ЖИВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА ТЕЛЯТ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/108 C12N1/00 A61P31/04 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения живых вакцин против колибактериоза сельскохозяйственных животных, в частности телят.

Колибактериоз (эшерихиоз) - инфекционная болезнь, вызываемая энтеропатогенными эшерихиями, широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству за счет высокой смертности телят и поросят.

Известна вакцина против колибактериоза сельскохозяйственных животных (см. патент РФ №2053792 по кл. А 61 К 39/108, опубл. 10.02.96 г.), содержащая инактивированные формалином адгезивные антигены К99, К88ав, К88ас, К88ад, F41, Атт25, 987Р, конъюгат термолабильного и термостабильного энтеротоксинов эшерихий и адъювант в виде раствора гидроокиси алюминия.

Однако инактивированные вакцины, наряду с положительным действием, в ряде случаев могут вызывать аллергические реакции из-за добавления к ним адъювантов, а также нарушать естественные процессы пищеварения за счет изменения количественного и качественного состава микрофлоры. Кроме того, изготовление инактивированных вакцин требует значительных трудозатрат.

Известна также живая вакцина против колибактериоза телят (см. Чулков Н.В. Совершенствование специфической профилактики колибактериоза телят с использованием бивалентных вакцин и гипериммунной сыворотки, изготовленных на основе аттенуированных адгезивных штаммов Е.coli/ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. Новосибирск: ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН - 2004), содержащая суспензию клеток из штаммов E.coli К-18 и E.coli K-20, взятых в соотношении 1:1 с содержанием микробных клеток 1,5·10⁹ в 1 см³ физиологического раствора.

Однако данная вакцина предназначена для подкожного применения. Кроме этого, она требует значительных трудозатрат в изготовлении и применении, так как предусматривает использование двух штаммов E.coli и двукратное введение животным. Механизм действия направлен на активизацию гуморального иммунитета, что свидетельствует о развитии инфекционного процесса у вакцинированных животных, а не о защите их от заболевания.

Наиболее близкой к заявляемой является живая вакцина против колибактериоза телят (см. патент СССР №1692020 по кл. А 61 К 35/74, опубл. 30.05.94 г.), содержащая суспензию клеток в физиологическом растворе или прокипяченной воде штамма E.coli ГИСК 186 в дозе 2·10¹⁰-1·10¹¹ клеток, которую вводят за 30 минут до первой выпойки молозива.

Однако данное средство предназначено для перорального применения. Кроме этого, введение данного средства до приема молозива может отрицательно повлиять на естественный биоценоз кишечника, вызывая дисбактериоз.

Изобретение направлено на решение задачи создания живой авирулентной вакцины против колибактериоза телят для внутримышечного введения, простой в изготовлении и применении.

Для решения поставленной задачи живая вакцина против колибактериоза телят, представляющая собой суспензию, содержащую физиологический раствор и антиген из штамма E.coli в виде бактериальной массы колониеобразующих микробных клеток, согласно изобретению, содержит в качестве антигена антиген из штамма Е. coli "Б-5" с содержанием 1,0×10¹⁰-1,2×10¹¹ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической документации не описано живых авирулентных вакцин против колибактериоза телят для внутримышечного введения, обладающих высокоиммуногеннымии свойствами, простых в изготовлении и применении. Механизм действия заявляемого средства направлен на активизацию фагоцитарного звена иммунитета, приводящую к завершенному фагоцитозу и защите организма животных от заболевания.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии изобретательского уровня в данном изобретении.

Штамм, предназначенный для изготовления вакцины, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) (Справка о депонировании прилагается). Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культуральные и морфологические признаки.

Культивирование осуществляют вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37°С в течение от 18 до 48 часов при аэробных условиях. При этом на МПБ колонии растут диффузно, образуя интенсивную муть и легко разбивающийся осадок, на МПА вначале образуются гладкие, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии S-формы. В последующем возможно образование переходных от S- к R-форме колоний и суховатых с неровными краями R-форм колоний (до 50%). На агаре Эндо формируются темно-красные с металлическим блеском колонии.

