ВАКЦИНА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА Российский патент 2002 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к лечению и профилактике онкозаболеваний. Для стимуляции противоопухолевою иммунитета предлагается иммунизировать организм вакциной, сделанной из ксеногенных опухолевых и неопухолевых клеток, экспрессирующих широкий спектр опухолеассоциированных антигенов (ОАГ).

Известно, что опухолевые клетки несут на своей поверхности иммуногенные детерминанты. Сам факт иммуногенности опухоли подразумевает возможность использования иммунотерапии как в лечении, так и в профилактике онкозаболеваний. Согласно современным представлениям [1-8], опухолеассоциированные антигены (ОАГ) подразделяются следующим образом:
1. Продукты, кодирующиеся генами, принадлежащими к семействам MAGE, BAGE, GAGE и RAGE. В норме эти гены экспрессируются лишь в органах, забарьерных для иммунной сиcтемы (MAGE, BAGE, GAGE в яичках, RAGE в сетчатке глаза).

2. Дифференцированные антигены (tirosinase, Melan-A/Mart-1, gp100, gp75, p15 и некоторые другие), а также белки теплового шока (gp96, hsp70). Несмотря на то, что эти антигены экспрессируются на нормальных клетках, они способны индуцировать в ряде случаев эффективный противоопухолевый иммунитет.

3. Продукты мутантных генов (р53, Ras, beta-catenin).

4. Онкопротеины, экспрессирующиеся в избытке на клетках опухоли (HER-2/neu).

5. Вирусные антигены. Вирус Эпштэйн-Барра может индуцировать иммунобластную лимфому. Экспрессия генов вируса папилломы (HPV) 16 обнаружена в клетках некоторых карцином.

6. Онкофетальные антигены (СЕА, alfa-fetoprotein).

7. Муцин и связанные с ним углеводородные структуры.

8. Ганглизиды.

Важное значение имеет то, что большинство (ОАГ) относятся к так называемым общим антигенам, которые могут экспрессироваться на опухолях разного гистологического типа. Такое антигенное сходство разных опухолей, по-видимому, является следствием вовлечении сходных внутриклеточных механизмов в процессы, лежащие в основе малигнизации разных типов клеток. Иллюстрацией к сказанному может являться таблица с опубликованными данными [1] по распределению экспрессии продуктов генов MAGE, BAGE, GAGE и RAGE среди опухолей разного гистогенеза.

Важно также заметить, что ОАГ в подавляющем своем большинстве являются консервативными молекулами. Следствием этого является высокая степень гомологии между ОАГ человека и животных, которая, в свою очередь, подразумевает возможность индукции опухолеспецифичных иммунных реакций в организме посредством иммунизации его ксеногенными ОАГ. В частности, показано, что иммунизация мышей C57BL6 человеческими гликопротеинами gp75 и gp100 может предотвращать развитие в их организме меланомы В 16, клетки которой экспрессируют соответствующие мышиные аналоги [9-12].

Однако, наличие на клетках опухоли ОАГ, само по себе, в большинстве случаев, недостаточно для развития устойчивого эффективного противоопухолевого иммунитета. Согласно опубликованным данным [13-15], низкая иммуногенность опухоли может обусловливаться:
1) отсутствием мембранной экспрессии продуктов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), способных комплексироваться с ОаАГ;
2) отсутствием мембранной экспрессии костимуляторных молекул (LFA3, CD40, CD54, CD80/86), необходимых для полномасштабной активации Т-лимфоцитов, распознающих ОаАГ в комплексе с продуктами ГКГ;
3) дефицитом в опухолевом микроокружении иммуностимулирующих цитокинов (прежде всего интерферона (ИФ)-гамма и интерлейкина (ИЛ)-2);
4) продукцией клетками опухоли иммуносупрессорных цитокинов таких, например, как трансформирующий ростовой фактор (ТРФ)-бета и ИЛ-10;
5) выработкой опухолью иммуносупрессорных ганглиозидов.

