ПОЛИМЕРНЫЙ МАТЕРИАЛ (ГИДРОГЕЛЬ) НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО АЛЬГИНАТА ДЛЯ РАЗМЕЩЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/04 C12N11/02 A61K47/36 A61K35/74 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биоразлагаемых, биосовместимых и биологически активных материалов для медицины и экспериментальной биологии, обладающих дополнительным терапевтическим эффектом за счет биологической активности живых пробиотических бактерий, культивируемых in situ в альгинатном гидрогеле, помещенном в область повреждения стенки желудочно-кишечного тракта, для лечения некоторых хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения, а также для создания экспериментальных моделей этих заболеваний с целью разработки новых лекарственных и диагностических средств для их лечения. Заявляемый способ позволяет создать материал для регенеративной медицины нового типа, где активным действующим началом служат пробиотические бактерии, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Уровень техники

Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют заплаты кишечника и эндопротезы (плаги, стенты) из биоразлагаемых полимеров, предназначенных для закрытия дефекта тканей стенки кишечника и их регенерации. Однако, недостатками таких медицинских изделий часто являются недостаточная совместимость с окружающими тканями, неспособность к биоразложению с заданными сроками и отсутствие длительного терапевтического воздействия на область дефекта ткани с целью ее регенерации, что связано с использованием полимерных материалов синтетического происхождения, которые обладают плохой биосовместимостью как с тканями стенки кишечника, так и с пробиотическими бактериями, обладающими терапевтическим эффектом при восстановлении тканей. Кроме того, такие изделия часто имеют упрощенное строение, не учитывающее морфологические и физиологические особенности слизистой стенки кишечника, что ухудшает их терапевтическую эффективность, или, напротив, избыточно сложную конструкцию, что значительно усложняет их производство [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584].

В настоящее время в медицине, фармацевтике и тканевой инженерии активно используются целый ряд природных биополимеров: альгинат, хитозан, декстран, гиалуроновая кислота, агароза, ксантан, хондроитин сульфат, фибрин, коллаген (желатин), фиброин щелка, поли-L-лизин, полиглутаминовая кислота, поли-3-оксиалканоаты [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584]. Так, альгинаты, образующие биосовместимые гидрогели, активно используются в медицине, фармацевтике, косметологии и пищевой промышленности, в биотехнологии, например, для инкапсулирования клеток различных культур млекопитающих (фибробластов, миобластов, остеобластов, МСК, хондроцитов и др.), а также в тканевой инженерии для изготовления матриксов для роста клеток различных типов [Lee K.Y., Mooney D.J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci., 2012, 37(1), 106-126]. Однако зачастую медицинское использование биополимеров никак не учитывает их роль и функции в природе. Так, если в водорослях альгинаты выполняют преимущественно структурно-механическую функцию, то у бактерий, способных к синтезу этого полисахарида родов Azotobacter и Pseudomonas, их функции более разнообразны, но главная из них - защитная. Клетки этих бактерий синтезируют и секретируют этот экзополихасахарид для формирования внешней слизистой оболочки отдельных клеток и их скоплений - цист или биопленок, которые защищают бактериальные клетки от неблагоприятных внешних факторов. Образование биопленки служит главной причиной патогенеза инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, вызывающими опасное инфекционное поражение эпителия легких. Кроме того, бактериальный альгинат обладает устойчивостью к воздействию альгиназ микробиоты кишечника, в отличие от, например, альгината водорослей. Это связано с тем, что бактериальный альгинат отличается от альгинатов, выделенных из водорослей, более высокой молекулярной массой, большим молярным содержанием в полимере остатков гиалуроновых кислот и уровнем ацетилизования гидроксильных групп маннуроновых остатков в положении 2 и 3. Показано, что эти физико-химические свойства бактериальных альгинатов критически важны для формирования биопленки бактериями Pseudomonas sp. В совокупности эти свойства биополимера позволяют создавать такую слизистую оболочку вокруг бактериальной клетки, которая препятствует: расщеплению биопленки альгиназами, проникновению через нее других бактерий, фагоцитозу инкапсулированных бактерий макрофагами и нейтрофилами, воздействию на них цитотоксических лимфоцитов и антител, снижает воздействие на бактериальные клетки токсинов и антибактериальных лекарственных веществ. Кроме того, альгинатный гидрогель биопленки обеспечивает защиту от высыхания, удержание и аккумуляцию питательных веществ, удержание и связывание катионов, аккумуляцию внеклеточных факторов вирулентности бактерий, утилизации продуктов метаболизма других бактерий, стабильность плазмид и эффективность генетического обмена между бактериями, улучшенную межклеточную связь, создание и поддержание микросреды [Ghafoor А., Hay I.D., Rehm В.Н. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(15), 5238-5246]. Более того, последние исследования свидетельствуют о том, что и другие бактерии используют альгинаты, синтезируемые P. aeruginosa для формирования своего собственного биофильма [Scoffield J.A., Duan D., Zhu F., Wu H. A commensal streptococcus hijacks a Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide to promote biofilm formation. PLoS Pathog., 2017, 13(4), el006300]. Показано также, что формирование биопленки патогенными бактериями играет важную роль в процессах заживления и хронического воспаления повреждений эпителия. Отдельные представители микрофлоры эпителия, такие как Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis (durans), Escherichia coli, Fusobacterium sp.образуют биопленки, которые представляют собой толстый слизистый барьер, защищающий микроорганизмы от внешних угроз, что ухудшает регенерацию поврежденного эпителия [Percival S.L., McCarty S.M., Lipsky В. Biofilms and Wounds: An Overview of the Evidence. Adv. Wound Care (New Rochelle), 2015, 4(7): 373-381].

