Область изобретения
Данное изобретение относится к конститутивному продуцированию высоких уровней защитного антигена сибирской язвы в E.coli с использованием культуры с подпиткой.
Предпосылки изобретения
Сибирская язва, зоонозное заболевание, вызывается грамположительными спорулирующими бактериями Bacillus anthracis. Защитный антиген, РА, является основным компонентом всех вакцин против сибирской язвы. До сих пор культуральные супернатанты В.anthracis были основным источником очистки РА. Однако работа с культурами В.anthracis требует оборудования Р3, которое является непомерно дорогостоящим. Кроме того, препарат РА из В.anthracis часто загрязнен другими белками токсина сибирской язвы. Исследователи пытались экспрессировать и очищать РА в других микроорганизмах, таких как Bacillus subtilis, Baculovirus и E.coli. Очистка РА из Bacillus subtilis давала низкий выход, требовала выращивания в богатых питательными веществами средах, и огромное количество РА деградировалось вследствие действия протеаз, секретируемых этим организмом (L.W.J. Baillie et al., Lett. Appl. Microbial (1994) 19, 225-227). Бакуловирусные векторы экспрессировали РА в клетках насекомых; однако очистка не была возможна вследствие низкого выхода. Хотя РА экспрессировался в E.coli, попытки получить сверхпродукцию этого белка не были успешными (M.H. Vodkin et al., Cell (1983) 34, 693-697). Исследователи очищали также РА посредством направления этого белка в периплазматические пространства, однако выходы очищенного РА были очень низкими. Все известные экспрессионные системы для экспрессии защитного антигена с использованием E.coli являются индуцибельными системами, которые требуют использования IPTG, дорогостоящего химикалия.
В патенте США 2017606 описано получение антигена сибирской язвы выращиваемым В.anthracis на подходящей культуральной среде и отделение бацилл от культуральной среды.
В патенте США 2151364 описан способ получения вакцины сибирской язвы, который предусматривает получение суспензии спор сибирской язвы и добавление к этой суспензии стерильного раствора, содержащего квасцы.
Недостатками вышеупомянутых патентов США является то, что в них обоих используются культуры или споры В.anthracis. В.anthracis является инфекционным организмом и не может подвергаться манипулированиям без предохранительного оборудования. Уровни защитного антигена, экспрессируемого в В.anthracis, очень низки. Этот тип вакцинного препарата является также загрязненным другими токсичными и нетоксичными белками из В.anthracis, приводящими к большому числу побочных действий и реактогенности.
Целью данного изобретения является создание конститутивно экспрессирующей системы для быстрого, эффективного, экономически выгодного и происходящего на высшем уровне продуцирования РА сибирской язвы из E.coli с использованием культуры с подпиткой.
Для достижения этой цели данное изобретение обеспечивает способ получения защитного антигенного белка сибирской язвы из E.coli с использованием культуры с подпиткой, предусматривающий
- трансформацию клеток E.coli DН5α рекомбинантной конститутивной экспрессионной плазмидой, содержащей ген РА, для получения рекомбинантных клеток E.coli DН5α, экспрессирующих белок РА,
- выращивание указанных рекомбинантных клеток E.coli DН5α и испытание экспрессии РА посредством лизиса указанных клеток с последующим электрофорезом в денатурирующем геле и способом Вестерн-блоттинга с использованием РА-антител,
- ферментацию указанных клеток в биореакторе с использованием
- полиолов, углеводов или органических кислот в качестве первичных добавок в среде-бульоне Луриа при 32-42°С,
- способа культивирования с подпиткой и
- рН-DO-статного способа определения питательной депривации для получения культуры высокой плотности, экспрессирующей белок РА;
- сбор указанных клеток центрифугированием указанной культуры высокой плотности клеток при 5000-10000 об/мин в течение 10-30 минут,
- солюбилизацию указанных клеток культуры высокой плотности клеток с использованием 6-8 М раствора мочевины и перемешивание при температуре окружающей среды в течение 1-2 часов,
- отделение дебриса указанной культуры высокой плотности клеток центрифугированием при 10000-15000 об/мин в течение 30-60 минут при 32-42°С и сбор супернатанта, содержащего денатурированный мочевиной РА,
- выделение указанного денатурированного мочевиной РА из указанного супернатанта и очистку его Ni-NTA-хроматографией с постепенным удалением мочевины, в то время как указанный РА связывается с этой аффинной колонкой, и
- элюцию указанного очищенного ренатурированного РА и хранение защитного антигенного белка (РА) в виде замороженных аликвот при -20°С - -70°С в зависимости от немедленного или долгосрочного использования.
