ВАКЦИНА ПРОТИВ КАНДИДОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/00 C12N1/14 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения вакцин для профилактики кандидоза сельскохозяйственных животных.

Кандидоз (кандидамикоз, молочница) - инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных, преимущественно молодняка двухмесячного возраста, вызываемое патогенными грибами из рода Candida, характеризующееся поражением слизистых оболочек (преимущественно пищеварительного тракта) в виде появления на них рыхлых или уплотненных наложений. Поражения локализуются у телят и ягнят в ротовой полости, пищеводе, преджелудках, у поросят - в желудке, кишечнике и реже в других органах. Болеют также птицы всех видов и люди.

Известна вакцина против кандидоза, включающая убитую культуру Candida albicans (см. заявка РФ 97105400 по кл. МПК А 61 К 39/116, опубл. 10.04.99г. ). Вакцина предназначена для предотвращения вагинальных инфекций и предназначена для введения в пищеварительный тракт. Вакцину получают путем смешивания убитого микроорганизма с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем, разбавителем и/или другим вспомогательным веществом. Вакцина не содержит адьюванта.

Однако данная вакцина готовится из микроорганизмов, выделенных непосредственно от больных и применяется на них же. Такая вакцина не обладает стабильными антигенными свойствами и не может быть постоянно в наличии в лечебном учреждении. Кроме того, вакцина может быть использована только в гинекологической практике, а отсутствие в состваве адьюванта снижает ее потенциальную иммуногенность.

Известна также вакцина против кандидоза (см. заявка РФ 98104502 по кл. МПК А 61 К 39/00, опубл. 20.02.2000г.), содержащая растворимый антиген из штамма Candida albicans HKM 9656, депонированный в "Немецкой коллекции".

Однако для выделения антигенов данной вакцины необходимо использование агрессивных химических веществ: щелочи (едкого калия или едкого натра), органической или минеральной кислоты, которые существенно снижают иммуногенность растворимых антигенов штамма C.albicans. Кроме того, способ получения вакцины трудоемок и предусматривает дополнительный этап - концентрированно осаждением с помощью сульфата аммония и, как следствие, проведение в последующем диализа.

Наиболее близкой к заявляемой является вакцина (см. Effectiveness of a vaccine composed of heat-killed Candida albicans and a novel mucosal adjuvant, LT (R192G), against systemic candidiasis./Cardenas-Freytag L; Cheng E; Mayeux P; Domer JE; Clements JD// Infect. Immun. 1999 Feb. 67(2):826-33), содержащая термоубитый антиген и адьювант. При этом в качестве антигена используют цитоплазматическую фракцию гриба из штамма С. albicans, а в качестве адьюванта - детоксинированную форму термолабильного энтеротоксина E. coli.

Недостатком такой вакцины является ее низкая иммуногенность. Напряженность иммунитета колеблется в пределах 1•10⁴-1•10⁵ спор/мл при контрольном внутривенном заражении возбудителем кандидоза. Кроме того, использование в качестве адьюванта термолабильного энтеротоксина, являющегося прежде всего антигеном E.coli, вызывает вынужденное образование в организме животных дополнительно и антител к возбудителю колибактериоза. Данное обстоятельство отрицательно влияет на органы и системы иммунитета.

Недостатком вакцины является и то, что образование специфических противокандидозных антител происходит только после искусственного заражения, а не после профилактической иммунизации данной вакциной.

Изобретение направлено на решение задачи создания эффективной и безопасной вакцины против кандидоза сельскохозяйственных животных, обладающей высокоиммуногенными и низкоаллергенными свойствами.

Для решения поставленной задачи вакцина против кандидоза животных, содержащая растворимый антиген из штамма гриба Candida albicans, представляющий собой цитоплазматическую фракцию гриба, и адьювант, содержит в качестве растворимого антигена антиген из штамма Candida albicans 253 с активностью спор 4,5•10⁸-5,5•10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-10% при следующем соотношении компонентов (мас.%):
Адьювант - 9-10
Антиген из штамма Candida albicans 253 - Остальное
В известных авторам источниках патентной и научно-технической литературы не описано эффективной и безопасной вакцины против кандидоза сельскохозяйственных животных, содержащей в качестве растворимого антигена антиген из штамма Candida albicans 253, представляющий собой цитоплазматическую фракцию гриба с активностью спор 4,5•10⁸ - 5,5•10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6 - 10%. Подобранные экспериментальным путем соотношения компонентов вакцины обеспечивают ее высокоиммуногенные и низкоаллергенные свойства.

Штамм Candida albicans 253, предназначенный для изготовления вакцины, характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. Овальные (2:1) или почти круглые клетки с хорошо заметными вакуолями с небольшими ядрами.

Культуральные признаки. На агаре Сабуро через 48 часов культивирования при температуре 28^oС образуются выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. На 5 сутки культивирования поверхность колонии гладкая, матовая, с кремовым оттенком, края слегка волнистые.

При культивировании на жидких питательных средах через 48 часов при 28^oС заметно помутнение бульона и образование компактного осадка.

Ферментативные свойства. Ферментативная активность проявляется на полужидкой среде Гисса: с глюкозой - образованием кислоты и газа; с мальтозой - также кислоты и газа; с сахарозой - только кислоты; с лактозой активность не проявляется.

Активность штамма - начало спорообразования на 2 сутки культивирования. К шестым суткам культивирования количество хламидоспор на питательном агаре, описанном в патенте РФ 2111245 и содержащем (мас.%): глюкозу 4-5; пептон 0,95-1,05; агар 3,5-3,6; сыворотку крови крупного рогатого скота 9-11; солевой раствор Хенкса - остальное, составляет 9•10⁸ спор/см³.

Антигенные свойства. Антигены штамма - комплекс специфических белков, полисахаридов и липидов.

Для получения антигенов штамма Candida albicans 253, представляющих собой цитоплазматическую фракцию гриба, используют метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвуковой дезинтеграции аппаратами типа У. Ф. А. - 11 (Польша), "Solana" (Еrlan industries) или малогабаритным лабораторным дезинтегратором (МЛ-1) производства НПО "Биоприбор" АН СССР.

Для этого из авирулентного штамма Candida albicans ^o253 через определенные промежутки культивирования отбирают пробы. Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 90 с, получая таким образом цитоплазматическую фракцию.

Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану "Владипор" МФА - МА 3.

Отбор иммуногенной стадии антигенов проводят с использованием реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ) по способу, описанному в патенте РФ 2176392, в соответствии с которым антигены смешивают с комплементом морской свинки, добавляют стабилизированную кровь кролика, смесь инкубируют, готовят мазки, подсчитывают фиксированное количество лейкоцитов и отмечают число агломерированных клеток белой крови. По величине индекса агломерации оценивают пригодность полученных антигенов для создания вакцины. Экспериментальным путем была подобрана величина индекса агломерации лейкоцитов, при которой антиген считается иммуногенным. Для антигена штамма Candida albicans 253 в виде цитоплазматической фракции величина индекса агломерации составляет 6-10%.

К выявленным вышеописанным методом растворимым антигенам с индексом агломерации лейкоцитов 6-10% добавляют для обезвреживания и повышения иммуногенных свойств формалин 0,3-0,4%-ной концентрации. После чего в полученный комплекс добавляют для повышения синтеза антител и замедления всасывания антигенов адьювант (например, 6%-ный раствор гидроокиси алюминия, неполный масляный адьвант Фрейнда, сапонин) в соотношении 10:1.

Антигенный комплекс помещают в термостат и инкубируют при температуре 37^oС в течение 21 суток.

Проверку вакцины на стерильность и безвредность проводят общепринятыми методами, а оценку иммуногенных свойств - на лабораторных животных.

Пример 1. Способ изготовления вакцины против кандидоза сельскохозяйственных животных заключается в следующем.

1. Выделяют из штамма Candida albicans 253 культуру клеток микроорганизма с активностью спор 4,5•10⁸-5,5•10⁸ в 1 см³.

Для этого штамм Candida albicans 253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28^oС в течение 3 суток. Количество пробирок зависит от объема питательной среды, в которую в дальнейшем будет внесен посевной материал штамма из расчета 1 пробирка на 1 матрас. Выросшую культуру смывают стерильным физиологическим раствором, высевают в бактериологические матрасы с питательным агаром, приготовленным с использованием солевого раствора Хенкса по патенту РФ 2111245, описанному выше. Проводят культивирование в термостате при 28^oС в течение 6 суток. Полученную культуру смывают стерильной дистиллированной водой из расчета 25 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию хламидоспор методом подсчета в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства. Урожай спор обычно колеблется в пределах от 8•10⁸ до 1•10⁹ спор/см. Концентрацию спор доводят до 4,5•10⁸ - 5,5•10⁸ микробных тел в 1 см³ дистиллированной водой.

