СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ПРОМЕЖУТОЧНОГО ПРОДУКТА ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Российский патент 2024 года по МПК A61K38/37 C07K1/16 C07K1/34 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящая заявка относится к технической области препаратов крови и, в частности, относится к способу криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови и способу приготовления препарата фактора VIII свертывания крови, включая способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Препарат фактора VIII свертывания крови (далее в настоящем документе также именуется как препарат FVIII) - это препарат крови, обладающий особым эффектом в отношении профилактики и лечения кровотечений у пациентов с гемофилией А. Инфузия препарата фактора VIII свертывания крови пациентам с гемофилией А может непосредственно восполнять уровень FVIII в плазме пациента, тем самым обеспечивая лечение или предотвращая кровотечение и облегчая симптомы. Гемофилия А представляет собой связанное с полом генетическое заболевание, а средний уровень заболеваемости гемофилией А составляет около 1/5000. Клинические проявления включают в себя самопроизвольное или неостановимое кровотечение в суставах, мышцах, внутренних органах и глубоколежащих тканях после незначительной травмы. Заболевание часто начинается в детском возрасте, а повторные кровоизлияния в суставы приводят к прогрессирующей дисфункции суставов и ограничению физических возможностей детей. Когда у пациентов с гемофилией А после травмы наблюдается непрерывное кровотечение, обусловленное дефектами механизма свертывания крови, им необходимо ввести достаточное количество препарата FVIII. Хотя указанный препарат FVIII обладает значительным гемостатическим эффектом, он является неустойчивым in vivo, и при повторном кровотечении требуется повторная инфузия. Если профилактическую терапию концентрированным FVIII осуществлять путем регулярных инфузий, то пациенты, страдающие тяжелой формой гемофилии, могут жить почти так же, как и обычные люди. Поэтому, несмотря на то, что общее число пациентов с гемофилией А относительно невелико, потребность в препарате FVIII является огромной.

[0003] Заместительная терапия с применением фактора свертывания крови по-прежнему остается наиболее эффективной мерой гемостаза при острых кровотечениях в случае гемофилии. Принцип лечения заключается в выявлении на ранней стадии, применении достаточного количества и прохождении полного курса лечения. При выборе дозировки и продолжительности лечения путем заместительной терапии следует учитывать место кровотечения и его тяжесть. Острое кровотечение следует лечить, учитывая обстоятельства: может быть выбран генетически рекомбинантный препарат FVIII или полученный из крови препарат FVIII с инактивированный вирусом, а для нестандартного пациента может быть выбран криопреципитат или свежезамороженная плазма. Однако существует риск заражения вирусами, передающимися при переливании крови. Поэтому следует, по возможности, избегать его применения для лечения детей с гемофилией.

[0004] Проблемы, возникающие при клиническом применении рекомбинантных продуктов FVIII, включают в себя: повторное применение высоких доз генетически рекомбинантного FVIII высокой степени чистоты; повышенный риск выработки антител из-за ингибиторов, т. е. антител, ингибирующих FVIII (Государственное управление по контролю качества медикаментов и продуктов питания (SFDA) и Европейское Агентство по оценке лекарственных препаратов (EMEA) предупреждают о риске образования антител при применении рекомбинантного фактора VIII свертывания крови человека, Pharmacovigilance Express News, 2006, 3(3): 187); и проблематичность антитела, ингибирующего FVIII, с точки зрения его автоматического клиренса, что, в свою очередь, вызывает неконтролируемое кровотечение, повышенную частоту госпитализаций и повреждение суставов, приводящих, в конечном итоге, к повышению заболеваемости и смертности. По сравнению с высокочистым FVIII генетической рекомбинации уровень ингибирующих антител к FVIII, которые вырабатываются после повторного применения FVIII, полученного из крови, является более низким, особенно у детей с гемофилией А. Поэтому для пациентов с гемофилией А, нуждающихся в долгосрочной инфузии FVIII, ингибирующее антитело к FVIII, полученному из крови, является более безопасным, и в то же время его цена ниже, а медицинская нагрузка - меньше. Таким образом, существует потребность в дальнейшей разработке и оптимизации технологического маршрута получения продукта FVIII из плазмы человека для обеспечения доступности профилактических/терапевтических препаратов и возможности выбора клинических препаратов для пациентов с гемофилией А.

[0005] Способ кислотного осаждения в сочетании с очисткой колоночной хроматографией представляет собой один из классических способов получения FVIII из крови. Его принцип заключается в следующем: FVIII является нерастворимым при низких температурах; около 50% FVIII в плазме осаждают с помощью криопреципитации; криопреципитат плазмы, в качестве раствора для растворения исходного материала, адсорбирует витамин К-зависимые факторы свертывания крови через алюминиевый гель, тем самым разрывая цепь свертывания крови; FVIII является не активированным и теряет активность в процессе производства. Согласно характеристикам аминокислотных остатков белковой молекулы фибриногена (Fg), удаление Fg происходит путем осаждения в условиях кислого рН, в то время как большая часть FVIII остается в надосадочной жидкости. Из-за ограничения производительности обработки на этапе предварительной очистки крупномасштабное производство препарата FVIII затруднено. Реальность, с которой сталкиваются различные компании, производящие препараты из крови, заключается в том, что при выпуске человеческого иммуноглобулина, человеческого альбумина и других продуктов для внутривенного введения, компании-производители препаратов крови могут получить только ограниченный объем готового продукта FVIII, который соответствует входному количеству плазмы в каждой партии. Производительность обработки на этапе предварительной очистки, таком как этап технологического процесса перед стерилизацией и фильтрацией маточного раствора, значительно понижена по сравнению с производительностью обработки на таких этапах технологического процесса, как промежуточная упаковка и сублимационная сушка. Таким образом, масштаб производства препарата FVIII в определенной степени ограничены масштабом приготовления криопреципитата плазмы исходного материала и масштабом приготовления промежуточного продукта перед стерилизацией и фильтрацией маточного раствора. Однако компании, производящие препараты крови, не могут решить вышеуказанные проблемы, просто увеличив количество плазмы на входе, поскольку производственная линия FVIII разработана на основе линии для производства важных препаратов крови, таких как человеческий иммуноглобулин и человеческий альбумин. Следовательно, количество продукта FVIII, которое, соответственно, может быть получено компаниями-производителями препаратов крови от каждой партии вводимой в производство плазмы, является ограниченным. Для компаний, производящих препараты крови, после завершения производственной линии фиксируют количество плазмы в каждой входной партии, и производственная линия не может быть изменена по желанию без одобрения отдела контроля и управления производством лекарственных средств. Для расширения производственных мощностей обычно применяют параллельный способ, обеспечивающий увеличение объема выпуска за то же время, но это выдвигает все более высокие требования к капиталовложениям, организации и инфраструктуре. В заключение, независимо от масштаба производства компаний-производителей препаратов крови, всегда существует противоречие между масштабами производства препарата FVIII на начальном и конечном этапах.

