СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETGST-LFmin, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF, И ШТАММ Escherichia coli BL-GSTLFmin, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 2009 года по МПК C12P21/00 C07K2/00 C12N1/21 C12N15/31 C12N15/63 

Описание патента на изобретение RU2355769C1

обретение относится к биотехнологии, конкретно - к области генной инженерии, касается способа получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез белка летального фактора сибирской язвы, штамм бактерий Escherichia coli, который может быть применен как продуцент данного белка, и методику выделения и очистки активного белка летального фактора сибирской язвы из бактериальной биомассы.

Летальный фактор сибирской язвы (LF) наряду с протективным антигеном (РА) представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инвазии. Основной областью применения активного белка LF являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств, в частности разработка диагностических китов для раннего определения и фармацевтических препаратов для терапии сибиреязвенной инфекции и вакцинации против сибирской язвы. Это может иметь важное значение как для борьбы с локальными вспышками заболевания, так и для быстрой нейтрализации последствий возможных биотеррористических актов с использованием бактерий или спор бактерий сибирской язвы.

Сибирская язва - это инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами грамположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютамовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn2+-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства киназ митоген-акивируемых протеин киназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры.

Летальный фактор сибирской язвы является белком с молекулярной массой 90 кДа. Структурно составленным из четырех доменов с преимущественно спиральной структурой. Домен 1 состоит из 12 спиральных участков, уравновешивающих четырехцепочечный слой. Этот домен связывается с протективным антигеном. Домен 2 сходен со вторым доменом токсина VIP2 Bacillus cereus, однако не обладает его каталитическими радикалами. Внутри последовательности домена 2 находится последовательность домен 3. Этот домен составлен из повторов, которые возникли в результате дупликации последовательности, изначально принадлежавшей домену 2. Домен 4 - это каталитически активная протеаза. Бета-слой и шесть альфа-спиралей формируют структуру, сходную с той, которая существует у другой металлопротеазы, термолизина. Связывание субстратного белка семейства МАРКК происходит в углублении между доменами 3 и 4. Активный центр фермента составлен аминокислотным радикалом Glu687 за молекулой воды и атомом цинка, связанным с радикалами His686, His690, Tyr728 и Glu735 (Pannifer AD, Wong TY, Schwarzenbacher R, Renatus M, Petosa C, Bienkowska J, Lacy DB, Collier RJ, Park S, Leppla SH, Hanna P, Liddington RC. (2001) Nature, 414, 229-233).

Известен способ выделения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы (Gupta P, Batra S, Chopra АР, Singh Y, Bhatnagar R. (1998) Infect Immun, 66(2), 862-865), в котором используют экспрессионную конструкцию на основе плазмиды pQE30, проэкспрессированную в штамме Е. coli SG 13009. Недостатком продукции белка с использованием этой конструкции является то, что более 40% белка находится в деградированном состоянии (видимо, в силу расщепления протеазами E.coli), что, безусловно, снижает выход белка при использовании данной конструкции. Большая исходная степень деградации белка приводит к тому, что требуется три стадии очистки белка для получения гомогенного продукта вместо двух, предлагаемых в настоящем изобретении. В используемой экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.

Известен генно-инженерный способ получения мутантного белка LF с использованием конструкции на основе рЕТ30 под контролем промотора фага Т5 в экспрессионных штаммах E.coli (патент РФ 2287581, опубл. 20.11.2006). Полученный таким образом белок и его мутанты используют для разработки вакцин против сибирской язвы. Однако известно, что рекомбинантный белок LF, синтезируемый с применением использованной конструкции, имеет до 40% деградации в отличие от 10%, наблюдаемых при использовании заявленной конструкции. В запатентованной экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта в отличие от заявленной.