В последние годы все больше данных свидетельствует о том, что микробиота человека играет важную роль в процессах регенерации эпителия, в т.ч. слизистой стенки кишечника при ее повреждении, и эта роль далеко не всегда негативная. Показано, что микробиота активирует и поддерживает врожденный иммунитет, важна для нормального функционирования иммунной системы, регулирует воспалительные процессы. Показано, что изменения в составе микробиоты кишечника связаны с возникновением различных патологических состояний, в том числе воспалительных заболеваний кишечника, астмы, сахарного диабета II типа, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний и психиатрических отклонений [Aron-Wisnewsky J., Clement К. The gut microbiome, diet, and links to cardiometabolic and chronic disorders. Nat. Rev. Nephrol., 2016, 12(3): 169-181]. Более того, бактерии могут не только противодействовать заживлению эпителиальных тканей, в частности слизистой оболочки кишечника, но и способствовать ему [Uchida М., Shimizu К., Kurakazu К. Yogurt containing Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21 yogurt) accelerated the healing of acetic acid-induced gastric ulcer in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010, 74(9), 1891-1894; Lam E.K., Yu L., Wong H.P., Wu W.K., Shin V.Y., Tai E.K., So W.H., Woo P.C., Cho C.H. Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG enhances gastric ulcer healing in rats. Eur. J. Pharmacol, 2007, 565(1-3), 171-179]. Альгинаты, выделенные из водорослей, использовались для инкапсулирования пробиотических бактерий микробиоты кишечника, в этих исследованиях было показано сохранение жизнеспособности бактерий и положительный эффект инкапсулирования бактерий для терапии заболеваний кишечника при их применении в качестве пробиотиков [D'Orazio G., Di Gennaro P., Boccarusso M., Presti I., Bizzaro G., Giardina S., Michelotti A., Labra M., La Ferla B. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99(22), 9779-9789].

Таким образом, учитывая актуальность исследований по разработке материалов медицинского назначения для восстановления дефектов различных тканей и исследований терапевтического потенциала пробиотических бактерий для регенерации тканей особенно актуальными техническими решениями являются те, которые связаны с разработкой средств на основе бактериального альгината, служащих для обеспечения жизнеспособности, роста и терапевтической активности пробиотических бактерий для регенерации тканей стенки кишечника, а также способов, позволяющих создать медицинское изделие для регенеративной медицины нового типа, где активным действующим началом служат пробиотические бактерии, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине.