Цель специфической иммунотерапии - преодолеть барьеры, стоящие на пути развития эффективного противоопухолевого иммунного процесса посредством увеличения количества в организме сенсибилизированных Т-лимфоцитов, способных реагировать на ОАГ по вторичному типу. Как известно, в сравнении с нативными Т-клетками, эти лимфоциты имеют резко сниженный порог чувствительности к антигенному стимулу и в своей функциональной деятельности значительно менее зависимы от мембранной и цитокиновой костимуляции. Увеличение количества таких лимфоцитов в организме создает все предпосылки для полномасштабной Т-клеточной активации относительно низкоиммуногенными интактными опухолевыми клетками [13, 16, 17].

Согласно имеющимся данным, вакцинация опухолеассоциированными пептидами в принципе может приводить к формированию устойчивого противоопухолевого иммунитета [17] . Презентация пептидов Т-лимфоцитам в этим случае осуществляется дендритическими клетками и макрофагами, имеющими полный набор средств для запуска Т-клеточной активации. Важно, однако, заметить, что развитие иммунного ответа на одну или несколько опухолеассоциированных детерминант зачастую не приводит к замедлению развития опухолевого процесса, а лишь дает селективные преимущества для роста тем опухолевым клеткам, которые не экспрессируют эти детерминанты [17]. Иммунизация организма аутологичными или аллогенными опухолевыми клетками в этом отношении выглядит более предпочтительной, так как позволяет индуцировать иммунные реакции на широкий спектр ОАГ. Однако, как уже замечено выше, иммуногенность этих клеток в большинстве случаев является недостаточной для индукции эффективного противоопухолевого иммунитета. Поэтому, получили распространение подходы, направленные на генетическую модификацию иммунизирующих клеток, с целью увеличения их иммуногенности (внесение в клеточный геном генов, кодирующих иммуностимулирующие цитокины или мембранные костимуляторные молекулы). Указанные подходы, однако, трудно реализуемы в клинической практике, поскольку возможности модификации опухолевых клеток имеют не только технические, но и временные ограничения.

Целью заявляемого изобретения является разработка новой вакцины, способной эффективно стимулировать иммунные реакции, направленные против широкого спектра ОАГ, и обеспечивать формирование эффективного долговременного противоопухолевого иммунитета. Разработанная вакцина включает в себя три компонента, а именно:
1) клетки мышиной карциномы LLC (C57BL/6, H-2^b);
2) клетки мышиной меланомы В16 (C57BL/6, Н-2^b);
3) клетки свиного яичка.

Используемые в вакцине клетки были либо облучены (2000 R), либо разрушены посредством процедуры замораживания-оттаивания. Следует обратить особое внимание на наличие в составе вакцины неопухолевых клеток яичка. Как замечено выше, эти клетки экспрессируют гены семейств MAGE, BAGE, GAGE, кодирующих целый спектр яичковых антигенов, широко представленных на клетках опухолей разного гистогенеза (см. таблицу). Ранее показано, что развитие иммунного ответа, направленного на эти антигены, может приводить к элиминации опухолевых клеток из организма [18].

Человек и мышь (свинья) являются по отношению к друг другу дискордантными видами. Это означает, что в сыворотке крови человека в обязательном порядке присутствуют естественные антитела, способные вызвать острое отторжение трансплантированных ксеногенных клеток. Большая часть этих антител (составляющая примерно 1% сывороточных иммуноглобулинов) распознают на ксеногенных клетках альфа-галактозильный эпитоп (клетки человека не экспрессируют этот эпитоп из-за отсутствия в них фермента-альфа-1,3-галактозилтрансферазы). На основе имеющихся данных [19-21] можно полагать, что попадание ксеногенных клеток в организм человека включает работу следующего иммунного механизма.

1. Сывороточные антигалактозильные антитела и комплемент покрывают поверхность ксеногенных клеток и индуцируют процесс их разрушения.

2. Через взаимодействия с Fc-рецепторами и рецепторами к компонентам комплемента антигенный материал попадает в макрофаги и дендритические клетки.

3. Макрофаги и дендритические клетки презентируют антигенные детерминанты в комплексе с продуктами ГКГ II и I класса Т-хелперам (CD4⁺) и предшественникам цитолитических Т-лимфоцитов (CD8⁺), соответственно. Взаимодействие экспрессирующихся на антиген-презентирующих клетках костимуляторных молекул с соответствующими Т-клеточными мембранными лигандами, а также продуцируемые этими клетками иммуностимуляторные цитокины (ИЛ-12, фактор некроза опухоли (ФНО)-альфа, ИЛ-4 и др.) осуществляют эффективную костимуляцию антигенспецифических CD4⁺ Т-лимфоцитов.