[0006] Поэтому, с одной стороны, для удовлетворения потребности пациентов с гемофилией А в доступности профилактических/лечебных препаратов и возможности выбора клинических препаратов; и, с другой стороны, для решения проблемы, связанной с увеличением объема производства продуктов FVIII компаниями-производителями препаратов крови, существует потребность в безотлагательной разработке технологического процесса получения продукта FVIII, который подходит для крупномасштабного производства и обеспечивает гибкость в применении.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Для решения упомянутых выше технических проблем в настоящем изобретении предложен способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови, который помогает гибко обеспечить крупномасштабное производство препарата FVIII.

[0008] Настоящее изобретение осуществлено за счет применения следующих схем.

[0009] В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови. Способ включает в себя: криоконсервацию в качестве промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови любого из концентрированного раствора FVIII или хроматографического элюента FVIII перед получением маточного раствора, или перед концентрированием путем ультрафильтрации, или после концентрирования путем ультрафильтрации в процессе получения препарата фактора VIII и их комбинаций или вариантов.

[0010] Когда термин «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к хроматографическому элюенту FVIII, он необязательно представляет собой хроматографический элюент FVIII, обладающий аффинностью к гепарину, или анионный хроматографический элюент FVIII.

[0011] Когда термин «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к концентрированному раствору FVIII перед получением маточного раствора, он, предпочтительно, представляет собой концентрированный раствор FVIII до стерилизации и фильтрации перед получением маточного раствора; предпочтительно концентрированный раствор FVIII до наномембранной фильтрации перед получением маточного раствора; и, предпочтительно, концентрированный раствор FVIII до ультрафильтрации перед получением маточного раствора.

[0012] В одном варианте осуществления вариант «промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный путем регулирования концентрации хроматографического элюента FVIII путем диализа и/или буфера. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор FVIII, концентрированный с помощью ультрафильтрации, полученный путем ультрафильтрации вышеупомянутого концентрированного раствора FVIII. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор образца после того, как концентрация вышеуказанного раствора FVIII, концентрированного с помощью ультрафильтрации, отрегулирована буфером и до получения маточного раствора.

[0013] В одном варианте осуществления вариант «промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный путем инактивации вирусов хроматографического элюента FVIII.

[0014] В одном варианте осуществления вариант «промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой хроматографический элюент, в который добавлен активный защитный агент FVIII.

[0015] Кроме того, скорость замораживания промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови больше или равна 1 °С/мин, а сохраняют промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови в условиях температур от -15 °С до -196 °С.

[0016] Кроме того, скорость замораживания находится в диапазоне от 1 °C/мин до 10 °C/мин.

[0017] Кроме того, скорость замораживания находится в диапазоне от 1 °C/мин до 3 °C/мин.

[0018] Кроме того, скорость замораживания находится в диапазоне от 1,5 °C/мин до 3 °C/мин.

[0019] В конкретном варианте осуществления скорость замораживания составляет 1,5 °C/мин.

[0020] Кроме того, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют в условиях температур от -20 °С до -80 °С.

[0021] Кроме того, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют в условиях температур от -20 °С до -55 °С.

[0022] Кроме того, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют с помощью жидкого азота или сухого льда.

[0023] Упомянутый выше промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови имеет удельную активность ≥1 МЕ/мг, или ≥10 МЕ/мг, или ≥50 МЕ/мг, или ≥70 МЕ/мг, или ≥100 МЕ/мг, или ≥200 МЕ/мг или ≥1000 МЕ/мг.

[0024] Раствор промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови имеет рН от 6,5 до 7,5.

[0025] В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения препарата фактора VIII свертывания крови, включающий в себя описанный выше способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови.

[0026] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ снижения осаждения примесей продукта фактора VIII свертывания крови. В технологическом процессе получения продукта фактора VIII свертывания крови промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови подвергают криоконсервации в соответствии с описанным выше способом криоконсервации.

[0027] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ улучшения долгосрочной стабильности продукта фактора VIII свертывания крови. В технологическом процессе получения продукта фактора VIII свертывания крови промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови подвергают криоконсервации в соответствии с описанным выше способом криоконсервации.

[0028] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает продукт, полученный с помощью вышеупомянутого способа.

[0029] Кроме того, указанный продукт представляет собой препарат FVIII или комплекс FVIII и фактора фон Виллебранда (vWF).

[0030] Настоящее изобретение обладает следующими полезными техническими эффектами.

[0031] По настоящему изобретению раствор промежуточного продукта FVIII замораживают при скорости замораживания, которая превышает или равна 1 °C/мин, и подвергают криоконсервации в течение длительного периода в условиях температур от -15 °С до -196 °С. Результаты испытаний подтверждают, что применение криоконсервации промежуточного продукта FVIII по способу согласно настоящему изобретению может обеспечить улучшенную удельную активность без изменения активности FVIII. Кроме того, способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII согласно настоящему изобретению может, в определенной степени, улучшить стабильность промежуточного продукта FVIII.

[0032] Криоконсервированный раствор промежуточного продукта препарата фактора VIII свертывания крови может быть в дальнейшем применен в качестве маточного раствора для последующего процесса производства FVIII и в качестве сырья для получения готового продукта, а также он может быть применен для приготовления готового продукта FVIII надлежащего качества, соответствующего требованиям «Китайской фармакопеи», издание 2015 г. Результаты испытаний на стабильность готового продукта FVIII подтверждают, что упомянутый выше готовый продукт FVIII может иметь стабильные свойства в течение 48 месяцев при хранении в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C.