Из уровня техники известна композиция на основе бактериальных экзополисахаридов, а именно геллановой камеди. Данная композиция, преимущественно для перорального введения, может также содержать агент, улучшающий состояние желудочно-кишечного тракта [RU 2563137, 20.09.2015]. Данное изобретение представляет способы и композиции для профилактики или лечения диареи у млекопитающего. К недостаткам данной композиции и способа можно отнести то, что для композиции не показана ее способность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий, а способ не позволяет проводить локальное направленное терапевтическое воздействие на поврежденные ткани стенки пищеварительного тракта.

Из уровня техники известен препарат с контролируемым высвобождением и способ его получения, который способен высвобождать в верхней части тонкого кишечника 99% или более слаборастворимого лекарственного средства [US 6274174B1, 2001-08-14]. Изобретателям удалось разработать способ получения слаборастворимого лекарственного средства на агрегатах сферических микрочастиц альгината мультивалентного металла, в котором каждая из вторичных частиц имеет удельную площадь от 1 до 280 м²/г. Недостатком данной композиции является ее неспособность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий, а также способ не позволяет проводить локальное направленное терапевтическое воздействие на поврежденные ткани стенки пищеварительного тракта и не предназначен для инкапсулирования в качестве биоактивного агента пробиотических микроорганизмов.

Из уровня техники известна композиция, состоящая из гидрогеля на основе коллагенового матрикса в сочетании с полоксамером или альгинатом и заключенных в нем вирусных векторов [US 6333194 B1, 2001-12-25]. Данное изобретение направленно на таргетное заживление различных типов тканей или клеток по принципу непосредственной доставки данной композиции к месту повреждения, поэтому такая композиция может относится к области фармакологии. Недостатком такой композиции является то, что некоторые виды вирусов, которые могут доставляться в комбинации, а именно, лентивирусы аденовирусы или вирус герпеса могут вызывать инсерционный мутагенез, по причине случайного встраивания в геном клеток хозяина, также они обладают цитотоксичностью и иммуногенностью, что также нежелательно при терапии живых объектов.

Из уровня техники известно о биополимерном материале в виде микросфер с высокой пористостью на основе поли-3-оксибутирата, полученных методом бактериального биосинтеза, обладающих свойствами биосовместимости и биодеградации, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующему пролонгированному высвобождению положительно заряженного терапевтического белка при введении микросфер в различные ткани, что может быть использовано в регенеративной медицине для длительной терапии повреждений различных тканей. Однако, недостатком данной композиции является ее неспособность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий [RU 2692768, 29.12.2017].

Из уровня техники известно о биополимерном материале в виде микрокапсул из различных биоматериалов, в том числе полисахаридов, включая альгинат, содержащих пробиотические бактерии, и помещенных в гель. Недостатками этого материала являются жесткие способы инкапсулирования пробиотических бактерий, что снижает их жизнеспособность; использование большого количества различных материалов, что может снижать биосовместимость материала; и быстрый срок разрушения при температуре 37±1°С [RU 2652277, 13.04.2017].

Этот материал может быть выбран в качестве наиболее близкого аналога по числу общих сходных признаков.

Раскрытие изобретения

Технической задачей (изобретения), является получение гидрогеля из бактериального альгината, в который помещены живые пробиотические бактерии, обладающие антагонистической активностью, что обеспечивает их рост in situ в условиях агрессивной среды желудочно-кишечного тракта при различных его заболеваниях и замещение ими патогенной микрофлоры в области повреждения тканей. Это может быть использовано для лечения различных заболеваний желудочно-кишечного тракта благодаря терапевтической функциональности пробиотиков.

Техническим результатом для способа является получение полимерного материала (гидрогеля), обеспечивающего не менее 95% выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в материале [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»], а также их защиту и рост.

Полимерный материал гидрогеля, служащего субстратом для обеспечения жизнеспособности и роста пробиотических бактерий и предназначенного также для заполнения пористых полимерных конструкций - бактериальный альгинат получают способом контролируемого микробиологического биосинтеза с использованием штамма-продуцента этого биополимера Azotobacter chroococcum 7Б [RU 2194759, 20.12.2002; Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68] или других бактерий рода Azotobacter. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСОз - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - от 0,05 до 1,00; K₂HPO₄ - от 0,05 до 1,00; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - от 20 до 40. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом А. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания от 200 до 400 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях.