4. Т-хелперы, активированные ОАГ и ксеноантигенами, посредством продукции цитокинов (ИФ-гамма, ИЛ-2 и ИЛ-15 и др.) стимулируют функциональную активность клеток, обладающих неспецифической противоопухолевой активностью (макрофаги, костномозговые цитостатические эффекторы, естественные цитотоксические и киллерные клетки). Активация этих клеток приводит к торможению опухолевого роста и ассоциируется с усилением экспрессии на клетках опухоли продуктов ГКГ.

5. Опухолеспецифические CD8⁺ цитолитические Т-лимфоциты, а также их предшественники, распознают экспрессированные на поверхности опухолевых клеток комплексы, состоящие из ОАГ и продуктов ГКГ I класса, и после контактной и цитокиновой костимуляции со стороны активированных Т-хелперов и профессиональных антиген-презентирующих клеток вступают в фазу активного роста.

6. Высокая активность Т-клеточных цитолитических клонов, направленная против широкого спектра ОАГ, приводит к элиминации опухоли из организма.

В рамках проводимого в Институте клинической иммунологии СО РАМН клинического испытания (протокол 6 от 6 октября 1998 г.) специфическая иммунная реактивность, направленная против меланомных ОАГ, была исследована у 28 пациентов с III и IV стадиями заболевания (меланома - 12; колоректальный рак - 4; рак пищевода - 1; рак молочной железы - 2; рак тела матки - 1; рак легкого - 3; рак яичника - 1; рак слюной железы - 1; глиома - 3), получивших индуцирующий и консолидирующий курсы вакцинотерапии. Исходный уровень функциональной активности пациентов по Карновскому был не менее 70%. Они не получали какого-либо системного лечения в течение, по крайней мере, 2 месяцев с момента начала проведения иммунотерапии. Одна вакцинирующая доза включала в себя 5-8 • 10⁷ разрушенных клеток; индуцирующий курс состоял из 4-5 внутрикожных/подкожных иммунизаций, выполненных с интервалами в 7-14 дней; последующий консолидирующий курс из 4-5 иммунизаций с интервалами в 15-30 дней. Проведенные исследования показали, что в результате проведенного лечения Т-клеточная реактивность на меланомные ОАГ (оцениваемая в кожных пробах, а также по реакциям ГЗТ и лимфобластной трансформации in vitro) значительно возросла у подавляющего большинства у 24 (85%) из 28 исследованных пациентов. В этой связи следует заметить, что, согласно существующим представлениям [1], повышенная Т-клеточная сенсибилизация к общим ОАГ является для онкопациента благоприятным прогностическим признаком.

Серьезных системных осложнений вакцинотерапии зарегистрировано не было. Кратковременные локальные реакции в виде покраснения места введения вакцины отмечены у большинства пациентов. В течение 24-48 ч после вакцинации у 50% пациентов наблюдалось умеренное повышение температуры (до 38^oС) и развитие гриппо-подобного состояния. Токсических проявлений II-IV степеней зафиксировано не было.

На чертеже представлены данные 1,5-летней по выживаемости многократно вакцинированных меланомных пациентов (15 человек, 11 женщин и 4 мужчин в возрасте от 24 до 69 лет) с IV стадией заболевания (9 с висцеральными и 14 с мягкоткаными метастазами) и контрольных пациентов, не получавших какого-либо системного лечения, либо подвергшихся химиотерапевтическому лечению (дакарбазин). Контрольные пациенты были сопоставимы с опытными пациентами по локализации и распространенности опухолевого процесса, полу, возрасту и по времени наблюдения.

Согласно данным, представленным на фиг.1, количество выживших пациентов в конце 1,5 летнего наблюдения в опытной группе составляло 9 человек (60%). Аналогичные показатели в контрольных группах не превысили 14% (2 и 1 человек). Различия между опытными и контрольными значениями были статистически значимы (Р=0,033 согласно критерию Гехана).