[0033] Таким образом, при условии, что скорость восстановления активности FVIII и скорость восстановления удельной активности не снижены, а также при условии, что стабильность препарата FVIII при длительном хранении не ухудшена, способ криоконсервации раствора промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови препарата согласно настоящему изобретению может повысить гибкость технологического процесса производства FVIII и способствовать увеличению объема производства и выработке препарата FVIII в больших масштабах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0034] На ФИГ. 1 представлена блок-схема технологического процесса получения готового продукта FVIII, в которой заштрихованный участок представляет собой этап технологического процесса, на котором получают так называемый «промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови» по настоящему изобретению.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0035] Чтобы ясно разъяснить цели, технические схемы и преимущества настоящего изобретения, настоящее изобретение подробно описано ниже в сочетании с конкретными примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, описанные в настоящем документе, предназначены только для разъяснения настоящего изобретения, а не для ограничения его объема.

[0036] Как известно специалистам в данной области техники, все технологические процессы, применяемые в существующем промышленном производстве продукта FVIII, получаемого из крови, или технологические процессы, которые разработаны и оптимизированы дополнительно, выполняют безостановочно и без перерывов. Поскольку содержание FVIII в сыворотке является крайне незначительным (от 0,05 мг/л до 0,1 мг/л) и он является чрезвычайно нестабильным в условиях in vitro, потеря активности препарата FVIII или раствора очищенного промежуточного продукта при комнатной температуре является очень заметной. Таким образом, в масштабе промышленного производства, изготовление препарата FVIII начинается с подготовки исходного материала плазмы путем криопреципитации до инактивации вирусов, при этом все рабочие процедуры следует выполнять безостановочно и без перерывов, даже если для удобства проведения эксперимента в лаборатории на различных стадиях очистки ученые часто сохраняют образцы белка с помощью криоконсервации. Кроме того, отдел надзора за производством лекарственных средств не разрешает включать в технологический процесс производства препарата FVIII хранение различных партий очищенных промежуточных материалов и объединение эквивалентных количеств очищенных промежуточных материалов из разных партий. Причина заключается в том, что активность FVIII может быть снижена при замораживании и оттаивании промежуточного продукта (Стабильность фактора фон Виллебранда и FVIII в криопреципитате собачьих при различных условиях хранения, Stokol T и соавт. Res Vet Sci. (1995)), что, в свою очередь, непосредственно влияет на активность и качество готового продукта. Возможным механизмом этого нежелательного результата могут быть небольшие кристаллы льда и относительно большая площадь поверхности раздела лед-жидкость, которые могут образовываться в процессе замораживания белкового раствора, что может увеличить степень воздействия на белковые молекулы поверхности раздела лед-жидкость, тем самым повышая риск инактивации из-за денатурации белков; а во время процесса оттаивания рекристаллизация белкового раствора дополнительно подвергает молекулы белка на границе раздела лед-жидкость воздействию значительного поверхностного натяжения или механического усилия сдвига, тем самым усиливая повреждение (источник «Effect of freezing and thawing rates on denaturation of proteins in aqueous solutions», Biotechnology and Bioengineering, VOL. 82, No. 6, June 20, 2003).

[0037] Кроме того, в технологическом процессе производства продукта FVIII, описанном или зарегистрированном в патентных документах, других научных документах и справочной литературе в этой области (например, «Blood Transfusion Therapy and Blood Preparations» под редакцией Liu Junxiang), такой этап криоконсервации промежуточного продукта FVIII еще не описан и не введен. Например, компания Taibang Biological Group Co., Ltd., которая является отечественным производителем препаратов крови, имеет патент CN108218981A, в котором описан способ получения FVIII. В частности, для получения готового продукта FVIII указанный способ включает в себя: растворение криопреципитата плазмы в качестве исходного материала; осуществление его кислотного осаждения, адсорбцию на геле DEAE Sephadex A-50, инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D), колоночную хроматографию с применением геля TOYOPEARL DEAE-650M, ультрафильтрацию, получение полуфабриката и готового продукта. В качестве другого примера, для получения готового продукта FVIII способ получения FVIII, описанный в патенте CN107880112A, который принадлежит компании Hualan Biological Engineering, Inc., включает в себя: растворение криопреципитата плазмы в качестве исходного материала с помощью раствора трометамина; выполнение его осаждения полиэтиленгликолем, инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D), колоночную хроматографию с применением геля ToyopearlDEAE 650M, ультрафильтрацию, получение полуфабриката и готового продукта FVIII. Способ получения FVIII, описанный в патенте CN107337727A, который принадлежит компании Wuhan Blood Products Co., Ltd., включает в себя: растворение криопреципитата плазмы в качестве исходного материала; получение маточного раствора для начальной экстракции путем осаждения полиэтиленгликолем и инактивации вирусов; получение очищенного экстракционного маточного раствора путем анионообменной хроматографии; получение очищенного раствора с помощью ультрафильтрационного диализа; и получение готового продукта FVIII путем сублимационной сушки, инактивации сухим жаром и упаковки. Ни один из перечисленных выше способов получения препарата FVIII, как описано вышеуказанными компаниями-производителями препаратов крови, не включает в себя этап криоконсервации промежуточного продукта FVIII.

[0038] Благодаря многолетней практике в сфере массового производства заявитель обнаружил, что в масштабах производства неожиданный технический эффект практического отсутствия потери в скорости восстановления активности FVIII и удельной активности может быть достигнут за счет специального управления условиями криоконсервации промежуточного продукта FVIII. В то же время заявитель также неожиданно обнаружил, что после криоконсервации вышеупомянутого раствора промежуточного продукта FVIII при низкой температуре степень осаждения видимых посторонних веществ при комнатной температуре снижена. Путем выявления показателя С активности FVIII криоконсервированного раствора промежуточного продукта FVIII после хранения при комнатной температуре в течение 24 часов было обнаружено, что потеря активности FVIII замедляется, а стабильность при комнатной температуре значительно улучшена.