Для выделения альгината биомассу штамма-продуцента смешивают с раствором 50 мМ ЭДТА в 0,9% NaCl (вес.) и тщательно перемешивают, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев.

Разработанный способ биосинтеза альгината позволяет получать полимер со следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) от 10⁵ до 10⁶ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере от 31 моль% до 48 моль% и уровнем ацетилирования - от 10 моль% до 46 моль% (определяемых методом ИК-спектроскопии). Такие параметры бактериального альгината близки свойствам бактериального альгината, образующего бактериальную биопленку [Boyd A., Chakrabarty A.M. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol., 1995, 15(3), 162-168; Nivens D.E., Ohman D.E., Williams J., Franklin M.J. Role of alginate and its О acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J. Bacteriol., 2001, 183(3), 1047-1057; Tielen P., Strathmann M., Jaeger K.E., Flemming H.C., Wingender J. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research, 2005, 160(2), 165-176; Ghafoor A., Hay I.D., Rehm B.H. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(15), 5238-5246].

На следующем этапе в альгинате, полученном микробиологическим путем выращивают пробиотические бактерии. Сначала культуры бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium выращивают на полужидкой среде, обеспечивающей рост указанных бактерий. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. При культивировании бактерий рода Lactobacillus готовую среду не хранят. При культивировании бактерий рода Bifidobacterium готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С. Для этого с помощью пипетки, вносят в полужидкую питательную среду 1,0±0,1 мл суспензии бактериальных клеток и перемешивают [Schillinger U., Holzapfel W.H. Chapter 8. Culture media for lactic acid bacteria, p. 127-140. In: Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Edited by Janet E.L. Corry, G.D.W. Curtis, Rosamund M. Baird. V.37, 2003].

Параллельно готовят 1±0,1% (вес.) водный раствор альгината натрия с молекулярной массой от 1,0x10⁵ до 1,0x10⁶ г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 25±5°С и скорости перемешивания 40-80 об/мин.

Для посева культуры бактерий рода Lactobacillus готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносят 3±0,2 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150±10 мл питательной среды на основе бактериального альгината в MRS-бульоне. Колбу с жидкой посевной культурой инкубируют 96±6 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37±1°С и скорости перемешивания 120±20 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см).

Для посева культуры бактерий рода Bifidobacterium сначала проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96±6 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8,0±0,2 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината в MRS-бульоне. Содержимое колбы перемешивают.Для получения культуры бактерий рода Bifidobacterium в полужидкой среде на дно колбы вносят 4,0±0,2 мл рабочей культуры. Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96±6 часа при 37±1°С без перемешивания.

Из полученного таким образом бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливают гидрогель в виде пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50±10 мл 50±1 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2±1 мм, после чего инкубируют 20 мин при температуре 25±3°С. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. В результате получают пленку толщиной от 0,5 до 2 мм, содержащую пробиотические бактерии в концентрации более 1×10⁷ КОЕ/г. Причем, такая методика позволяет увеличивать содержание бактерий в гидрогеле по отношению к первоначальному, тогда как в других методиках содержание бактерий в композиции, напротив, значительно уменьшается.

Эффективность полученного гидрогеля оценивали с помощью модельных тестов: теста устойчивости гидрогеля при температуре 37°С, теста устойчивости в симулированной среде кишечника, тестов ферментативной устойчивости, теста устойчивости в среде чужеродных бактерий, теста миграции бактерий из гидрогеля, теста исследования на цитотоксичность in vitro. В качестве препарата-сравнения использовали инкапсулированную форму бактерий в водорослевом альгинате, изготовленную путем диспергирования соответствующих пробиотических бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium в 2% (об.) растворе водорослевого альгината с последующим получением пленки из альгинатного гидрогеля с инкапсулированными в ней бактериями с помощью раствора хлорида кальция так, что содержание бактерий в полученных пленках было таким же как и в тестируемых конструкциях.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37±1°С: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, наносят на стеклянную поверхность чашки Петри и помещают в термостат с поддерживаемой в нем температурой 37±1°С. Выдерживают в течение 10±1 мин, после чего извлекают и наблюдают за изменением формы и агрегатного состояния гидрогеля, фиксируя время полной деформации с момента нанесения на стеклянную поверхность.

Тест устойчивости в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее 95% абсолютной их выживаемости, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].

Тест ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей альгинат лиазу, следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл альгинат лиаза (Сигма-Алдрич, ≥10000 ед./г), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечить не менее чем 25% повышение выживаемости бактерий, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].

Тест ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей лизоцим, следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл лизоцима (Сигма-Алдрич, ≥40000 ед./мг), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее чем 25% повышение выживаемости бактерий, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].

Тест ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей липазу, следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл липазы (Сигма-Алдрич, ≥40000 ед./мг), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин. при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее чем 25% повышение выживаемости бактерий, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].

Тест устойчивости в среде чужеродных бактерий: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, в стерильных условиях помещают в коническую колбу на 250 мл на полужидкой среде, состоящей из 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара в толщу среды, в которую предварительно внесена культура Е. coli BL21 (GE Healthcare, США), содержимое колбы не перемешивают, после инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку, после чего инкубируют 24±4 часа при 37±1°С без перемешивания. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее чем 25% повышение устойчивости культур бактерий родов Lactobacillus или Bifidobacterium к проникновению в гидрогель чужеродных бактерий Е. coli BL21 или наличие в гидрогеле не более 5% чужеродных бактерий Е. coli BL21 от общего количества бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139- 2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].

Тест миграции бактерий из гидрогеля: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие пробиотические бактерии, в стерильных условиях помещают в коническую колбу на 250 мл на полужидкой среде, состоящей из 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара в толщу среды, содержимое колбы не перемешивают, после инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку, после чего инкубируют 24±4 часа при 37±1°С без перемешивания. Полученный гидрогель должен обеспечивать распространение бактерий родов Lactobacillus или Bifidobacterium в полужидкой среде, в которой помещен гидрогель, на расстояние не менее чем 10 мм от образца гидрогеля, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].

Тест исследования на цитотоксичность in vitro проводили согласно ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». В качестве культуры клеток используют фибробласты мыши линии Balb/3Т3З и испытание методом прямого контакта. Проводят качественную оценку по баллам. Полученный гидрогель не должен быть цитотоксичным (должен иметь балл по шкале цитотоксичности не более «0»).

Краткое описание чертежей

Предложенное изобретение характеризуется следующими графическими материалами.

На Фиг. 1 представлены фрагменты гидрогеля бактериального альгината с растущими в них пробиотическими бактериями Bifidobacterium longum МС-42, при помещении их на стандартную твердую среду через 96 часов культивирования.

Осуществление изобретения

Для биосинтеза бактериального альгината использовали штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б [Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68]. Оптическую плотность культуральной среды контролировали нефелометрически при 520 нм. Морфологию бактерий рода Azotobacter контролировали при помощи световой микроскопии с использованием микроскопа Биомед-1 («Биомед», Россия) с цифровой камерой. Для визуализации клеток и альгината использовали окраску фуксином. Эффективность очистки бактериального альгината контролируют при помощи измерения проводимости 1% (вес.) раствора альгината, используя кондуктометр S30 SevenEasyTM (Mettler Toledo, США). Молекулярную массу бактериального альгината определяют методом вискозиметрии; химическое строение и уровень ацетилирования определяют методом ИК-спектроскопии согласно [Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68].

Все остальные используемые реагенты и штаммы пробиотических бактерий родов родов Lactobacillus и Bifidobacterium являются коммерчески доступными (ООО «Спутник-К»), все процедуры, если не оговорено особо, осуществляют при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С, а культивирование пробиотических бактерий - при температуре 37±1°С. Микроструктуру биоинженерной конструкции (пористость, размер пор, диаметр полученных микросфер) контролировали с помощью сканирующей электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа JSM-6380LA (Jeol, Япония) с предварительным напылением золота на исследуемые образцы в течение 15 мин с помощью установки IB-3 (Giko, Japan) при силе тока 15 мА и программы обработки изображений Image J. Рост культур контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, USA), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой). Определение количества бактерий в полученной биоинженерной конструкции проводят по стандартной методике высева бактерий на плотную агаризованную питательную среду с последующим подсчетом выросших колоний; результаты выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 мл (КОЕ/мл) согласно [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Термины: «биологически активный», «биоинженерный», «пробиотические бактерии», «пробиотики», «культивирование», «биосовместимый», «биоразлагаемый», «терапевтический» употребляются в соответствии с их общепринятыми определениями [Биосовместимые материалы: Учебное пособие / Под. ред. В.И. Севостьянова, М.П. Кирпичникова. Москва. Медицинское информационное агентство, 2011, 540 стр. ; Пробиотики и пребиотики / Всемирная гастроэнтерологическая организация (WGO). Практические рекомендации. 2008. http://www.gastroscan.ru/literature/authors/5634].

Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

Пример 1

Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получали бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий использовали твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.К., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184] культивировали в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 40. Сначала готовили посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивали в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводили биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивировали в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific», США) при скорости перемешивания 400 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводили в стерильных условиях. Для выделения альгината проводили обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводили центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяли и промывали водой. Затем к нему добавляли 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяли и промывали водой. После этого проводили очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждали 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводили диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяли и высушивали при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладал следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 1×10⁵ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 36% и уровнем ацетилирования - 23% (определяемых методом ИК-спектроскопии).

На 2-ом этапе выращивали пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (ООО «Спутник-К»). На полужидкой среде культуру L. plantarum 8Р-А3 выращивали в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливали питательную среду, укупоривали ватно-марлевыми пробками и автоклавировали. Готовую среду не хранят. Посев осуществляли, как только температура среды после автоклавирования достигала 40°С.

Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносили 3 мл MRS-бульона. Снимали клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносили полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой инкубировали 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролировали методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяли при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).

В конической колбе на 250 мл готовили 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. plantarum на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры (5×10⁸ КОЕ/г) вносили в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубировали 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждали центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливали. Все процедуры проводили в стерильных условиях.

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Полученная пленка имела толщину 0,8 мм и содержала пробиотические бактерии в концентрации 2,3×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (1,9×10⁷ КОЕ/г) в 12,1 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸ КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 2,3×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3, т.е 95% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 28% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 34% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 43% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали присутствие не более 4% чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 8 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].

Пример 2

Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,05; MgS O₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 20. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 2,6×10⁵ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 46% и уровнем ацетилирования - 24% (определяемых методом ИК-спектроскопии).

На следующем этапе выращивают пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (ООО «Спутник-К»). На полужидкой среде культуру L. plantarum 8Р-А3 выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду не хранят. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.

Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносят 3 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой (5×10⁸ КОЕ/г) инкубируют 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. plantarum на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры вносят в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубируют 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждают центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливают. Все процедуры проводят в стерильных условиях.

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Таким образом, получают альгинатный гидрогель, содержащий 3,7×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (1,9×10⁷ КОЕ/г) в 19,5 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸ КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 3,6×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3, т.е 97% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 36% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 48% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 52% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали не более 1% чужеродных бактерий Е. coli BL21 в гидрогеле. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 3 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].

Пример 3

Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар -20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза -40. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 7,6×10⁵ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 31% и уровнем ацетилирования - 48% (определяемых методом ИК-спектроскопии).

На полужидкой среде культуру Bifidobacterium longum МС-42 (ООО «Спутник-К») выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината с молекулярной массой 4.8×10⁵ г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры В. longum МС-42 в полужидкой среде на дно колбы вносят 4 мл рабочей культуры (1×10⁸ КОЕ/г). Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96 часа при 37°С без перемешивания. Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Таким образом, получают альгинатный гидрогель, содержащий 1,9×10⁷ КОЕ/г бактерий В. longum МС-42. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (2,7×10⁶ КОЕ/г) в 7,1 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸ КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 1,8×10⁷ КОЕ/г бактерий В. longum МС-42, т.е 96% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 56% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 67% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 89% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали отсутствие чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 2 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].

Пример 4

Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,00; KH₂PO₄ - 1,00; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза -30. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 1,0×10⁶ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 35% и уровнем ацетилирования - 10% (определяемых методом ИК-спектроскопии).

На 2-ом этапе выращивают генетически модифицированные пробиотические бактерии Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 (ООО «Спутник-К»), содержащие плазмиду pMCl с геном устойчивости к хлорамфениколу pC194, полученные по стандартной методике [Serror P., Sasaki Т., Ehrlich S.D., Maguin Е. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L. delbrueckii subsp.lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol., 2002, 68(1), 46-52]. На полужидкой среде культуру L. delbrueckii subsp.bulgaricus VI104 выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду не хранят. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.

Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-агаре, вносят 3 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой инкубируют 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры вносят в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубируют 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждают центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливают. Все процедуры проводят в стерильных условиях.

На 3-ем этапе выращивают культуру L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 на полужидкой среде в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют.Готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината с молекулярной массой 4.8×10⁵ г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 в полужидкой среде на дно колбы вносят 4 мл рабочей культуры (1×10⁸ КОЕ/г). Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96 часа при 37°С без перемешивания. Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Таким образом, получают пленку из альгинатного гидрогеля, содержащую не менее 4,3×10⁷ КОЕ/г L. delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (2,7×10⁶ КОЕ/г) в 15,9 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸ КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 4,1×10⁷ КОЕ/г бактерий L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712, т.е 96% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 31% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 34% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 43% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали отсутствие чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 3 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].

Таким образом, как показали проведенные эксперименты, бактериальный альгинат обеспечивал большую лучшую выживаемость пробиотических бактерий и большую устойчивость к неблагоприятным факторам (воздействию среды, действию ферментов и чужеродных бактерий) в симулированной среде полости кишечника in vitro.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены полимерный материал для размещения пробиотических бактерий на основе бактериального альгината, продуцируемого бактериями рода Azotobacter, и способ его получения. Способ включает наращивание биомассы бактерий A. chroococcum и A. vinelandii в жидкой среде Берка, смешивание биомассы с раствором 50 мМ ЭДТА в 0,9 вес.% NaCl, осаждение 96% этиловым спиртом и очистку. Раствор бактериального альгината дополнительно гелируют в водном растворе 50±1 мМ хлорида кальция в течение 10±1 мин. Изобретения обеспечивают получение биологически активного материала для регенеративной медицины при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 ил.

1. Полимерный материал для размещения пробиотических бактерий на основе бактериального альгината, продуцируемого бактериями рода Azotobacter, с молекулярной массой от 1×10⁵ до 1×10⁶ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере от 25 до 48 моль% и уровнем ацетилирования от 10 до 46 моль%.

2. Полимерный материал по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве пробиотических бактерий используют бактерии родов Lactobacillus и Bifodobacterium.

3. Способ получения полимерного материала по п. 1, характеризующийся тем, что проводят наращивание биомассы из бактерий A. chroococcum и A. vinelandii в жидкой среде Берка, с последующим выделением бактериального альгината путем смешивания биомассы с раствором 50 мМ ЭДТА в 0,9 вес.% NaCl, полученный осадок отделяют, промывают водой, затем осаждают 96% этиловым спиртом, повторно промывают водой и проводят очистку полимера, после чего готовят водный раствор полученного альгината.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что водный раствор полимерного материала по п. 1 используют для приготовления полутвердой культуральной среды для наращивания пробиотических бактерий родов Lactobacillus и Bifodobacterium, а для инкапсулирования бактерий в полимерном материале по п. 1 проводят гелирование раствора.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что осуществляют гелирование раствора бактериального альгината, полученного по способу по п. 3, посредством его помещения в водный раствор хлорида кальция с концентрацией 50±1 мМ на 10±1 мин.