Известен наиболее близкий к заявленному способ, в котором применяют экспрессию полноразмерного летального фактора сибирской язвы, химеризованного с глютатион-S-трансферазой (Kim J., Kim Y.-M., Koo B.-S., Chae Y.-K., Yoon M.-Y. (2003) Prot. Expr. Purif., 30(2), 293-300). По этой методике получают достаточно чистый белок в одну стадию очистки, но выход его сравнительно невысок по сравнению с выходом белка в заявленном способе и не превышает 5 мг с литра культуры. Конструкцию для получения рекомбинантного белка в описанной работе создают на основе плазмиды pGEX-KG под управлением синтетического Тас-промотора, что приводит к деградации части белка в процессе наработки. Кроме того, в экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.

Изобретение решает задачу создания продуцента и получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы с высоким выходом и низкой степенью деградации.

Поставленная задача решается за счет рекомбинантной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, обеспечивающей синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющей молекулярную массу 5,08 МДа, состоящей из BamHI-NdeI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+); фрагмента глютатион-S-трансферазы и пептида с-myc, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pETGST-LFmin, к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI:

XhoII 657 пн, EcoRI 683 пн, StuI 748 пн, XhoI 801 пн, BcoI 801 пн.

Также за счет штамма Escherichia coli BL-GSTLFmin, продуцирующего гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, химеризованный с глютатион-S-трансферазой и пептидом с-myc.

А также за счет способа получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающего трансформацию клеток Escherichia coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона X-100 в буферном растворе рН 7.4, содержащем протеазный ингибитор, с последующей очисткой целевого продукта на сорбенте с иммобилизованным глютатионом.

Техническим результатом изобретения является получение в очищенном виде и с высоким выходом (до 95% чистоты, до 100 мг с литра культуры) гомогенного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы.

Для повышения уровня продукции и снижения степени деградации белка LF в качестве базовой конструкции применяют плазмиду с промотором Т7 полимеразы, содержащую в своем составе последовательность, соответствующую пептиду с-myc для детекции продукта и глютатион-S-трансферазы для эффективной очистки синтезируемого белка. Для получения базовой векторной конструкции pETNHIS в плазмиду pET22b(+) (Novagen), не содержащую сайта BglII (последовательность сайта рестрикции нарушают обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции BglII с последующей достройкой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием достроенных концов) по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI вводят последовательность, содержащую фрагмент гена глютатион-S-трансферазы и пептид с-myc.

Фрагмент гена глютатион-S-трансферазы получают прямым ПЦР с ДНК плазмиды pDS473a (ATCC #87616) со специфических праймеров, очищают полученный фрагмент элюцией из агарозного геля и при помощи ПЦР к 3'-концу полученного фрагмента достраивают последовательность, кодирующую пептид с-myc, а на концы полученного фрагмента вносят сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI. Полученный фрагмент клонируют в вектор pET22b(+) по сайтам NdeI и BamHI.

В полученную описанным способом плазмиду pETGST по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI клонируют фрагмент гена летального фактора сибирской язвы, не содержащий домен I.

Полученную плазмиду pETGST-LFmin трансформируют в штамм E.coli BL21(DE3) и экспрессируют в среде 2xYT. Выход рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы высокой степени чистоты (97%) после хроматографической очистки на глютатион-сефарозе (Pharmacia) составляет 15% относительно суммарного белка клетки.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BL-LFminGST, содержащие плазмидную ДНК pETGST-LFmin, суперпродуцент рекомбинантного белка LF.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pETGST-LFmin обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в них гена летального фактора сибирской язвы или его фрагмента без домена I.

Фрагмент гена летального фактора сибирской язвы получен полимеразной цепной реакцией с ДНК бактерии сибирской язвы в Государственном Научном Центре Прикладной микробиологии РАМН.

Концевые участки гена и его фрагмента, содержащие соответствующие примененным векторам сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI вводят с помощью полимеразной цепной реакции с синтетическими олигонуклеотидными праймерами LFminBamHI и LFSalI (фиг.1), а затем ген или его фрагмент клонируют в векторную плазмиду pETGST.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL-GSTLFmin характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, неспороносные, грамотрицательные.

Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на простых питательных средах. При выращивании на агаре образуют круглые, мутные желто-серые колонии со слегка неровным краем, диаметром до 3 мм. При росте на жидких средах (LB, 2xYT) образуют интенсивную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме 37°С и оптимальных значениях рН от 7 до 7.5. В качестве источника углерода используют аминокислоты, углеводы, глицерин. В качестве источника азота могут использовать как органические соединения (аминокислоты, дрожжевой экстракт, триптон и др.), так и неорганические минеральные соли в аммонийной форме.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда (до 200 мкг/мл).

Штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток E.coli соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Штамм BL-GSTLFmin является суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-галактозидом происходит эффективный синтез целевого белка LF, который накапливается в цитоплазме клеток в растворимом состоянии и составляет до 50% суммарного белка клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pETGST-LFmin, для чего фрагмент гена летального фактора сибирской язвы без первого домена получают ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (фиг.1). Праймеры содержат сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI (N-конец гена, праймер LFminBamHI) и SalI (С-конец гена, праймер LFXhoI). Полученную ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами рестрикции и затем лигируют с расщепленной по сайтам BamHI и XhoI векторной плазмидной ДНК pETGST. На фиг.2 представлена последовательность фрамента гена летального фактора сибирской язвы, не содержащего первого домена. На фиг.3 изображена последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETGST-LFmin.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli DH12S или другие клетки, не содержащие DE3 лизогена и собственной устойчивости к антибиотикам пенициллинового ряда, и высевают на 2xYT-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют ПЦР с праймеров LFminBamHI и LFSalI, и из клонов, ПЦР которых приводит к образованию фрагмента нужной длины при анализе смеси агарозным гель-электрофорезом, выделяют плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Правильность встраивания фрагмента подтверждают секвенированием плазмидной ДНК. Полученные рекомбинантные плазмидные ДНК трансформируют в компетентные клетки штамма E.coli BL21(DE3), полученные клоны анализируют на уровень экспрессии целевого белка и отбирают штаммы-продуценты.

Штамм-продуцент E.coli BL-LFminGST выращивают на богатой среде (2xYT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С.

Клетки из экспрессионной культуры собирают центрифугированием при 5000 об/мин и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при 4°С в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) с добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl2 до концентрации 5 мМ и разрушают ДНК ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку. Хроматографическую очистку проводят на сорбенте, несущем иммобилизованный глютатион (GST-Sepharose, Pharmacia) в буферном растворе рН 7.5. Элюцию осуществляют раствором 10 мМ глютатиона на том же буфере. Диализуют очищенный белок LF в буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl рН 8, 2 мМ EDTA и 10% глицерина. Чистоту полученного препарата LF определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и препарат замораживают для хранения на -70°С.

Детекцию продукта осуществляют с помощью иммуноблота с антителами, специфичными к пептиду с-myc.

Активность полученного рекомбинантного летального фактора сибирской язвы измеряют с использованием специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы и содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия) по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре. Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С.

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

Фиг.1. Праймеры для амплификации фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена I.

Фиг.2. Последовательность фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена I.

Фиг.3. Последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETGST-LFmin.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pETGST-LFmin

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3' к 5' концу с помощью защищенных фосфоамидитов (5'диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов), активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0.5-0.7 мкМ, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкМ/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК 3 мкг плазмиды pETGST-LFmin обрабатывают в 20 мкл буфера для BamHI (фирма New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы рестрикции BamHI, а затем в 20 мкл буфера 2 (New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы XhoI. Рестрикция проводится 1 час при 37°С. Векторный фрагмент длиной 6,06 т.п.о. после электрофореза в агарозном геле помещают в диализный мешочек с максимальной пропускной способностью 12-14 кДа и элюируют под действием тока в трис-боратном буфере для электрофореза, а затем обрабатывают смесью фенол-хлороформ (1:1) и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена LF проводят ПЦР-амплификацию, используя в качестве матрицы бактериальную ДНК сибирской язвы и (0.05 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А и В (по 20 рМ каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0.5 мМ и 1 ед активности Pfu-полимеразы (фирма Promega). ПЦР проводят в режиме, предусматривающем 1 минуту денатурации при 95°С, отжиг 30 секунд при 57°С, элонгацию - 40 секунд при 72°С, 25 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют смесью фенол-хлороформ (1:2) и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл воды и расщепляют эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI (реакция с эндонуклеазой рестрикции SalI производства Fermentas проводится в буфере О Fermentas). Целевой фрагмент выделяют элюцией из агарозного геля.

0.5 мкг полученного синтетического фрагмента гена рекомбинантного летального фактора сибирской язвы прибавляют к раствору 0.3 мкг описанного выше векторного фрагмента и лигируют в 10 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7.6, 10 мМ MgCl2, 0.2 мМ АТР, 10 мМ дитиотрейтита и 10 ед. активности Т4-ДНК лигазы в течение 4 часов при 16°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации электропорацией (прибор ВТХ 600, режим 129 Ом, 2,5 KB) электрокомпетентных клеток E.coli DH12S. Трансформанты высевают на чашки с 2xYT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью ПЦР-амплификации с праймеров LFminBamHI и LFSalI в тех же условиях, что и получение фрагмента ДНК для клонирования, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК единичной бактериальной колонии. Положительные клоны идентифицируются по наличию фрагмента длиной 1606 пн при анализе ПЦР-смеси электрофорезом в агарозном геле. Из положительных клонов выделяют ДНК плазмиды pETGST-LFmin методом щелочного лизиса.

Пример 2.

Получение штамма-продуцента E.coli BL-GSTLFmin и определение его продуктивности

Штамм-продуцент E.coli BL-GSTLFmin получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21(DE3) плазмидой pETGST-LFmin, как описано в примере 1. Единичные клоны BL21(DE3), несущие плазмиду pETGST-LFmin, экспрессируют в аналитическом количестве (по 5 мл) согласно протоколу, описанному для препаративной экспрессии, и анализируют уровень экспрессии белка летального фактора сибирской язвы денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и иммуноблотом с антителами против пептида с-myc. Для проведения электрофореза равные аликвоты клеток разных клонов центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, обрабатывают 20 секунд ультразвуком, нагревают 3 минуты при 100°С и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Для постановки иммуноблота мембрану Hybond C+ и гель на 10 минут замачивают в буфере, содержащем 38.6 мМ глицина, 47.9 мМ трис-основание, 0,0385% додецилсульфата натрия, 20% метанола. Перенос ведут при силе тока 1 мА на см геля. Блокировка мембраны после переноса осуществляется 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS рН 7,4, содержащим 0.05% Tween. Блокированную мембрану инкубируют с антителами с-myc (клон CRL-1725, АТСС) при комнатной температуре в течение 2 часов в том же PBS, содержащем 0.5% БСА, и после отмывки первичного антитела смесью PBS-0.05% Tween 20 мембрану инкубируют ночь с пероксидазным конъюгатом антитела к мышиным антителам. Отмытый блот проявляют с использованием пероксидазного субстрата ТМВ по стандартному протоколу. Клоны, дающие наибольший выход белка, являются суперпродуцентами, их выращивают на богатой среде (2xYT) в течение ночи, добавляют глицерин до 15% и замораживают на -70°С для хранения.

Для препаративной экспрессии штаммы суперпродуцента E.coli BL-GSTLFmin выращивают в течение ночи при 37°С с добавлением 2% глюкозы, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С до оптической плотности 1 ОЕ. Выросшую культуру охлаждают до 25°С, добавляют ИПТГ до 1 мМ и проводят экспрессию 6 часов при 25°С. Далее клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и хранят в виде замороженных осадков при температуре -70°С.

Пример 3.

Очистка белка летального фактора, полученного с использованием конструкции pETGST-LFmin, и определение его активности.

Клетки из экспрессионной культуры суспендируют в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches), и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при +4°С в течение 30 минут. Лизируют клетки добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl2 до концентрации 5 мМ и разрушают геномную ДНК E.coli ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку с сорбентом, несущим иммобилизованный глютатион (GST-Sepharose, Pharmacia) в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7.5 и 70 мМ NaCl. Колонку промывают 10 объемами того же буфера и элюируют белок раствором, содержащим 10 мМ глютатиона в том же буфере. Диализуют очищенный белок LF в буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl рН 8, 2 мМ EDTA и 10% глицерина. Чистоту препарата LF определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано в примере 2, и замораживают для хранения на -70°С. Выход рекомбинантного белка летального фактора составляет 70 мг с литра культуры после полной процедуры очистки.

Протеолитическая активность полученного препарата оценивается по расщеплению специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы, содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия), по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре (Tecan). Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С. Кинетические параметры щепления субстрата полученным летальным фактором сибирской язвы составляют kcatM=4.12±0.8 с-1 мкМ-1.

Похожие патенты RU2355769C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 2007
  • Колесников Александр Владимирович
  • Захарова Мария Юрьевна
  • Козырь Арина Владимировна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2361921C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPHOFus, КОДИРУЮЩАЯ СУБСТРАТ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, СЛИТЫЙ СО ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ Escherichia coli, И ШТАММ Escherichia coli BL-PHOFus, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ БЕЛОК - СУБСТРАТ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В СОСТАВЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli 2009
  • Козырь Арина Владимировна
  • Дронина Мария Алексеевна
  • Колесников Александр Владимирович
RU2416637C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGST/ART/X, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТНЫЙ ХИМЕРНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST/ART/X ДЛЯ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ АПТАМЕРОВ К БЕЛКУ-МИШЕНИ X В СОСТАВЕ ПОЛИПЕПТИДА 2014
  • Козырь Арина Владимировна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Лунева Нина Михайловна
  • Рябко Алена Константиновна
  • Савченко Галина
  • Хлынцева Анна Евгеньевна
  • Дятлов Иван Алексеевич
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2558295C1
СТАБИЛЬНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕКТИВНЫЙ АНТИГЕН ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 2022
  • Грановский Дмитрий Львович
  • Евтушенко Екатерина Алексеевна
  • Иванов Пётр Алексеевич
  • Карпова Ольга Вячеславовна
  • Кирпичников Михаил Петрович
  • Кондакова Ольга Александровна
  • Никитин Николай Александрович
  • Рябчевская Екатерина Михайловна
RU2789418C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-hEGF, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER2566/pER-hEGF - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА 2006
  • Есипов Роман Станиславович
  • Степаненко Василий Николаевич
  • Чупова Лариса Анатольевна
  • Гуревич Александр Ильич
  • Мирошников Анатолий Иванович
RU2323976C2
ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА 2011
  • Орлова Надежда Александровна
  • Воробьев Иван Иванович
RU2496877C2
Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3 2015
  • Есипов Роман Станиславович
  • Макаров Дмитрий Александрович
  • Степаненко Василий Николаевич
  • Андреев Ярослав Алексеевич
  • Козлов Сергей Александрович
  • Гришин Евгений Васильевич
RU2619170C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PURVGF, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ФАКТОРА РОСТА ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ШТАММА Л-ИВП СОВМЕСТНО С БЕТА - ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК PURVGF - ПРОДУЦЕНТ ФАКТОРА РОСТА ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ШТАММА Л-ИВП 1993
  • Петров В.С.
  • Белавин П.А.
  • Чешенко Н.В.
  • Распопин В.В.
  • Патрушев Н.А.
  • Крендельщиков А.В.
  • Малыгин Э.Г.
RU2089612C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF265, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА 2019
  • Латыпов Виталий Феликсович
  • Корнаков Игорь Александрович
  • Робустова Светлана Эдуардовна
  • Хомутова Оксана Сергеевна
  • Родионов Петр Петрович
RU2728611C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PGGF 8, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА 1996
  • Коробко В.Г.
  • Шингарова Л.Н.
  • Петровская Л.Е.
  • Петренко Л.А.
  • Пустошилова Н.М.
RU2113483C1