[0039] В способе криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению скорость замораживания для криоконсервации промежуточного продукта FVIII составляет не менее 1 °C/мин, предпочтительно в диапазоне от 1 °C/мин до 10 °C/мин, более предпочтительно в диапазоне от 1 °С/мин до 3 °С/мин и более предпочтительно - в диапазоне от 1,5 °С/мин до 3 °С/мин. Когда промежуточный продукт FVIII полностью заморожен, температуру замораживания следует поддерживать по меньшей мере такой, чтобы хранить промежуточный продукт FVIII в полностью замороженном состоянии. Промежуточный продукт FVIII по настоящему изобретению после замораживания в указанных выше условиях затем хранят при температуре от -15 °С до -196 °С, предпочтительно от -20 °С до -80 °С и, более предпочтительно, от -20 °С до -55 °С.

[0040] В некоторых конкретных вариантах осуществления промежуточный продукт FVIII замораживают и хранят с применением жидкого азота или сухого льда.

[0041] В некоторых вариантах осуществления продолжительность криоконсервации промежуточного продукта FVIII может составлять от 0 до 24 месяцев или более.

[0042] В некоторых случаях промежуточный продукт FVIII имеет удельную активность (МЕ/мг) ≥1 МЕ/мг. В других случаях удельная активность (МЕ/мг) промежуточного продукта FVIII составляет ≥10 МЕ/мг, или ≥50 МЕ/мг, или ≥70 МЕ/мг, или ≥100 МЕ/мг, или ≥200 МЕ/мг или ≥1000 МЕ/мг.

[0043] В некоторых вариантах осуществления раствор промежуточного продукта препарата FVIII имеет показатель pH в диапазоне от 6,5 до 7,5. В некоторых конкретных вариантах осуществления буфер промежуточного продукта FVIII может представлять собой буфер, содержащий одну или более аминокислот. Буфер может представлять собой любой из цитратно-натриевого буфера, фосфатного буфера, трис-буфера и т. д. Изоэлектрическая точка комплекса FVIII-vWF находится в диапазоне от 5,5 до 6,0. При pH от 6,5 до 7,5 комплекс FVIII-vWF заряжен отрицательно, что подходит для дальнейшей очистки FVIII способом анионной хроматографии. В то же время нейтральные условия при pH от 6,5 до 7,5 способствуют защите активности FVIII.

[0044] Кроме того, в способе криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению его эффект криоконсервации в меньшей степени зависит от других предыдущих этапов технологического процесса. После оттаивания криоконсервированного промежуточного продукта FVIII с последующим выполнением таких технологических операций, как фильтрация, приготовление полуфабриката, стерилизация, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация сухим жаром можно получить препарат FVIII надлежащего качества, удовлетворяющий требованиям «Китайской фармакопеи» (издание 2015 г. ).

[0045] Так называемый «препарат FVIII» в настоящем описании может также упоминаться как «препарат антигемофильного глобулина».

[0046] Так называемый «технологический процесс изготовления препарата FVIII» в настоящем описании относится ко всему технологическому процессу изготовления препарата FVIII. Способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII, который будет освещен в примерах настоящего описания, может служить связующим звеном в общем технологическом процессе производства препарата FVIII.

[0047] В предшествующем уровне техники процесс производства FVIII начинается с криопреципитата плазмы, при этом промежуточный продукт FVIII получают с помощью множества этапов, таких как гель-адсорбция, инактивация вирусов и хроматография, а для получения готового продукта FVIII промежуточный продукт FVIII дополнительно готовят и помещают в промежуточную упаковку для проведения сублимационной сушки или других процессов инактивации вирусов. Как правило, он включает в себя множество конкретных этапов: приготовление криопреципитата плазмы, растворение криопреципитата для получения растворяющего раствора и фильтрация осадка; выполнение кислотного осаждения в растворяющем растворе путем регулирования pH; адсорбция надосадочной жидкости гелем; и проведение инактивации вирусов, хроматографии, ультрафильтрации, стерилизации и т. п. на проточном растворе после гель-адсорбции; и, для окончательного получения готового продукта FVIII, выполнение таких этапов, как дозирование, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация вирусов сухим жаром.

[0048] Для реализации настоящего изобретения базовый технологический маршрут получения препарата FVIII является следующим: приготовление криопреципитата плазмы; растворение криопреципитата плазмы для получения растворяющего раствора; выполнение предварительного осаждения растворяющего раствора путем регулирования pH и фильтрации осадка для получения надосадочной жидкости; адсорбция надосадочной жидкости выдержанным гелем; и обработка надосадочной жидкости, полученной после гель-адсорбции, на технологических этапах, таких как инактивация вирусов, хроматография, ультрафильтрация и стерилизация, и, для окончательного получения готового продукта FVIII, выполнение таких операций, как дозирование, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация вирусов сухим жаром.

[0049] Для реализации настоящего изобретения возможный базовый технологический маршрут получения препарата FVIII является следующим: приготовление криопреципитата плазмы; растворение криопреципитата плазмы для получения растворяющего раствора; выполнение предварительного осаждения растворяющего раствора путем регулирования pH и фильтрации осадка для получения надосадочной жидкости; адсорбция надосадочной жидкости выдержанным гелем; и обработка надосадочной жидкости, полученной после гель-адсорбции, на технологических этапах, таких как инактивация вирусов, хроматография, ультрафильтрация и стерилизация, и, для окончательного получения готового продукта FVIII, выполнение таких операций, как дозирование, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация вирусов сухим жаром.

[0050] Для реализации настоящего изобретения возможный базовый технологический маршрут получения препарата FVIII является следующим: приготовление криопреципитата плазмы; растворение криопреципитата плазмы в трис-буфере; после осаждения полиэтиленгликолем для инактивации вирусов с липидной оболочкой обрабатывают 0,3% трибутилфосфатом и 1% Tween 80 в течение 6 часов; и затем проводят хроматографическую очистку с помощью материала DEAE 650M. Большинство различных белков, трибутилфосфат и Tween 80 могут проходить непосредственно с проточным раствором, а элюент представляет собой промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови человека (со ссылкой на опубликованный документ «Feasibility Study on Production Process Amplification of Human Blood Coagulation Factor VIII Stock Solution»).

[0051] Если не указано иное, как показано на ФИГ. 1, так называемый «промежуточный продукт FVIII» в настоящем изобретении относится к концентрированному раствору FVIII перед приготовлением маточного раствора, или перед концентрированием путем ультрафильтрации, или после концентрирования путем ультрафильтрации, или к хроматографическому элюенту FVIII.

[0052] Когда так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к хроматографическому элюенту FVIII, он необязательно представляет собой хроматографический элюент FVIII, обладающий аффинностью к гепарину, или анионный хроматографический элюент FVIII. Предпочтительно, промежуточный продукт FVIII представляет собой анионный хроматографический элюент FVIII. Изоэлектрическая точка комплекса FVIII-vWF составляет от 5,5 до 6,0, а при pH от 6,5 до 7,5 комплекс имеет отрицательный заряд. В то же время нейтральные условия способствуют защите активности FVIII. Следовательно, более предпочтительной является очистка FVIII с помощью анионной хроматографии. Распространенные возможные среды для анионной хроматографии включают в себя, не ограничиваясь ими, материалы DEAE Sephadex A-50, TOYOPEARL DEAE-650M, DEAE 650, Q-sepharose-FF, DEAE-SAPHROSEFF, DEAE-FractogelTSK650M, DEAE SepharoseTSK650M, DEAESepharoseFF, CaptoDEAE, QsepharoseFF, CaptoQ и QSepharoseHP и т. д. При необходимости вместо матрицы для анионообменной хроматографии можно использовать анионообменную хроматографическую мембрану. Имеющиеся в коммерческом доступе анионообменные мембраны включают в себя, не ограничиваясь ими, SartobindTM Q (Sartorius), MustangTM Q (Pall Technologies) и InterceptTM Q (Millipore).

[0053] Когда так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к концентрированному раствору FVIII перед приготовлением маточного раствора, он, предпочтительно, представляет собой концентрированный раствор FVIII до стерилизации и фильтрации и перед приготовлением маточного раствора; предпочтительно концентрированный раствор FVIII до наномембранной фильтрации и перед приготовлением маточного раствора.

[0054] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем криопреципитации плазмы и гель-адсорбции с помощью Al(OH)3; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; и очистки надосадочной жидкости с помощью геля DEAE Sephadex A-50.

[0055] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем криопреципитации плазмы, кислотного осаждения и гель-адсорбции с помощью материала DEAE Sephadex A-50; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; и очистки надосадочной жидкости путем гель-адсорбции с помощью геля TOYOPEARL DEAE-650M.

[0056] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем выполнения криопреципитации плазмы и гель-адсорбции с помощью Al(OH)3; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; и очистки надосадочной жидкости путем инактивации вирусов способом «растворитель-детергент» и гель-адсорбции с помощью материала DEAE Sephadex A-50.

[0057] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем выполнения криопреципитации плазмы; растворения с помощью буфера с нейтральным pH с последующей гель-адсорбцией с помощью Al(OH)3; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; обработки надосадочной жидкости способом «растворитель-детергент», а затем очистки надосадочной жидкости с помощью анионной гель-адсорбции (Fractogel TMAE 650); нагрева элюента до 63 °C в течение 10 часов под защитой сахара и аминокислот; и удаление стабилизатора с помощью второй анионной колоночной гель-хроматографии.

[0058] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой раствор образца, который получен путем последовательного выполнения криопреципитации плазмы, гель-адсорбции с помощью Al(OH)3; осаждения глицином, осаждения NaCl и регулирования концентрации буфером перед получением маточного раствора.

[0059] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем последовательного выполнения криопреципитации плазмы, фракционного осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) и адсорбционной очистки с помощью аффинного гепаринового геля (такого как Heparin Sepharose® 6 FF).

[0060] Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный после того, как концентрация вышеупомянутого хроматографического элюента FVIII скорректирована с помощью диализа и/или буфера. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор FVIII, концентрированный с помощью ультрафильтрации, полученный путем проведения ультрафильтрации вышеупомянутого концентрированного раствора FVIII. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор образца до приготовления маточного раствора, полученный после того, как концентрация вышеупомянутого раствора FVIII, концентрированного путем ультрафильтрации, скорректирована с помощью буфера.

[0061] «Вариант промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный путем инактивации вирусов в хроматографическом элюенте FVIII. Вариант промежуточного продукта FVIII также может представлять собой хроматографический элюент, в который добавлен активный защитный агент FVIII. Активный защитный агент FVIII может быть выбран из сахаридов и аминокислот.

[0062] «Промежуточный продукт FVIII» в варианте осуществления также может представлять собой другой концентрированный раствор FVIII или хроматографический элюент FVIII, полученный до приготовления маточного раствора или до концентрирования с помощью ультрафильтрации, или после концентрирования с помощью ультрафильтрации в других технологических маршрутах для получения препарата FVIII, которые не описаны исчерпывающим образом в настоящем документе.

[0063] Способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII описан ниже в сочетании с конкретными примерами.

[0064] Пример 1

[0065] Сначала заявитель исследовал изменение показателя FVIII: скорость восстановления активности C перед тем, как хроматографический элюент FVIII был заморожен в жидком азоте и сохранен при низкой температуре (от -196 °C до -15 °C), и после этого.

[0066] Приготовление хроматографического элюента FVIII: в качестве сырья применяли криопреципитат плазмы, после растворения его подвергали кислотному осаждению, гель-адсорбции с помощью DEAE Sephadex A-50, инактивации вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовке к колоночной гель-хроматографии с помощью TOYOPEARL DEAE-650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Был определен показатель FVIII: скорость восстановления активности C хроматографического элюента FVIII.

[0067] Подготовленный хроматографический элюент FVIII разделяли на множество параллельных образцов, замораживали в жидком азоте и хранили, соответственно, при -196 °C, -80 °C, -60 °C, -40 °C, -20 °C и -15 °С в течение 12 месяцев. Затем образец оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, определяли показатель FVIII: активность С и рассчитывали скорость восстановления активности.

[0068] Результаты теста FVIII: скорость восстановления активности C приведены в Таблице 1 и показывают, что хроматографический элюент FVIII, замороженный в жидком азоте и сохраненный при низкой температуре (от -196 °C до -15 °C) в течение 12 месяцев, не продемонстрировал какой-либо потери активности.

