СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КОЛИБАКТЕРИОЗА ЦЫПЛЯТ Российский патент 2013 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к птицеводству, и может быть использовано для профилактики колибактериоза цыплят раннего возраста (до 10 дней).

Колибактериоз - энзоотическая септическая болезнь различных видов домашних птиц (преимущественно кур), вызываемая патогенными типами кишечной палочки различных серологических групп. Болезнь наносит существенный экономический ущерб птицевоству. Особенно велика гибель цыплят от колибактериоза в возрасте 1-5 дней.

Наиболее эффективным способом борьбы с колибактериозом является вакцинация. Известно применение инактивированных вакцин для профилактики колибактериоза кур.

В частности, известен способ профилактики колибактериоза цыплят в возрасте 28-32 дня (см. патент РФ №2344832 по кл. МПК А61К 39/108, опуб. 27.01.2009), заключающийся во внутримышечном введении в дозе 0,5 мл на голову вакцины, содержащей суспензию инактивированных бактерий E.coli штамма №389 (078), аминоэтиленимин и липосомообразующую смесь, содержащую фосфолипиды, сахара, наполнители и водорастворимые полимеры.

Однако применение данной вакцины на цыплятах в возрасте 4-5 дней невозможно в силу высокой концентрации клеток штамма (жидкая вакцина содержит в 1 мл 1,5×10¹⁰ клеток Escherichia coli штамма №389(078), что может привести к неоправданной гибели птицы.

Известен также способ профилактики колибактериоза (см. свидетельство на полезную модель №12969 по кл. МПК7 А61К 39/00, опуб. 20.03.2000), заключающийся во введении методом выпаивания из расчета 10 мл на голову вакцинного препарата, состоящего из растворителя и суспендированного антигена, помещенного в липосомальную везикулу, которая в свою очередь помещена с оболочку из смеси сахаров и водорастворимых полимерных материалов.

Основным недостатком препарата является его инактивированная форма, поскольку использование инактивированных вакцин приводит к созданию менее напряженного и непродолжительного иммунитета по сравнению с живыми вакцинами.

При этом основным преимуществом живых вакцин является удобство их применения (распылением, спаиванием питьевой воды, аэрозолированием).

Наиболее близким к заявляемому является способ профилактики колибактериоза кур с использованием живой вакцины (см. патент РФ №2404803 по кл. МПК А61К 39/108, опуб. 27.11.2010), заключающийся в пероральном введении цыплятам трехнедельного возраста препарата, содержащего физиологический раствор и антиген из штамма Escherichia coli «Б-5» с содержанием микробных клеток 1,0×10⁶-2×10⁶ в 1 см³ физиологического раствора. Препарат вводят из расчет 0,5 мл на голову.

Однако способ предназначен лишь для профилактики колибактериоза цыплят, начиная с 22-дневного возраста и старше, и в данной концентрации он неприменим для цыплят в возрасте 3-5 дней.

Изобретение направлено на решение задачи создания простого, недорогого и эффективного способа профилактики колибактериоза цыплят раннего возраста (1-5 дней) с использованием живой вакцины, обладающей высокоиммуногенными и протективными свойствами за счет изменения свойств штамма E.coli Б-5 и активизации ферментативной активности организма цыплят.

Для решения поставленной задачи в способе профилактики колибактериоза цыплят, заключающемся в пероральном введении вакцинного препарата на основе антигена из штамма Е. coli «Б-5», согласно изобретению в качестве вакцины используют вакцинный препарат с содержанием 1,0×10⁵-3×10⁵ микробных клеток штамма Е. coli «Б-5»в 1 см³ физиологического раствора, который вводят методом выпаивания при соотношении препарата к воде 1:(15-25), при этом используют штамм Е. coli «Б-5», выращенный при 42°С.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано дешевого, эффективного и простого в применении способа профилактики колибактериоза цыплят раннего возраста (преимущественно в возрасте 3-5 дней) за счет использования живой вакцины, содержащей антиген в виде бактериальной массы штамма Е. coli «Б-5» с содержанием 1,0×10-3×10 микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора и изменения условий выращивания штамма Е. coli «Б-5» (при температуре 42°С вместо общепринятых 37°С) и, как следствие, изменения его свойств.

Известно, что у цыплят раннего возраста нормальная температура тела составляет 41-42°С. Именно данный штамм, в отличие от общеизвестных, выращенный при данной температуре, позволяет осуществить защиту цыплят до 10-дневного возраста от колибактериоза.