Реферат патента 2009 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETGST-LFmin, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF, И ШТАММ Escherichia coli BL-GSTLFmin, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

Сконструирована новая рекомбинантная плазмида pETGST-LFmin (7704 п.н.), содержащая каталитически активный фрагмент гена летального фактора (LF) сибирской язвы под контролем промотора бактериофага Т7, детерминанту устойчивости к ампициллину и последовательность глютатион-S-трансферазы для эффективной очистки рекомбинантного белка на сорбенте с иммобилизованным глютатионом. Плазмида обеспечивает эффективный синтез белка LF сибирской язвы, химеризованного с последовательностью глютатион-S-трансферазы для очистки на иммобилизованном глютатионе. Штамм Escherichia coli BL-LFminGST получен трансформацией указанных плазмидных ДНК в штамм E.coli BL21 (ВЕЗ), который обеспечивает выход синтезируемого белка LF не менее 90 мг/1 г сырой биомассы. Активный белок LF получен способом, предусматривающим культивирование указанного рекомбинантного штамма, разрушение бактериальных клеток в буферном растворе рН 7,4 в присутствии Тритона Х-100 и протеазного ингибитора, очистку на сорбенте с иммобилизованным глютатионом. Способ обеспечивает выход протеолитически активного рекомбинантного химерного очищенного белка LF сибирской язвы в количестве не менее 70 мг/1 г сырой биомассы. 3 н.п. ф-лы, 3 ил.

Формула изобретения RU 2 355 769 C1

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETGST-LFmin, обеспечивающая синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 5,08 МДа, состоящая из BamHI-NdeI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+); фрагмента глютатион-5-трансферазы и пептида c-myc, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных плазмидой pETGST-LFmin, к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: XhoII 657 пн, EcoRI 683 пн, StuI 748 пн, Xhol 801 пн, BcoI 801 пн.

2. Штамм Escherichia coli BL-GSTLFmin, продуцирующий гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, химеризованный с глютатион-S-трансферазой и пептидом с-myc.

3. Способ получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающий трансформацию клеток Escherichia coli BL21 (DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона Х-100 в буферном растворе рН 7,4, содержащем протеазный ингибитор, с последующей очисткой целевого продукта на сорбенте с иммобилизованным глютатионом.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2009 года RU2355769C1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕТОКСИЧНОЙ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННОЙ ВАКЦИНЫ 2002
  • Бхатнагар Ракеш
  • Батра Смрити
  • Чаухан Вибха
  • Сингх Апарна
  • Ахуджа Нидхи
  • Кумар Правин
  • Гупта Панкадж
RU2287581C2
Пусковое устройство и механизм блокировки клавиш клавиатурного шифратора 1961
  • Усов Н.В.
SU145639A1
ШТАММ BACILLUS ANTHRACIS KM90 - ОСНОВА ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ АНТИГЕНОВ 2001
  • Микшис Н.И.
  • Попов Ю.А.
  • Дроздов И.Г.
  • Кутырев В.В.
RU2180917C1
US 6267966 A, 31.07.2001.

RU 2 355 769 C1

Авторы

Колесников Александр Владимирович

Захарова Мария Юрьевна

Козырь Арина Владимировна

Шемякин Игорь Георгиевич

Даты

2009-05-20Публикация

2007-11-23Подача