[0069]

[Таблица 1] FVIII: скорость восстановления активности C перед криоконсервацией элюента для очистки FVIII в Примере 1, и после нее Температура хранения Длительность криоконсервации элюента очистки FVIII (мес.) 0 1 12 -196 °C 100 125,34 118,97 -80 °C 100 105,36 104,83 -60 °C 100 109,24 120,73 -40 °C 100 110,85 117,52 -20 °C 100 107,16 118,54

[0070] Заявитель разморозил при комнатной температуре на водяной бане упомянутые выше 6 криоконсервированных образцов элюента для очистки FVIII, а затем подверг их ультрафильтрации. После того, как образцы были выдержаны при комнатной температуре 2 часа, при визуальном осмотре неожиданно было обнаружено, что не были осаждены видимые посторонние вещества (способ проверки на наличие видимых посторонних веществ осуществлен со ссылкой на версию «Китайской фармакопеи» 2015 г. ). Ранее заявитель неоднократно обнаруживал, что если образец хроматографического элюента FVIII без криоконсервации поместить при комнатной температуре на 2 часа после ультрафильтрации, то осаждение постороннего вещества можно было наблюдать невооруженным глазом.

[0071] Кроме того, заявитель продолжил хранение вышеуказанных образцов при комнатной температуре в течение 24 часов и определял показатель FVIII: активность C, чтобы исследовать изменение показателя FVIII: скорость восстановления активности С.

[0072] Результаты испытаний, представленные в Таблице 2, показывают, что по сравнению с образцом без замораживания жидким азотом и хранения при низкой температуре, у элюента для очистки FVIII, подвергнутого криоконсервации, значительно уменьшена потеря активности при комнатной температуре в течение 24 часов, то есть, улучшена стабильность.

[0073]

[Таблица 2] Скорость восстановления активности элюента для очистки FVIII по Примеру 1 после криоконсервации и выдержки при комнатной температуре в течение 24 часов Температура низкотемпературного хранения 24 часа -196 °C 49,31% -80 °C 54,93% -60 °C 61,86% -40 °C 57,47% -20 °C 54,87% Образцы без криоконсервации 17,12%

[0074] Кроме того, заявитель исследовал влияние различных условий замораживания на скорость восстановления активности элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, стабильность в условиях комнатной температуры и влияние на качество готового продукта FVIII.

[0075] Пример 2

[0076] Приготовление хроматографического элюента FVIII: в качестве исходного материала применяли криопреципитат плазмы, его растворяли и подвергали кислотному осаждению, гель-адсорбции с помощью DEAE Sephadex A-50, инактивации вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовке к колоночной гель-хроматографии с помощью TOYOPEARL DEAE-650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 257 МЕ/мг.

[0077] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 1 °С/мин и хранили при температуре от -30 °С до -45 °С в течение 12 месяцев.

[0078] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 100 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.

[0079] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 20 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 7,0.

[0080] Пример 3

[0081] Приготовление хроматографического элюента FVIII: криопреципитат плазмы в качестве исходного материала растворяли с помощью раствора трометамина и подвергали осаждению полиэтиленгликолем (ПЭГ), выполняли инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовку к колоночной гель-хроматографии с помощью ToyopearlDEAE 650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 151 МЕ/мг.

[0082] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 10 °С/мин и криоконсервировали при температуре от -60 °С до -45 °С в течение 12 месяцев.

[0083] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 10 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.

[0084] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 6 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 6,7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 6,5.

[0085] Пример 4

[0086] Приготовление хроматографического элюента FVIII: криопреципитат плазмы в качестве исходного материала растворяли и подвергали осаждению полиэтиленгликолем (ПЭГ), выполняли инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовку к колоночной гель-хроматографии с помощью ToyopearlDEAE 650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 85 МЕ/мг.

[0087] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 1,5 °С/мин и криоконсервировали с помощью сухого льда в течение 12 месяцев.

[0088] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 20 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.

[0089] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 20 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 7,2.

[0090] Пример 5

[0091] Приготовление хроматографического элюента FVIII: криопреципитат плазмы в качестве исходного материала растворяли и подвергали гель-адсорбции с помощью DEAE Sephadex A-50, выполняли инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовку к колоночной гель-хроматографии с помощью TOYOPEARL DEAE-650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 54 МЕ/мг.

[0092] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 3 °С/мин и криоконсервировали при температуре от -20 °С до -30 °С в течение 12 месяцев, а затем хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водной бане.

[0093] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 200 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.

[0094] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 20 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 7,0.

[0095] Пример 6 - Пример 9

[0096] Криоконсервированные образцы, задействованные в Примерах с 6 по 9, были взяты, соответственно, из растворов элюентов для очистки FVIII, концентрированных ультрафильтрацией, по Примерам с 1 по 4. Раствор, концентрированный ультрафильтрацией, готовили следующим способом: диализ и концентрирование элюента для очистки FVIII с помощью ультрафильтрационной мембраны с пороговой молекулярной массой от 10 до 30 кДа с получением раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией.

[0097] Условия криоконсервации были такими же, как в Примерах с 2 по 5, а этапы диализного концентрирования, стерилизации, приготовления полуфабриката, промежуточной упаковки, сублимационной сушки и инактивации сухим жаром после объединения партий были такими же, как и аналогичные операции в Примерах 2-5.

[0098] Показатели FVIII: значение C для концентрированных ультрафильтрацией промежуточных продуктов FVIII составляют:

[0099] При условиях криоконсервации по Примеру 6: криоконсервация раствора FVIII: C = 111 МЕ/мл.

[00100] При условиях криоконсервации по Примеру 7: криоконсервация раствора FVIII: C = 98 МЕ/мл.

[00101] При условиях криоконсервации по Примеру 8: криоконсервация раствора FVIII: C = 73 МЕ/мл.

[00102] При условиях криоконсервации по Примеру 9: криоконсервация раствора FVIII: C = 52 МЕ/мл.

[00103] Сравнительный пример 1

[00104] Сравнительный пример 1 отличается от Примера 2 тем, что хроматографический элюент FVIII, полученный с помощью гель-колоночной хроматографии с применением материала TOYOPEARL DEAE-650M, непосредственно подавали на этап получения готового продукта FVIII, без проведения этапа криоконсервации хроматографического элюента FVIII.