Все существующие вакцины и способы их применения для защиты цыплят от колибактериоза, включая и прототип к данной заявке, предназначены для применения на цыплятах более позднего возраста (старше 10 дней). Живых вакцин и способов их применения на цыплятах раннего возраста не выявлено, что позволяет сделать вывод о наличии новизны в заявляемом способе.

Использование новых условий выращивания штамма Е. coli «Б-5» и экспериментальным путем подобранная концентрация микробных клеток антигена вакцины приводят в комплексе к изменению ферментативной активности организма цыплят, а именно - аспартатаминотрансферазы (ACT), которое, как следствие, обеспечивает повышение иммунного статуса цыплят раннего возраста (до 10 дней). Сказанное позволяет сделать вывод о наличии изобретательского уровня.

Штамм Е. coli «Б-5», предназначенный для изготовления вакцины, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) (Справка о депонировании №1807/15 от 10.10.2002). Штамм выделен из селезенки павшего поросенка 10-дневного возраста. Продукт, синтезируемый штаммом Escherichia coli Б-5 - термолабильный экзотоксин.

Способ осуществляется следующим образом.

Осуществляют культивирование штамма. Для этого штамм Е. coli «Б-5» засевают в пробирки вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 42°С в течение 18 часов при аэробных условиях.

Полученную бактериальную массу смывают физиологическим раствором и получают суспензию с содержанием микробных клеток 1,0×10⁵-3×10⁵ в 1 см³ физиологического раствора.

Препарат используют в дозе 0,5 см³ на одного цыпленка.

Данное содержание микробных клеток в суспензии было подобрано экспериментальным путем. Содержание микробных клеток в 1 см³ меньше 1,0×10⁵ (т.е менее 50000 единиц в 0,5 см³) снижает эффективность вакцины, не приводя к защитным свойствам организма цыплят. Содержание микробных клеток более 3×10⁵ в 1 см³ физиологического раствора (т.е. более 150000 единиц в 0,5 см³ раствора) делает вакцину более токсичной и негативно влияет на привесы.

Вакцину вводят методом выпаивания цыплятам 3-5 дневного возраста при разведении ее водой в соотношении 1:20.

Пример 1

Обоснование доз вакцинного препарата.

В эксперименте использовали 48 голов цыплят яйценоского кросса Super Nick в возрасте 4 суток. Исходная масса цыплят составляла в среднем 47,5 г, средняя масса цыплят при иммунизации - 92,5 г.

Сформировали 3 опытных группы и 1 контрольную - по 12 голов в каждой.

Цыплятам первой опытной группы препарат вводили методом выпаивания в разведении водой в соотношении препарата к воде 1:20 из расчета 50000 единиц живых микробных клеток штамма Е. coli «Б-5» в 0,5 см физиологического раствора.

Цыплятам второй группы препарат вводили аналогичным образом, но с содержанием 150000 единиц живых микробных клеток штамма Е. coli «Б-5» в 0,5 см³ физиологического раствора.

Цыплятам третьей группы - с содержанием 500000 единиц живых микробных клеток штамма Е. coli «Б-5» в 0,5 см³ физиологического раствора.

Цыплят контрольной группы выпаивали только стерильной дистиллированной водой.

В возрасте 10 дней птицу заражали перорально культурой Escherichia coli №379 (078). При определении LD50 на белых мышах было установлено, что она составляет 5·10⁶ КОЕ/мл. Для заражения цыплят была выбрана доза 2·10⁹ микробных клеток (м.к.).

Через 9 дней после заражения проводили забой птицы.

При патологоанатомических исследованиях было установлено, что часть птиц имела поражения, характерные для хронического колибактериоза: очаговые отложения фибрина под эпикардом, мелкоточечные отложения фибрина под эпикардом, мелкоточечные вкрапления фибрина под эпикардом, сгустки фибрина под эпикардом, дистрофия печени. Часть птиц имела поражения, характерные для острого колибактериоза: слипчивый плевроперикардит, слипчивый плевроперикардит с включениями фибрина под эпикардом, обширная дистрофия печени с кровоизлияниями под капсулу, обширные кровоизлияния под эпикардом, мелкоточечные кровоизлияния под эпикардом, мелкоочаговые кровоизлияния под эпикардом.

Результаты исследований показали следующее:

- иммунизация препаратом в дозе 50 тысяч м.к. лишь в одном случае вызвала незначительные поражения хронического характера и полностью защищает цыплят от поражений при заражении вирулентной культурой кишечной палочки;

- иммунизация в дозе 150 тысяч м.к. в 50% случаев вызывает осложнения по типу хронического воспаления и в 25% случаев защищает цыплят от поражений при заражении условно-патогенной для цыплят культурой кишечной палочки;

- иммунизация в дозе 500 тысяч м.к. в 75% случаев вызывает осложнения при иммунизации четырехдневных цыплят и на 25% защищает цыплят от поражений при заражении условно-патогенной для цыплят культурой кишечной палочки.