Указанная используемая рекомбинантная конститутивная экспрессионная плазмида экспрессирует белок РА в виде нерастворимых телец включения в клетках штамма E.coli DН5α.
Сбор указанных клеток центрифугированием указанной культуры с высокой плотностью клеток проводят при 5000 об/мин в течение 10 минут.
Центрифугирование дебриса указанной культуры с высокой плотностью клеток проводят при 10000 об/мин в течение 30 минут для максимизации сбора указанных клеток.
Указанным полиолом, используемым в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа во время ферментации, является глицерин.
Указанными углеводами, используемыми в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа, являются глюкоза, галактоза, мальтоза, фруктоза и лактоза.
Указанной органической кислотой, используемой в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа, является яблочная кислота.
При использовании полиола, углевода или органической кислоты в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа максимальную плотность клеток получают в диапазоне между 10 и 14 единицами оптической плотности в культурах во встряхиваемых колбах.
Максимальная плотность клеток в случае рекомбинантных клеток достигается с использованием культур с подпиткой, содержащих MgSO4.
Концентрация среды-бульона Луриа, используемая в подпитке, составляет 5-25Х.
Концентрация среды-бульона Луриа, используемая в подпитке, составляет 25Х для минимизации объема подпитки, добавляемого во время ферментации.
Указанной плазмидой является вектор серии pQE, содержащий узнаваемый E.coli промотор фага.
Антиген сибирской язвы содержит очищенный структурно, биологически и функционально активный рекомбинантный защитный антигенный (РА) белок В.anthracis, экспрессируемый в виде слитого с 6Х-гистидином белка в клетках E.coli DН5α, не содержащий полисахаридов, мертвых бактерий, культуральной среды, водорастворимых и нерастворимых в воде побочных продуктов и суспендированных примесей.
Краткое описание фигур
Теперь данное изобретение будет описано со ссылкой на следующий протокол и сопутствующие фигуры.
На фигуре 1 показано, что максимальная оптическая плотность в культуре во встряхиваемых колобах достигается с использованием глюкозы в качестве дополнительного источника углерода, а минимальную оптическую плотность получают с использованием мальтозы.
На фигуре 2 показана оптическая плотность, получаемая в периодической культуре и в культуре с подпиткой с использованием MgSO4 и без MgSO4.
На фигуре 3 показано, что полученный рекомбинантный РА является биологически и функционально таким же активным, как и нативный РА из В.anthracis.
Подробное описание
Для трансформации компетентных клеток штамма E.coli DН5α использовали рекомбинантную конститутивную экспрессионную плазмиду, содержащую ген РА, клонированный в вектор серии pQe. Указанные клетки, содержащие эту рекомбинантную плазмиду, выращивали в течение ночи при 37°С и 250 об/мин в бульоне Луриа со 100 мкг/мл ампициллина. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 минут. Экспрессию и локализацию РА подтверждали электрофорезом в ДСН-ПААГ. Было обнаружено, что 90% рекомбинантного белка присутствует в тельцах включения. Было обнаружено, что количество экспрессируемого белка увеличивается в прямой пропорции с увеличением плотности клеток растущей культуры.
Комплексную среду 100 мл модифицированного бульона Луриа (LB), в 5 концентрациях каждая, готовили с глюкозой, фруктозой, галактозой, лактозой, мальтозой, яблочной кислотой и глицерином в виде семи различных источников углерода во встряхиваемых колбах. Среду только LB без какого-либо источника углерода использовали в качестве контроля. Эквимолярные количества атомов углерода использовали в качестве источника углерода и поддерживали концентрацию, эквивалентную 0,5% глюкозе. Добавляли также 10 мМ MgSO4, 100 мМ фосфат калия и микроэлементы. Все колбы инокулировали в одно и то же время выращиваемым в течение ночи инокулятом клеток Е.coli DН5α, содержащих указанную рекомбинантную плазмиду. Пробы собирали асептически каждый час и измеряли OD600. Аликвоты культуры собирали, и их содержание рекомбинантного белка анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ. Наивысшие OD600 (оптические плотности при 600 нанометрах) могли достигаться при использовании глюкозы в качестве основного источника углерода, а самые низкие OD600 наблюдали в случае LB и мальтозы (фигура 1). Максимальную концентрацию белка получали с использованием яблочной кислоты, мальтозы и глицерина в качестве основного источника углерода. Самую низкую концентрацию белка наблюдали в случае LB и лактозы.
Ферментер Биостат В (B Braun Biotech International) на 5 л, снабженный датчиками рН, температуры, растворенного кислорода и пеновспенивателя, использовали для опытов по ферментации. Ферментер был сопряжен с интерфейсом персонального компьютера. Для получения данных и управления ферментером как в периодической культуре, так и в культуре с подпиткой использовали программное обеспечение MFCS/win 2.0.
Средой, используемой для ферментации, была комплексная среда, состоящая из бульона Луриа с MgSO4.7Н2О (10 мМ), фосфатом калия (5 г/л) и глицерином (1%) при рН 7,4. Для культур с подпиткой MgSO4 добавляли к среде перед автоклавированием. Глицерин также добавляли к среде перед автоклавированием. Подпитку 25Х готовили с 25% глицерином (мас./об.) и 25Х LB автоклавировали отдельно. Раствор фосфата калия также автоклавировали отдельно, давали остыть до комнатной температуры и добавляли асептически непосредственно перед началом опыта. Датчик рН калибровали со стандартными буферами с рН 7,0 и 9,2 перед автоклавированием. После автоклавирования среда ферментера автоматически доводилась до рН 7,4 добавлением 1 н. NaOH/1 М HCl, и температура устанавливалась на 37°С. Датчик DO (растворенного кислорода) калибровали установлением электронной нулевой величины растворенного кислорода в диапазоне от 0 до +15 наноампер (нАмп), и 100% величиной DO считали давление кислорода 2 vvm нагнетаемого воздуха, при скорости перемешивания 250 об/мин. Ферментер запускали в периодической фазе с рабочим объемом 2 л. Содержащие рекомбинантную плазмиду клетки выращивали в течение ночи на LB при селективном давлении 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С, 250 об/мин, 1% ночную культуру использовали для инокуляции ферментера. Величину DO устанавливали на 40%, и смеситель устанавливали на каскадный режим. В этом режиме, после инокуляции, когда DO начинает падать ниже 40%, скорость смесителя увеличивается автоматически для поддержания этой величины при 40%. Пробы собирали с интервалом 1 час. Аликвоты культуры разбавляли до оптической плотности (OD600) приблизительно менее 0,5 единиц. Когда растущая культура достигала середины log-фазы, начинали подачу из 25Х-подпитки с использованием перистальтического насоса (Pharmacia). Скорость подачи подвергали мониторингу и вручную регулировали для поддержания величины рН между 7,2 и 7,4. Добавление кислорода становилось необходимым после достижения OD 70. Кислород подавали в культуру с использованием функции смешивания газов ферментера. Культуру выращивали до OD600 120 единиц, после чего клетки собирали. Противовспениватель добавляли исходно к среде перед автоклавированием и добавляли позднее по мере необходимости.
Для оптимизации состава среды и других условий для последующих опытов по ферментации проводили несколько опытов с периодической культурой на модифицированном LB с глицерином с включением MgSO4 или без включения MgSO4 в среду для выращивания. Опыты с периодической культурой без MgSO4 в модифицированном LB (с глицерином в качестве источника углерода) могли достигать максимальной величины OD ˜14, тогда как опыты с периодической культурой с MgSO4 в модифицированном LB могли достигать величин OD600 более 18. Был сделан вывод, что MgSO4 является необходимым для роста клеток при более высоких плотностях. Включение MgSO4 в среду для выращивания является существенным для достижения более высоких выходов биомассы во время ферментации (фигура 2).
5 мл культуры с высокой плотностью клеток центрифугировали при 10000 g в течение получаса в предварительно взвешенных пробирках. После слива супернатанта пробирку с центрифугированными клетками взвешивали на весах для определения сырого веса клеток. Для определения сырого веса клеток такую же пробирку оставляли на ночь в термостате при 70°С и взвешивали на следующий день.
Для проверки стабильности плазмиды pMW1 в ферментере пробы культуры брали асептически каждый час во время опыта по ферментации. Пробы разбавляли таким образом, что OD600 каждой пробы была ˜5,0, и центрифугировали при 10000 g в течение 1 минуты. Супернатант сливали полностью, и осадок суспендировали в 100 мкл лизисного буфера, содержащего 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8,0 с 8 М мочевиной. Эти пробы подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ для подтверждения экспрессии белка из рекомбинантной плазмиды. Готовили также препараты колоний и минипрепараты плазмидной ДНК для прямого подтверждения присутствия рекомбинантной плазмиды внутри экспрессирующих клеток. Не наблюдали заметного генерирования не содержащих плазмид клеток.
Белок очищали с использованием металл-хелатной аффинной хроматографии при денатурирующих условиях. Вкратце, осадок из 100 мл культуры ресуспендировали в 100 мл денатурирующего буфера, содержащего 100 мМ натрий-фосфатный буфер, 300 мМ хлорид натрия и 8 М мочевину (рН 8,0). Ресуспендированный осадок инкубировали при 37°С в течение 2 часов на ротационном шейкере. Лизат центрифугировали дважды в течение 60 минут каждый раз при комнатной температуре, и супернатант смешивали с 50% суспензией Ni-NTA. Эту суспензию упаковывали в колонку и давали ей осесть. Проходящий через колонку поток повторно наносили на эту колонку. Матрикс NiNTA промывали 500 мл денатурирующего буфера, содержащего 8 М мочевину, с последующей ренатурацией на колонке этого белка с использованием градиента мочевины 8 М-0 М. Белок элюировали 250 мМ хлоридом имидазола в буфере для элюции, 100 мМ фосфатом натрия при рН 8,0 с 250 мМ имидазола и 300 мМ хлоридом натрия. 10 мкл каждой фракции анализировали электрофорезом на 12% ДСН-ПААГ. Фракции, содержащие белок, собирали, объединяли и диализовали против 10 мМ HEPES-буфера, содержащего 50 мМ NaCl, и хранили в замороженном виде при -70°С в виде аликвот.
Конкретный белок оценивали рядом способов. Проводили денситометрию с использованием системы документации гелей BioRad и программы Quantity One. Очистку РА в то или иное число раз определяли на различных стадиях расчетом количества белка, требуемого для убивания 50% макрофаг-подобных клеток J774A.1 (EC50) в комбинации с LF (1 мкг/мл) в течение 3 часов при 37°С. Очищенный белок измеряли по методу Бредфорда, а также определяли OD препарата при 280 нм. РА составлял более 30% общего клеточного белка и присутствовал в этих клетках в форме телец включения. Внутри этих клеток продуцировались 5-8 г/л РА.
Биологическую активность rPA (рекомбинантного РА) определяли также анализом цитотоксичности на линии макрофагоподобных клеток J774A.1. Все эксперименты проводили в трех повторах. Вкратце, к клеткам добавляли варьирующие концентрации белка rPA вместе с LF (1 мкг/мл). Нативный РА из В.anthracis вместе с LF служил в качестве положительного контроля. Спустя 3 часа определяли жизнеспособность клеток с использованием красителя МТТ и полученный осадок растворяли в буфере, содержащем 0,5% (мас./об.) додецилсульфат натрия, 25 мМ HCl в 90% изопропиловом спирте. Поглощение считывали при 540 нм с использованием микропланшет-ридера (BioRad), и определяли жизнеспособность в процентах. Было обнаружено, что rPA вместе с LF был вполне способен лизировать клетки макрофагов, и его активность была сходной с активностью РА, полученного из В.anthracis. Было найдено, что EC50 rPA и nPA была равна ˜50 нг/мл (каждого) (фигура 3). Очистку данного белка в то или иное число раз определяли на каждой стадии очистки вышеуказанными анализами цитотоксичности (таблица 1).