[00105] Другие технологические процессы для получения готового продукта FVIII, такие как процесс очистки FVIII и процесс получения готового продукта, могут относиться к Примеру 2.

[00106] Различные показатели промежуточных продуктов FVIII по Примерам 2-9 до криоконсервации и после нее, а также показатели готового продукта сравнивают, как показано ниже.

[00107] 1. Влияние различных условий замораживания на скорость восстановления активности элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией

[00108] Определяли концентрацию белка и показатель FVIII: активность C элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, по Примерам 2-9 до криоконсервации и после нее, скорость восстановления активности и рассчитывали скорость восстановления удельной активности. Результаты приведены в Таблице 3.

[00109] Результаты показали, что:

[00110] После того, как промежуточные продукты фактора VIII свертывания крови из Примеров 2-9 были заморожены со скоростью, превышающей или равной 1 °C/мин, и подвергнуты криоконсервации при температуре от -20 °C до -60 °C в течение 12 месяцев, скорость восстановления активности не была снижена, а показатель FVIII: активность C был сохранен на должном уровне.

[00111] После того, как промежуточные продукты фактора VIII свертывания крови из Примеров 2-9 были заморожены со скоростью, превышающей или равной 1 °C/мин, и подвергнуты криоконсервации при температуре от -20 °C до -60 °C в течение 12 месяцев, скорость восстановления удельной активности не была снижена, а показатель FVIII: удельная активность C был улучшен.

[00112] Результаты вышеуказанных тестов показали, что способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению практически не оказывает влияния на показатели FVIII: скорость восстановления активности С и скорость восстановления удельной активности, обеспечивая сохранение активности FVIII и улучшение удельной активности.

[00113]

[Таблица 3] Скорость восстановления активности и скорость восстановления удельной активности элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, по Примерам 2-9 до криоконсервации и после нее Пример Длительность хранения (мес.) 0 1 3 6 12 Пример 2 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 103,06 97,22 102,50 108,84 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 103,07 97,22 102,51 108,84 Пример 3 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 113,25 104,85 115,99 111,26 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 113,26 102,71 113,62 110,26 Пример 4 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 110,33 103,00 112,45 110,98 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 112,67 105,19 117,33 111,15 Пример 5 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 99,30 100,00 99,30 99,30 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 100,00 101,69 101,71 110,26 Пример 6 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 109,55 101,61 110,98 110,31 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 109,66 101,71 111,15 111,15 Пример 7 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 121,42 117,36 124,49 111,60 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 106,96 107,33 107,62 н. д. Пример 8 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 111,60 106,15 124,58 н. д. Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 102,12 102,47 108,14 н. д. Пример 9 Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 112,54 107,76 119,89 н. д. Относительно скорости восстановления активности (%) при длительности хранения в 0 месяцев 100,00 103,86 101,66 105,65 н. д.

[00114] 2. Влияние различных условий замораживания на стабильность элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, при комнатной температуре

[00115] Образцы элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, по Примерам 2-9 оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, затем указанные образцы подвергали ультрафильтрации и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для определения их показателя FVIII: активность C. В то же время элюент для очистки FVIII/раствор FVIII, концентрированный ультрафильтрацией, по Примерам 2-9, которые не проходили криоконсервацию, подвергали ультрафильтрации и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для определения их показателя FVIII: активность C. Результаты тестов двух групп сравнивали и заносили в Таблицу 4.

[00116] Результаты тестов показали, что: после того, как элюент для очистки FVIII/раствор FVIII, концентрированный ультрафильтрацией, были подвергнуты криоконсервации по способу из Примеров 2-9, была существенно снижена потеря активности в условиях выдержки при комнатной температуре в течение 24 часов, а также была улучшена стабильность при хранении в условиях комнатной температуры.

[00117]

[Таблица 4] Влияние обработки с низкотемпературной криоконсервацией по Примерам 2-9 на скорость восстановления активности элюента для очистки FVIII, который хранили при комнатной температуре Пример С низкотемпературной криоконсервацией Без низкотемпературной криоконсервации Пример 2 64,54% 19,90% Пример 3 67,62% 21,31% Пример 4 61,44% 28,37% Пример 5 58,21% 23,48% Пример 6 66,13% 18,21% Пример 7 67,51% 22,54% Пример 8 68,27% 26,66% Пример 9 67,32% 27,41%

[00118] 3. Влияние различных условий замораживания на качество готового продукта FVIII, окончательно полученного из элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией

[00119] Согласно положениям «Китайской фармакопеи» (редакция 2015 г. ) были определены все показатели готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, и, в частности, было выполнено выявление видимых посторонних материалов. Результаты приведены в Таблице 5.

[00120] Результаты тестов показали, что:

[00121] готовый продукт FVIII, полученный в Примерах 2-9, в частности, результаты выявления видимых посторонних материалов, соответствуют требованиям «Китайской фармакопеи» (редакция 2015 г. ) для препарата FVIII. Результаты определения качества готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, не отличаются от готового продукта, полученного в Сравнительном примере 1.

[00122] Приведенные выше результаты определения дополнительно подтверждают, что: элюент для очистки FVIII/раствор FVIII, концентрированный ультрафильтрацией, обработанный способом криоконсервации по настоящему изобретению, может быть применен в качестве маточного раствора для последующего процесса производства FVIII и как исходный материал для получения готового продукта.

[00123]

[Таблица 5] Результаты тестирования основных показателей готового продукта FVIII, полученного в Примерах 2-9 Пример Удельная активность FVIII (МЕ/мг) Видимый посторонний материал (включение) Результаты полного выявления согласно положениям Китайской фармакопеи о выявлении посторонних включений в готовом продукте Пример 2 131 Соответствует Соответствует Пример 3 115 Соответствует Соответствует Пример 4 76 Соответствует Соответствует Пример 5 60 Соответствует Соответствует Пример 6 137 Соответствует Соответствует Пример 7 117 Соответствует Соответствует Пример 8 78 Соответствует Соответствует Пример 9 61 Соответствует Соответствует Сравнительный пример 1 108 Соответствует Соответствует

[00124] 4. Исследование долговременной стабильности готового продукта FVIII, полученного в Примерах 2-9

[00125] Готовые продукты FVIII, полученные в Примерах 2-9, хранили в холодильнике в течение 48 месяцев при температуре от 2 °C до 8 °C, при этом полностью контролировали все показатели готовых продуктов FVIII в соответствии с регламентом «Китайской фармакопеи» (редакция 2015 г. ). Результаты теста приведены в Таблице 6.