В контрольной группе пало 8 цыплят.

Установлено, что повышение устойчивости цыплят раннего возраста к колибактериозу при иммунизации методом выпаивания живыми клетками штамма Escherichia coli Б-5 в малой дозе (50.000 м.к. на голову) связано с влиянием клеток Escherichia coli Б-5 на ферментативный фон плазмы крови и через него на дыхательную и метаболическую активность иммунокомпетентных клеток.

Дыхательная активность клеток эукариот, в том числе перитонеальных макрофагов, зависит от интенсивности поступления субстратов, прежде всего пирувата, в реакции цикла трикарбоновых кислот. В свою очередь поступление субстратов в цикл Кребса контролируется аспартатаминотрансферазой (ACT). В плазме крови животного поддерживается постоянство соотношения активности трансаминаз ACT и аланинаминотрансферазы (АЛТ). Для трансаминаз характерно субстратное регулирование ферментативной активности. Все вышеизложенное позволяет сделать вывод: активность трансаминаз отражается на метаболической активности митохондрий и дыхательной активности клеток, в том числе перитонеальных макрофагов. При этом известно, что аспартат является индуктором повышения активности ACT.

Пример 2

Доказательство влияния антигена из штамма E.coli Б-5, выращенного при 42°С, на активность ферментов в плазме крови.

Осуществляли культивирование штамма Е. coli «Б-5» при температурах 37°С и 42°С. Колонии, выращенные при 42°С, крупнее в 2 раза и не плоские, а с выпуклым центром. Количество колоний в случае выращивания при 42°С в 1,5-2 раза больше, чем в случае выращивания при 37°С.

Определяли активность ферментов в плазме крови после инкубации с антигенами из культур Е. coli «Б-5», выращенных при 37°С и 42°С, а также противодрожжевой лимфоцитарный индекс.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Активность ферментов в плазме крови после инкубации с антигенами из культур Е. coli «Б-5», выращенных при 37°С и 42°С. Показатель Биомасса и культуральная жидкость, 37°С Биомасса и культуральная жидкость, 42°С Контроль ACT, мккат 0,64±0,05 0,88±0,05 0,82±0,05 АЛТ, мккат 0,52±0,05 0,26+0,02 0,61±0,05 Коэффициент Де Ритиса 1,23±0,1 3,34±0,4 1,34±0,1 противодрожжевой лимфоцитарный индекс 0,48±0,03 0,62±0,01 0,11±0,06

Из таблицы 1 следует, что активность ферментов изменяется в ответ на антигены штамма Е. coli «Б-5» и воздействует на метаболическую активность лимфоцитов.

Высокая активность ACT стимулирует центральную зону метаболизма, увеличивает приток пирувата в цикл трикарбоновых кислот и аэробное окисление углеводов. При выращивании при 37°С активность ACT плазмы крови под воздействием культуральной жидкости и биомассы Е. coli Б-5 снижается на 22%, а при выращивании при 42°С возрастает на 7%.

Снижение активности АЛТ приводит к смещению метаболического акцента в сторону катаболизма, что необходимо при нейтрализации токсинов метаболическими системами клеток. Активность АЛТ в обоих случаях снижается, но при выращивании при 37°С - лишь на 15%, а при выращивании при 42°С - на 57%.

Увеличение коэффициента Де Ритиса отражает преобладание катаболических реакций над анаболическими, сопровождающееся акумулированием энергии в виде АТФ. При выращивании при 37°С величина коэффициента Де Ритиса под воздействием культуральной жидкости и биомассы Е. coli Б-5 снижается на 8%, а при выращивании при 42°С возрастает в 2,5 раза.

Пример 3

Для доказательства наличия изменения иммунного статуса провели исследования на 40 белых мышах, которым вводили аспартат в количестве 2 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора для увеличения активности ACT. Мышей разделили на две группы: опытную и контрольную, которым вводили физиологический раствор. Фиксировали изменение активности ACT через 2, 7 и 23 часа после введения аспартата у мышей опытной и контрольной групп.

Результаты исследований показали, что в опытной группе через 2 часа активность ACT увеличилась в 1,45 раза (на 45%), в контрольной группе данный показатель не изменился.

Дыхательная активность перитонеальных макрофагов через 2 часа в контрольной группе увеличилась в 1,9 раза, а в опытной - в 3,2 раза.