Очистка РА из Escherichia coli
bОчистку в указанное число раз определяли делением EC50 для лизата клеток на EC50 для фракций, полученных из различных колонок.
ОБСУЖДЕНИЕ
Сверхэкспрессия любого рекомбинантного белка зависит от оптимальной конфигурации различных элементов экспрессионной системы. Несколько факторов разительно влияют на экспрессию рекомбинантного белка, такие как сила промотора, стабильность плазмиды, копийность плазмиды, терминаторы транскрипции, эффективность транскрипции и трансляции, которые в конечном счете усиливают стабильность мРНК, терминаторы трансляции, тесная регуляция транскрипции генов, доступность рибосом, посттрансляционные модификации, стабильность и растворимость самого рекомбинантного белка, а также клетка-хозяин и условия культивирования. В процессах, нацеленных на высокие уровни экспрессии гетерологичного белка, используют сильные промоторы, такие как Т5, Т7, PL, PR, Ptrc, Ptac, для создания эффективной экспрессионной системы. Большинство из таких систем несет индуцибельные промоторы, и индукции предшествует фаза низкого образования продукта или отсутствия образования продукта. После индукции специфическая скорость продуцирования увеличивается до максимума в течение короткого периода времени, и данный белок непрерывно продуцируется в течение 4-5 часов. После индукции сообщался ряд изменений, таких как изменение в метаболизме углерода, которое приводит к накоплению ацетата, увеличение в респираторной активности, уменьшение в синтезе белков домашнего хозяйства и появление подобной тепловому шоку реакции и SOS-реакции. Все эти ответные реакции способствуют деградации рекомбинантных продуктов. Образование телец включения препятствует атаке клеточными протеазами рекомбинантного белка, которая в противном случае может приводить к интенсивной деградации этого белка, приводящей к низкому выходу продукта. Электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ в различных временных точках подкрепляют тот факт, что экспрессия РА из рекомбинантной плазмиды pMW1 не исчезает и пропорциональна OD этой культуры. Без значимой деградации большая часть этого белка присутствует внутри клеток в форме телец включения.
После создания сильной экспрессионной системы, продуцирование данного рекомбинантного белка в Е.coli может быть в значительной степени увеличено с использованием культуры высокой плотности клеток при помощи различных способов. Концентрации клеток более 50 г/л сухого веса могут быть рутинным образом получены для обеспечения экономически выгодного получения рекомбинантных белков. Однако культуры с высокой плотностью клеток имеют также несколько недостатков, таких как ингибирование субстратом, ограниченная способность переноса кислорода, образование ингибирующих рост побочных продуктов и ограниченное рассеяние тепла, приводящее к уменьшению эффективности смешивания ферментера. Основной проблемой в получении рекомбинантных белков в культуре высокой плотности клеток (HCDC) является накопление ацетата, липофильного агента, который является вредным для роста клеток. Сообщалось, что накопление ацетата в среде для выращивания уменьшает продуцирование рекомбинантного белка. Был разработан ряд стратегий для уменьшения образования ацетата в культурах с подпиткой, таких как регуляция специфической скорости роста ограничением незаменимых питательных веществ среды, таких как источник углерода или азота, варьирование условий выращивания и штаммов Е.coli. Поскольку первичной задачей исследования ферментации является экономически выгодное получение рекомбинантных продуктов, важным является развитие способа культивирования, который позволяет достигать максимизации выходов желаемого продукта. Состав среды для выращивания является решающим для усиления образования продукта, а также снижения накопления ацетата. Ацетат образуется в Е.coli при кислород-ограничивающих условиях или в присутствии избыточной глюкозы при аэробных условиях, когда вхождение углерода в центральный метаболический путь превышает ее биосинтетическую необходимость и способность генерирования энергии внутри клетки.