Ферментативные свойства

Микроорганизм обладает подвижностью, проявляет каталазную активность, дает положительную реакцию с метилротом, продуцирует индол, ферментирует глюкозу с газообразованием, а также лактозу, арабинозу, маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит.

Условия и состав сред для токсинообразования: бульон Хоттингера.

Антигенные свойства

Продукт, синтезируемый штаммом Escherichia coli Б-5 - термолабильный экзотоксин, не подверженный нейтрализации поливалентной антитоксической сывороткой против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных

Молекулярно-генетическая особенность штамма - треки штамма как в S-, так и в R-формах имеют репликон размером около 0,3 кв, в данном репликоне имеется ген, кодирующий В-субъединицу термолабильного токсина (ЛТ), обуславливающий иммуногенную активность штамма. Структурные гены ЛТ дополнительно интегрированы и в хромосому микробной клетки. В клетках штамма имеется репликон, несущий генетическую информацию регуляторного свойства, необходимую для синтеза ЛТ-продукции. У штамма имеется в наличии иммуногенный эпитоп, но отсутствует репликон, ответственный за реактогенность эшерихий.

Чувствительность к антибиотикам (зона задержки роста в мм): полимиксин - 11, стрептомицин - 25, левомицетин - 25, рифампицин - 9, карбенициллин - 15; не чувствителен к оксациллину, доксициклину, линкомицину, тетрациклину, олеандомицину, ампициллину, пенициллину.

Вирулентные свойства

Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации 5·10⁸ м.к./см³ и объеме 0,5 мл гибели белых мышей не вызывает. LD₅₀ - 1,2·10¹⁰ м.к./см³. Гибель белых мышей наступает в течение суток.

Определение энтеротоксигенных свойств штамма.

Для определения токсинообразования культивирование штамма проводили в питательном составе Mundeli в течение 20 часов. Полученную бульонную культуру разделяли на токсиносодержащий материал и бакмассу методом стерилизующей фильтрации. Культуральная жидкость, лишенная бактериального компонента, служила материалом, содержащим экзотоксин Е.coli.

Устойчивость к температуре определяли прогреванием токсиносодержащего материала в течение 10-минутного кипячения при 100°С и последующим его введением белым мышам.

Определение ТЛ-токсина проводили с использованием прогретого токсиносодержащего материала, не прогретого и питательной среды Mundeli - в качестве отрицательного контроля.

Культивирование штамма можно осуществлять, например, на разработанной и запатентованной Саратовской НИВС (патент №2142505) питательной среде следующего состава (мас.%): аминокровин 5-20; пептон 0,6-1,5; хлористый аммоний 0,08-0,18; хлористый натрий 0,09-0,11; гидролизат казеина 9-20; питательная среда "ИГЛА" 52-61; дистиллированная вода - остальное. На данной среде культивирование осуществляют в течение 7 суток при температуре 37°С, затем суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочная жидкость являлась энтеротоксигенным материалом.

Пример 1.

Способ изготовления живой вакцины против колибактериоза телят заключается в следующем.

Осуществляют культивирование штамма. Для этого штамм Е.coli "Б-5" засевают в пробирки вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37°С в течение 18 часов при аэробных условиях.

Полученную бактериальную массу смывают физиологическим раствором и получают суспензию с содержанием микробных клеток 1,0×10¹⁰-1,2×10¹⁰ в 1 см³ раствора.

Суспензия предназначена только для введения телятам.

Пример 2.

Для оценки напряженности иммунитета использовали две группы белых мышей. Первую группу мышей (10 голов) подвергли однократной иммунизации культурой штамма E.coli Б-5, вторая группа мышей (10 голов), которым вводили физиологический раствор в тех же дозах, была контрольной. Через 14 дней обе группы животных заразили внутрибрюшинно вирулентной культурой эшерихий с концентрацией 5×10⁸ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора в дозе 0,5 мл. Результаты исследований представлены в таблице 1, из которой следует, что сохранность иммунизированных животных составляет 100%, в контрольной группе все животные погибли.