Пример 4

Для доказательства наличия биохимических изменений в организме цыплят, аналогичных биохимическим изменениям в организме белых мышей под воздействием иммунизации культурой штамма Е. coli Б-5, выращенной при 37°С и 42°С, провели исследования на 29 цыплятах яйценоского кросса Super Nick в возрасте 4-х суток.

Цыплята были разделены на 3 группы: цыплятам первой группы вводили препарат на основе клеток штамма Е. coli Б-5, выращенных при 37°С; цыплятам второй группы вводили препарат на основе клеток штамма Е. coli Б-5, выращенных при 42°С; третья группа контрольная. Препарат вводили перорально в количестве 50000 КОЕ на голову. Через 8 дней определяли биохимические параметры сыворотки крови цыплят.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Биохимические показатели крови четырехдневных цыплят, иммунизированных культурой Е. coli Б-5, выращенной при 37°С и 42°С. Показатели Доза 50 тыс.м.к. 37°С Доза 50 тыс.м.к. 42°С Контроль ACT 4,66±0,1* 4,76±0,1* 4,17±0,1 АЛТ 0,37±0,01 0,32±0,01 0,35±0,03 Коэффициент Де Ритиса 12,59±0,4 14,88±0,5* 11,91±0,4 ЛДГ 7,83±1,0 14,60±1,4* 9,53±1,0 Общий белок 36,83±0,2 37,52±0,2* 36,68±0,2 * р<0,05

Из таблицы 2 следует, что в обеих опытных группах наблюдалось достоверное повышение активности ACT, причем в случае выращивания Е. coli Б-5 при 42°С оно более выражено.

В группе цыплят, иммунизированных Е. coli Б-5, выращенной при 42°С, также наблюдалось достоверное повышение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) как по сравнению с контролем, так и по сравнению с цыплятами, иммунизированными культурой Е. coli Б-5, выращенной при 37°С.

Также в группе цыплят, иммунизированных Е. coli Б-5, выращенной при 42°С, наблюдалось достоверное повышение концентрации общего белка.

Таким образом, в группе цыплят, иммунизированных Е. coli Б-5, выращенной при 42°С, в дозе 50 тыс. КОЕ, повышение активности ACT, свидетельствующее о более высокой интенсивности аэробного окисления ПВК и, как следствие, о более высокой метаболической активности иммунокомпетентных клеток, сопровождается повышением активности ЛДГ. Это указывает на то, что повышенная активность ACT в этом случае, в отличиие от иммунизации культурой, выращенной при 37°С, в большей степени обеспечена повышенной концентрацией субстрата за счет более высокой активности ЛДГ.

Эффективность увеличения активности ACT в случае иммунизации культурой, выращенной при 42°С, выше, чем при иммунизации культурой, выращенной при 37°С. Это подтверждается и достоверным увеличением концентрации общего белка при иммунизации культурой, выращенной при 42°С, что указывает на более интенсивный азотистый обмен, обеспеченный более высокой активностью ACT.

В группе цыплят, иммунизированных Е. coli Б-5, выращенной при 42°С, в отличие от культуры, выращенной при 37°С, повышение активности ACT адекватно интенсивности гликолиза и продуктивно в отношении концентрации общего белка.

Таким образом, заявляемый способ профилактики колибактериоза цыплят раннего возраста позволяет эффективно осуществить профилактику колибактериоза цыплят раннего возраста с использованием живой вакцины, обладающей высокоиммуногенными и протективными свойствами за счет изменения свойств штамма E.coli Б-5 и активизации ферментативной активности организма цыплят.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к птицеводству. Перорально вводят вакцинный препарат с содержанием 1,0×10⁵-3×10⁵ микробных клеток штамма Е. coli «Б-5» в 1 см³ физиологического раствора, который вводят методом выпаивания при соотношении препарата к воде 1:15-25. При этом используют штамм Е. coli «Б-5», выращенный при 42°С. Способ позволяет эффективно осуществить профилактику колибактериоза цыплят раннего возраста за счет использования живой вакцины, обладающей высокоиммуногенными и протективными свойствами за счет изменения свойств штамма и активизации ферментативной активности организма цыплят. 2 табл., 4 пр.

Способ профилактики колибактериоза цыплят, заключающийся в пероральном введении из расчета 0,5 см³ на голову вакцинного препарата на основе антигена из штамма Е.coli «Б-5», отличающийся тем, что в качестве вакцинного препарата используют препарат с содержанием 1,0×10⁵-3×10⁵ микробных клеток штамма Е.coli «Б-5» в 1 см³ физиологического раствора, который вводят методом выпаивания при соотношении препарата к воде 1:15-25, при этом используют штамм Е.coli «Б-5», выращенный при 42°С.