На основе кинетики роста и выходов рекомбинантного белка в качестве основного источника углерода для HCDC выбран глицерин из 7 других источников углерода, а именно глюкозы, фруктозы, лактозы, галактозы, мальтозы, яблочной кислоты и глицерина. При использовании глицерина в качестве источника углерода ацетат не продуцируется, и могут быть относительно легко достигнуты высокие плотности клеток с использованием глицерина. Более низкая скорость транспорта глицерина в клетку, в сравнении со скоростью транспорта глюкозы, по-видимому, приводит к уменьшению притока углерода через гликолиз, значительно уменьшая образование ацетата, и клетки растут более медленно на глицерине. Глицерин имеет также противовспенивающее действие, которое приводит к меньшему пенообразованию в ходе опыта по ферментации.
Способ, используемый для подпитки (фидинга) питательных веществ, также имеет решающее значение для успеха HCDC, так как он влияет как на плотность клеток, так и на продуктивность клеток. Постоянную или периодическую подпитку проводят при ограничивающих питательные вещества условиях. Хотя другие стратегии подпитки (фидинга) с успехом использовались для HCDC в Е.coli, недавно были разработаны более сложные стратегии подпитки. Скорость фидинга связана с другими физическими параметрами, такими как DO (растворенный кислород), рН, скорость выделения тепла или выделения СО2 (CER) микробами. DO-статный способ фидинга основан на том факте, что DO в культуре резко увеличивается при истощении субстрата. Клетки не способны быстро расти, так как уровни питательных веществ снижаются и клетками используется меньше кислорода. Таким образом, в DO-статном способе концентрацию субстрата поддерживают в желаемом диапазоне автоматическим добавлением питательных веществ при повышении DO выше заранее установленной величины. Другой возможностью является рН-статный способ, основанный на том, что рН среды изменяют, когда основной источник углерода становится лимитирующим. При истощении источника углерода рН начинает повышаться, в основном в результате увеличения концентраций ионов аммония, экскретируемых/секретируемых клетками.
Анализ системы подпитки начинается с характеристики способа проб и детектирований. Идеей является детектирование насыщения в дыхании путем измерения реакций DO и рН на импульсы в скорости подпитки. После инициирования подпитки и вступления Е.coli в log-фазу подпитка потребляется более или менее экспоненциальным образом. Но скорость подпитки должна регулироваться таким образом, чтобы она не превышала потребности в питании или скорости потребления питательных веществ. Это выполняется поддержанием рН и DO около их установленных величин. Падение рН и DO является указанием на избыточное предоставление субстрата. Повышение величин рН и DO указывает на то, что источник углерода или один из субстратов является лимитирующим, и, следовательно, необходима подпитка. Если увеличение в импульсе/скорости подпитки неспособно вызывать какую-либо значимую реакцию, т.е. снижение в DO или увеличение скорости смесителя, это является превосходным указанием на то, что некоторый другой фактор, такой как MgSO4, KH2PO4 или микроэлементы, стал лимитирующим и должен добавляться периодически в таких случаях. Это добавление сопровождается быстрым изменением в вышеупомянутых переменных. Е.coli способна использовать ацетат в качестве источника углерода в отсутствие глюкозы или другого основного источника углерода. Потребление ацетата характеризуется отклонением от установленных величин к более низким величинам рН, и возникает циклический характер в потреблении кислорода, пока заранее установленная величина рН не восстановится постепенно культурой. В этот момент вновь начинается подпитка.
DO-статный способ отвечает более быстро на истощение питательных веществ, чем рН-статный способ. При применении комплексных сусбстратов вместе с углеводными субстрататми изменение растворенного кислорода (DO) не является очевидным, так как клетки продолжают использовать эти комплексные субстраты. Стратегией подпитки, используемой в данных экспериментах, была комбинация как рН-статного, так и DO-статного способов. Мониторинг обоих параметров одновременно обеспечивает лучший контроль над условиями роста в растущей культуре. С использованием этой стратегии подпитки субстрата авторы данного изобретения смогли достичь OD 120, что является более чем шестикратным увеличением, в сравнении с OD, достигаемым в опытах с периодической культурой, и более чем 23-кратным увеличением в сравнении с OD, достигаемым в культурах со встряхиваемыми колбами.
Эта заявка является первым сообщением по оптимизации условий культур с подпиткой (HCDC) для достижения высоких выходов РА в Е.coli. Эта работа является попыткой получения большого количества нереактогенного РА, который мог бы служить в качестве перспективного вакцинного кандидата. Способ получения РА, сообщенный здесь, использует новый и выгодный субстрат и простую и легкую для управления стратегию подпитки (фидинга), которые могут также с успехом применяться для экспрессионных систем других рекомбинантных белков для получения высоких выходов продукта.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения защитного антигенного белка (РА) сибирской язвы. Защитный антигенный белок получают при использовании модифицированной культуры E.coli при ее культивировании с подпиткой (фидингом). Клетки E.coli трансформируют DH5α рекомбинантной конститутивной экспрессионной плазмидой, содержащей ген РА с получением клеток E.coli DH5α, экспрессирующих белок РА. После культивирования осуществляют сбор клеток высокой плотности, клетки солюбилизируют 6-8 М мочевиной и отделяют центрифугированием. Денатурированный мочевиной РА выделяют из супернанта, очищают и элюируют. Описан также РА сибирской язвы в виде слитого с 6Х-гистидином белка, полученный с использованием способа. При культивировании используют первичную добавку, выбранную из группы, состоящей из полиола, углевода и органической кислоты, а для подпитки используют среду LB (бульон Луриа), начиная с середины log-фазы. Плазмидой для трансформации E.coli является вектор серии pQE, содержащий узнаваемый E.coli промотор фага. Использование изобретения позволит повысить уровень продуцирования защитного антигена сибирской язвы, при этом антиген получают как слитый с 6Х-гистидином белок. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
(a) трансформацию клеток DH5α E.coli рекомбинантной конститутивной экспрессирующей плазмидой, содержащей ген защитного антигена (РА) В. anthracis, для получения рекомбинантных клеток DH5a, экспрессирующих белок защитного антигена,
(b) выращивание рекомбинантных клеток DH5α и контроль за экспрессией защитного антигена,
(c) ферментацию при температуре 32-42°С рекомбинантных клеток в биореакторе в комплексной среде на основе бульона Луриа (LB) с первичной добавкой, выбранной из группы, состоящей из полиола, углевода и органической кислоты, и подпиткой средой LB, начиная с середины log-фазы, в дозе, не превышающей потребности в питании, и с использованием pH-DO-статного метода для определения питательной депривации с получением экспрессирующей белок РА культуры с высокой плотностью клеток;
(d) сбор ферментированных клеток путем центрифугирования при 5000-10000 об./мин в течение 10-30 мин,
(e) солюбилизацию указанных клеток культуры с высокой плотностью клеток 6-8 М раствором мочевины и перемешивание при температуре окружающей среды в течение 1-2 ч,
(f) отделение дебриса указанной культуры путем центрифугирования при 10000-15000 об./мин в течение 30-60 мин при температуре 32-42°С и сбор супернатанта, содержащего денатурированный мочевиной защитный антиген,
(g) выделение денатурированного мочевиной защитного антигена из супернатанта и очистку его Ni-NTA-хроматографированием с постепенным удалением мочевины с защитным антигеном, связанным с аффинной колонкой, с получением очищенного ренатурированного защитного антигена и
(h) элюцию очищенного ренатурированного защитного антигена и, необязательно, хранение защитного антигенного белка (РА) в виде замороженных аликвот при температуре от минус 20 до минус 70°С.
| US 6267966 A, 31.07.2001 | |||
| WO 9418332 A3, 18.08.1994 | |||
| US 5591631 А, 07.01.1997. |