Преимущества ксеногенной клеточной вакцины перед аутологичными или аллогенными клеточными вакцинами заключаются в следующем:
1) она не требует использования бактериальных или цитокиновых адъювантов;
2) вовлекает в формирование противоопухолевых клеточных реакций естественный (пресуществующий) иммунитет и
3) решает проблему эффективной (иммуногенной) презентации ОАГ Т-лимфоцитам.

Источники информации
1. Van den Eynde B.J., Gaugler В., Brandle D. et al. // Symposium in Immunology VI, Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997.- P.1-11.

2. Srivastava P.К.// Symposium in Immunology VI, Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.159-168.

3. Yee С. , Riddell S.R., Greenberg Ph.D.// Current Opinion in Immunology. - 1997. - Vol.9. - 702-708.

4. Miles D.// Cancer Treatment Reviews.- 1997.- Vol.23.- P.S77-S85.

5. Disis M.L., Cheever M.A.// Current Opinion in Immunology. - 1996. - Vol.8. - 637-642.

6. Rosenberg S.A. // Immunol. Today.- 1997.- Vol.18.- P.175-182.

7. Melief C.J.M., Offringa R., Toes R.E.M., Kast W.M.// Current Opinion in Immunology. - 1996.- Vol.8.- 651-657.

8. Takahashi К. , Ono К., Hirabayashi., et al. // J. Immunol. -1988.- Vol. 140. - P.3244-3249.

9. Naftzger C. , Takechi Y., Kohda H., et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. Vol.10; - 93. - P.14809-14814.

10. Weber L. W., Uowne W.B., Wolchok J.D., et al.// J. Clin. Invest. - 1998. - Vol.102. - P.1258-1264.

11. Bowne W. B. , Srinivasan R., Wolchok J.D., et al. // J. Exp. Med.- 1999.- Vol.190. - P.1717-1722.

12. Hawkins W.G., Gold J.S., Dyall R., et al. // Surgery.- 2000.- Vol. 128. - P.273-280.

13. Chen L. //Immunol. Today.- 1998.- Vol.19.- P.27-30.

14. Meuer S., Rudy W., Habicht A. et al. // Symposium in Immunology VI, Springer-Verlag, Heidelberg. -1997.- P.77-88.

15. Hoon D.S.B., Irie R.F., Cochran A.J. // Cell. Immunol. -1988. - Vol. 111: Р.1-10.

16. Arienti F. , Sule-Suso J., Belli F. et al.// Human Gene Therapy, - 1996. - Vol.7. - P.1955-1963.

17. Knuth A., Jager E. // Symposium in Immunology VI, Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.125-135.

18. Thumer В., Haendle I., Roder C., et al.// J. Exp. Med.-1999.- Vol.- 190.- P.1669-1678.

19. Mosman T.R., Sad S. // Immunol. Today. - 1996.- Vol.17.- P.138-146.

20. Galili U., La Temple C. // Immunol. Today.- 1997.- Vol.18.- P.138-146.

21. Селедцов В.И. // Цитостатическая активность клеток костного мозга и клеточные механизмы ее регуляции: дис.... докт.мед.наук.- Новосибирск, ИКИ СО РАМН. - 1997. - 175 с.

Изобретение относится к медицине и касается вакцины для стимуляции противоопухолевого иммунитета. Сущность изобретения: вакцина составлена из ксеногенных опухолевых клеток (карциномных и меланомных клеток мыши), а также ксеногенных неопухолевых клеток (клеток свиного яичка), способных эффективно стимулировать противоопухолевые иммунные реакции человека. При попадании в организм ксеногенные клетки подвергаются острому, опосредуемому естественными антителами отторжению, которое сопровождается активным вовлечением профессиональных антиген-презентирующих (дендритических и макрофагальных) клеток в противоопухолевые иммунные процессы. Преимущество изобретения заключается в повышении противоопухолевого иммунитета. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета, отличающаяся тем, что представлена ксеногенными (по отношению к человеку) клетками, способными индуцировать иммунные реакции, направленные против широкого спектра опухолеассоциированных антигенов. 2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что включает в себя мышиные меланомные и карциномные клетки, а также клетки свиного яичка.