Таблица 1Группы белых мышейКол-во головПало, головВыжило, головИммунизированные10010Контрольные10100

Пример 3. Для доказательства авирулентности вакцины ее вводили мышам в концентрации 5×10⁸ микробных тел. Гибели мышей не наступало.

Пример 4.

Производилась отработка дозы вакцины для телят. Для этого двум телятам вакцину вводили внутримышечно в дозе 1 мл, другим двум телятам - в дозе 2 мл, т.е. с содержанием микробных клеток 2,0×10¹⁰-2,4×10¹⁰ в 1 см³ раствора и еще двум телятам - в дозе 2,5 мл (2,5×10¹⁰-3,0×10¹⁰ в 1 см³ раствора). В результате проведенных экспериментов была подобрана оптимальная доза - 2,5 мл, которая обеспечивала наиболее эффективную защиту животных и их сохранность - 100%. На месте введения вакцины у животных воспалительных реакций не регистрировалось.

Из 5 телят контрольной группы, которым вводили в той же дозе физиологический раствор, к 20 дню пало 2 теленка.

Результат исследований представлен в таблице 2.

Таблица 2№ п/пДоза вакциныКол-во животных в группеК 10-дневному возрастуПало к 20-дневному возрастуКлинически здоровыеБольныеголов%голов%голов%11 мл200,02100,000,022 мл200,02100,000,032,5 мл22100,000,0о0,0КонтрольФиз. раствор5240,0120,0240,0

Пример 5.

Проводились исследования по применению колибактериозной вакцины на здоровых и больных телятах. Вакцину вводили внутримышечно однократно в дозе 2,5 мл на голову. В контрольных группах здоровым животным вводили физиологический раствор, а больных телят лечили с использованием антибиотиков.

Исследования подтвердили высокую эффективность предлагаемой колибактериозной вакцины.

Результат исследований представлен в таблицах 3 и 4.

Таблица 3.
Результат применения колибактериозной вакцины на здоровых телятахНаименование групп животныхКоличество телят в группеК 10-дневному возрастуПало к 20-дневному возрастуКлинически здоровыеБольныеголов%голов%голов%Опытная767294,722,622,6Контрольная10440,0220,0440,0

Таблица 4.
Результат применения колибактериозной вакцины на больных телятахНаименование групп животныхКоличество телят в группеК 20-дневному возрастуВыздоровелоПалоголов%голов%Опытная7685,7114,3Контрольная14750,0750,0

Производственные испытания данной вакцины проводились на 203 клинически здоровых и больных телятах в хозяйствах шести районов Саратовской области.

Вакцину вводили телятам в возрасте 2-9 дней внутримышечно однократно в дозе 2,5×10¹⁰-3,0×10¹⁰ м.к. на голову. В контрольной группе животных (в количестве 156 голов) использовали общепринятые в хозяйствах методы профилактики колибактериоза. В результате проведенных исследований к 20 дню из опытных групп пало 6 (3%), а из контрольных групп - 33 (21,2%) животных. Применение вакцины позволило снизить падеж телят в 7 раз.

Таким образом, заявляемая вакцина авирулентна, не реактогенна, не обладает аллергогенностью, не вызывает воспалительных реакций на месте введения и обеспечивает иммунную защиту телят от колибактериоза.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Изобретение направлено на решение задачи создания живой авирулентной вакцины против колибактериоза телят для внутримышечного введения, простой в изготовлении и применении. Вакцина представляет собой суспензию и содержит в качестве антигена антиген из штамма Е.coli «Б-5» с содержанием 1,0×10¹⁰-1,2×10¹⁰ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора. Вакцина авирулентна, не реактогенна, безвредна. 4 табл.

Живая вакцина против колибактериоза телят, содержащая физиологический раствор и антиген из штамма E.coli в виде бактериальной массы колониеобразующих микробных клеток, отличающаяся тем, что она содержит в качестве антигена антиген из штамма E.coli "Б-5" с содержанием 1,0·10¹⁰-1,2·10¹⁰ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора.