chroococcum 662,5·10⁶20,4·10⁸Az.chroococcum 111,5·10⁶13,0·10⁸Az.chroococcum 121,4·10⁶13,5·10⁹Az.chroococcum 12,0·10⁶18,0·10⁸Az.chroococcum 615,0·10⁶60,0·10⁷Таблица 2Исследуемые штаммыКоличество ИУК в среде Берка... (мкг/мл) без триптофанас триптофаномAz.chroococcum 60-следы12,3Az.chroococcum 110-следы32,0Az.chroococcum 120-следы32,2Az.chroococcum 10-следы30,6Az.chroococcum 660-следы35,8 Таблица 3Исследуемые штаммыКоличество проросших семян из 100... (%) козлятника...фасоли... необр.обр-ыхнеобр.обр-ыхAz.chroococcum 6661798496Az.chroococcum 1169768795Az.chroococcum 1267788398Az.chroococcum 171798998Az.chroococcum б51729197

Таблица 4Исследуемые штаммыМасса 100 3-недельных проростков... (г) козлятника...фасоли... необр.обр-ыхнеобр.обр-ыхAz.chroococcum 664,211,4275315Az.chroococcum 114,810,9246304Az.chroococcum 124,310,5239308Az.chroococcum 14,911,2264302Az.chroococcum 64,410,8283311

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть реализовано в микробиологической промышленности для получения различных бактериальных удобрений. Способ предусматривает культивирование бактерий рода Azotobacter на плотной среде Эшби в течение 24-28 часов при температуре 26-28°С. Затем полученную массу клеток культивируют в жидкой среде Берка с добавлением экстракта кормовых дрожжей, а полученную накопительную культуру вносят в рабочий объем среды Берка с добавлением триптофана и экстракта кормовых дрожжей. После культивирования готовый продукт помещают в холодильник для хранения. Способ обеспечивает повышение ростовой активности клеток бактерий. 4 табл.

Способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter путем культивирования их на питательной среде Берка, отличающийся тем, что культивирование бактерий ведут предварительно на плотной среде Эшби в течение 24-28 ч при температуре 26-28°С, затем их инокулируют в жидкую среду Берка с добавлением экстракта кормовых дрожжей в количестве 0,3-0,7 г/л, выдерживают в термостате при той же температуре в течение 20-24 ч при перемешивании, полученную накопительную культуру вносят в рабочий объем свежей среды Берка с добавлением триптофана 0,2-1,0 г/л и экстракта кормовых дрожжей, после культивирования в течение 40-48 ч при той же температуре готовый продукт помещают в холодильник для хранения.