[00126] Результаты тестов показали, что: готовый продукт FVIII, полученный с применением криоконсервированного элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, обладал стабильными свойствами в течение 48 месяцев в условиях хранения в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C. Оценка готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, с точки зрения видимых посторонних материалов, оказалась более высокой, чем в Сравнительном примере 1.

[00127] Результаты определения качества готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, не имеют отличий по сравнению с готовым продуктом, полученным в Сравнительном примере 1.

[00128]

[Таблица 6] Долговременная стабильность готового продукта FVIII, полученного в Примерах 2-9 Пример Скорость восстановления активности FVIII (%) Видимый посторонний материал (включение) Результаты полного выявления согласно положениям Китайской фармакопеи о выявлении посторонних включений в готовом продукте Пример 1 117 Соответствует Соответствует Пример 3 104 Соответствует Соответствует Пример 4 111 Соответствует Соответствует Пример 5 111 Соответствует Соответствует Пример 6 98 Соответствует Соответствует Пример 7 97 Соответствует Соответствует Пример 8 111 Соответствует Соответствует Пример 9 114 Соответствует Соответствует Сравнительный пример 1 108 Не соответствует Соответствует

[00129] Результаты вышеуказанных тестов показали, что:

[00130] Промежуточные продукты FVIII, криоконсервированные способом по настоящему изобретению, имеют активность FVIII, сохраненную на прежнем уровне, и улучшенную удельную активность. В то же время, способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению может улучшить, в определенной степени, стабильность промежуточного продукта FVIII при комнатной температуре.

[00131] Промежуточный продукт препарата фактора VIII свертывания крови, криоконсервированный с помощью способа криоконсервации по настоящему изобретению, может быть применен для получения готового продукта FVIII надлежащего качества. Данные исследования стабильности подтверждают, что готовый продукт FVIII, полученный из криоконсервированного промежуточного продукта FVIII, может иметь стабильные характеристики в течение 48 месяцев после хранения в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C.

[00132] Приведенное выше описание представляет собой только предпочтительные примеры реализации настоящего изобретения. Основываясь на концепции настоящего изобретения, специалисты в данной области техники могут вносить различные изменения в конкретные варианты осуществления и область их применения. Данное описание не следует рассматривать как налагающее ограничения на настоящее изобретение.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови, технологическому процессу получения препарата фактора VIII свертывания крови, способу уменьшения осаждения примесей в продукте фактора VIII свертывания крови, способу улучшения долговременной стабильности продукта фактора VIII свертывания крови. Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови содержит: криоконсервацию, в качестве промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови, любого из концентрированного раствора фактора VIII свертывания крови или хроматографического элюента фактора VIII свертывания крови перед получением маточного раствора, или перед концентрированием путем ультрафильтрации, или после концентрирования путем ультрафильтрации в процессе получения препарата фактора VIII, и их комбинаций или вариантов, причем: скорость замораживания промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови находится в диапазоне от 1°С/мин до 10°С/мин, хранение промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови осуществляется в условиях температур от 15°C до 196°C, и раствор промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови имеет показатель рН от 6,5 до 7,2. Технологический процесс получения препарата фактора VIII свертывания крови, содержащий способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови. Способ уменьшения осаждения примесей в продукте фактора VIII свертывания крови, содержащий: криоконсервацию, в рамках технологического процесса получения продукта фактора VIII свертывания крови, промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови с помощью вышеописанного способа криоконсервации. Способ улучшения долговременной стабильности продукта фактора VIII свертывания крови, содержащий: криоконсервацию, в рамках технологического процесса получения продукта фактора VIII свертывания крови, промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови с помощью способа криоконсервации. Вышеописанная группа изобретений позволяет осуществлять криоконсервацию промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови с увеличенной долговременной стабильностью. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 9 пр.

1. Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови, содержащий:

криоконсервацию, в качестве промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови, любого из концентрированного раствора фактора VIII свертывания крови или хроматографического элюента фактора VIII свертывания крови перед получением маточного раствора, или перед концентрированием путем ультрафильтрации, или после концентрирования путем ультрафильтрации в процессе получения препарата фактора VIII, и их комбинаций или вариантов, причем:

скорость замораживания промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови находится в диапазоне от 1°С/мин до 10°С/мин,

хранение промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови осуществляется в условиях температур от 15°C до 196°C, и

раствор промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови имеет показатель рН от 6,5 до 7,2.

2. Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови по п. 1, в котором скорость замораживания находится в диапазоне от 1°C/мин до 3°C/мин;

предпочтительно, скорость замораживания находится в диапазоне от 1,5°C/мин до 3°C/мин.

3. Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови по п. 1, в котором промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют в условиях температур от –20°С до –80°С;

предпочтительно, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют в условиях температур от –20°С до –55°С;

предпочтительно, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют с помощью жидкого азота или сухого льда.

4. Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови по любому из пп. 1–3, в котором промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови имеет удельную активность в диапазоне от 60 МЕ/мг до 137 МЕ/мг.

5. Технологический процесс получения препарата фактора VIII свертывания крови, содержащий способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови по любому из пп. 1–4.

6. Способ уменьшения осаждения примесей в продукте фактора VIII свертывания крови, содержащий: криоконсервацию, в рамках технологического процесса получения продукта фактора VIII свертывания крови, промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови с помощью способа криоконсервации по любому из пп. 1–4.

7. Способ улучшения долговременной стабильности продукта фактора VIII свертывания крови, содержащий: криоконсервацию, в рамках технологического процесса получения продукта фактора VIII свертывания крови, промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови с помощью способа криоконсервации по любому из пп. 1–4.