2. Выделяют цитоплазматическую фракцию полученной суспензии клеток, используя метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора "Solana" (Erlan industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют в течение 60 мин. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану "Владипор" МФА - МА 3 при помощи вакуум-насоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов.

3. Производят оценку полученных растворимых антигенов на иммуногенность и выявляют антигены с индексом агломерации лейкоцитов 6-10%.

Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл полученной смеси и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 мин при 37^oС, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном с изотоническим раствором хлорида натрия вместо комплемента и стабилизированной кровью кролика. Другим контролем служили пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37^oС в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают и затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 мин. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 мин.

Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных не менее 3-х). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 10% от общего числа лейкоцитов -100 антигены считаются наиболее иммуногенными и соответственно пригодными для конструирования вакцины против кандидоза.

4. К растворимым антигенам с индексом агломерации лейкоцитов 6 -10% добавляют формалин 0,3-0,4%-ной концентрации.

5. В полученный комплекс добавляют адьювант - 6%-ный раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10:1.

6. Комплекс антиген - адьювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 37^oС в течение 21 суток.

Пример 2. Оценка иммуногенных свойств вакцины.

Вакцину вводят внутримышечно в дозе: мышам - по 0,5 мл, морским свинкам - по 3 мл и кроликам - по 5 мл. Вакцину вводят двукратно с 7 - 10 дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.

Оценку напряженности иммунитета проводят с использованием внутривенного для кроликов и мышей и внутрисердечного для свинок способов заражения. Для заражения используют хламидоспоры трехсуточной вирулентной культуры С. albicans с концентрацией 3-10⁹ спор в 1 см³ и объеме: мышам - по 0,5 мл, морским свинкам и кроликам - по 1 мл. Результаты представлены в табл. 1.

Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП) и иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства НПО "Аквапаст" (г. Санкт-Петербург). Кровь для исследований берут от иммунизированных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Результаты представлены в табл. 2.

Вакцина была испытана на крупном рогатом скоте и свиньях.

С целью получения противокандидозного иммунитета вакцину вводят дважды с интервалом 7-10 дней внутримышечно телятам в дозе 5 мл на одно введение с двухмесячного возраста, а поросятам - в дозе 3 мл с месячного возраста.

У двукратно иммунизированных животных через 14 и 90 дней после вакцинации брали пробы крови. В полученных сыворотках крови определяли титры антител к кандидозным антигенам в ИФТС, которые были не ниже, чем у иммунизированных лабораторных животных.

Вакцина опробирована в условиях хозяйств, неблагополучных по кандидозу телят и поросят. У животных до применения вакцинации отмечали клинические и патологоанатомические признаки заболевания. Лабораторными исследованиями диагноз на кандидоз был подтвержден выделением возбудителя. После проведения иммунизации клинические признаки заболевания у вакцинированных животных не регистрировались.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Изобретение направлено на решение задачи создания эффективной и безопасной вакцины против кандидоза сельскохозяйственных животных, обладающей высокоиммуногенными и низкоаллергенными свойствами. Вакцина содержит в качестве растворимого антигена антиген из штамма Candida albicans 253 с активностью спор 4,5•10⁸ - 5,5•10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-10% и адьювант при следующем соотношении компонентов, мас.%: адьювант 9-10, антиген из штамма Candida albicans 253 - остальное. Вакцина высокоиммуногенна и низкоаллергенна. 2 табл.

Вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных, содержащая растворимый антиген из штамма Candida albicans, представляющий собой цитоплазматическую фракцию гриба и адьювант, отличающаяся тем, что она содержит в качестве растворимого антигена - антиген из штамма Candida albicans №253 с активностью спор 4,5·10⁸ - 5,5·10⁸ в 1 см³ и индексом агломерации лейкоцитов 6-10% при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Адьювант 9-10

Антиген из штамма

Candida albicans № 253 Остальное