СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК БАКТЕРИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛАЙМСКОГО БОРРЕЛИОЗА-Borrelia burgdorferi Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/68 C12N15/34 

Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине: гематологии, медицинской диагностике и эпидемиологии, конкретно к способу и набору для обнаружения ДНК бактерии инфекционных заболеваний Лаймского боррелиоза в периферической крови, культуре клеток и клещах, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, региональных, областных службах санэпиднадзора и на предприятиях биологической промышленности.

В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко используется для диагностики вирусных и бактериальных заболеваний человека и индикации их возбудителей, в частности индикации Borrelia burgdorferi (1).

Наиболее близким способом и набором для обнаружения ДНК бактерии является способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi методом ПЦР (2). Способ осуществляют следующим образом: фрагмент ДНК размером 840 пар нуклеотидов (п.н.), выделенный из консервативной области генома Borrelia burgdorferi, частично секвенирован и на основании этой последовательности отобраны шесть праймеров, позволяющие амплифицировать специфические фрагменты ДНК. Для идентификации этих продуктов методом молекулярной гибридизации в качестве ДНК-зондов использованы дополнительно синтезированный олигонуклеотид, а также рекомбинантная плазмида, содержащая данный фрагмент.

Набор содержит положительный контроль (рекомбинантную плазмиду), отрицательный контроль, 6 праймеров, растворитель и масло для ПЦР, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов.

Недостатками данного способа и набора является, то, что проведение ПЦР с шестью праймерами сложно и увеличивает стоимость анализа, не дает возможности обнаруживать все геновиды, относящиеся к бактерии Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi, применяется только для экспериментальных исследований для обнаружения ДНК бактерии Лаймского боррелиоза Borrelia burgdorferi и только в культуре клеток.

Задачей предлагаемого изобретения является создание высокоспецифичного, чувствительного, но более простого и быстрого способа и соответствующего набора для обнаружения ДНК бактерии Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi в пробах периферической крови человека, культуре клеток и клещах с использованием двух праймеров, позволяющего осуществлять визуальную оценку возбудителей в анализируемом материале и обнаруживать все геновиды, относящиеся к Borrelia burgdorferi sensu lato.

Поставленная задача достигается способом для обнаружения ДНК бактерии Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi в пробах периферической крови человека, культуре клеток и клещах, при котором для постановки ПЦР выбраны и синтезированы два праймера ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGGGATATT-3′, 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, с температурой отжига от 51 до 52 градусов C в течение 10-30 сек с числом циклов амплификации от 35-42 и набором, включающим пластиковые пробирки, содержащие: праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R-5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы; термостабильный фермент Tag-полимеразу; 5-кратный буфер для реакции; смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов; положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, отрицательный контроль и масло для ПЦР.

Сущность изобретений.

Способ обнаружения ДНК возбудителя Borrelia burgdorferi производят следующим образом

Выделение ДНК из биологического материала

Выделение проводят по стандартной методике с использованием протеиназы К, экстракции фенолом-хлороформом и последующим осаждением ДНК этанолом (3)

Образцы (пробы периферической крови человека, культура клеток и клещи)гомогенизируют в 5-6 объемах буфера А (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ NaCl, 3 мМ МgCl2) и центрифугируют при 2500g в течение 10 мин при 4°С. Осадок 2 раза промывают буфером А, затем ресуспендируют в буфере В (10 мМ ЭДТА, 100 млМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl рН 8,5. 0,5% SDS, 200 мкг/мл протеиназа К) и инкубируют 2 ч при температуре 37°С. После стандартной экстракции фенолом и хлороформом ДНК осаждают этанолом и растворяют в воде до концентрации 0,5 мкг/мл.

Синтез праймеров

Синтез олигонуклеотидов проводят традиционным фосфоамитидным методом (4). Например на синтезаторе ДНК ASM-800 фирмы "БИОССЕТ".

Проведение ПЦР

ПЦР проводят по стандартной методике с использованием двух праймеров: ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, отобранных по нижеописанной методике. Отжиг праймеров производят при температуре 51-52°С в течение 10-30 сек при числе циклов амплификации, равных 35-42.

Детекция ДНК

Детекцию проводят в 2% агарозном геле с использованием ТВЕ - буфера (5,4 г Трис, 2,75 г борной кислоты, 0,46 г ЭДТА, dH₂O до 1 л, рН 8.3) с бромистым этидием (2 мкл/100 мл буфера). В лунку геля под буфер вносят по 10 мкл амплификата (5). Электрофорез проводят при напряжении 20 V/см в течение 10 мин. Визуализацию результатов проводят на видеосистеме, например на BIOTEST-D (г.Москва).

Обоснование преимущества выбора праймеров

В качестве уникальной последовательности для диагностики В.burgdorferi sensu lato был выбран ген rrs, кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы. Был проведен анализ следующих ДНК-последовательностей (табл.1), полученных в базе данных Genome Net - DNA Database национального института генетики (Kyoto, Japan).

Подбор праймеров проводили с использованием программы Primer Premier - V.5 (Premier Biosoft Intеrnationа1). Для участка U03396 (ген rrs, GenBank) было подобрано несколько пар праймеров (табл.2). Специфические праймеры для В.burgdorferi получены в результате дизайна последовательности 16S рРНК и спейсерного участка 16S рРНК - 23S рРНК.

Оценку специфичности праймеров для 16S рРНК проводили методом множественного сравнения последовательностей, используя программное обеспечение, например BLAST, для оптимальной оценки видоспецифичности и Clastal W для оценки полиморфизмов в сравниваемых последовательностях.

Оптимальной парой праймеров (с учетом их термодинамических характеристик) были выбраны праймеры ВВsl1.F/ВВsl1.R и ВВsl4.F/ВВsl4.R (табл.3).

Праймеры ВВsl1.F/ВВsl1.R расположены на участке гена rrs, кодирущего 16S рРНК, и инициирует амплификацию продукта 537 п.н. Праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R расположены на спейсерном участке 16S-23S и инициируют амплификацию продукта 688 п.н. (фиг.1).

Данные праймеры не образуют вторичных структур (шпилек) и димеров, что увеличивает эффективность их связывания с матричной ДНК. Однако праймер ВВsl1.F имеет участки фальшь-праймирования, но без образования продуктов.

Праймер ВВsl1.R. также имеет участок фальшь-праймирования с образованием продуктов. Однако энергия ΔG, которая образуется при комплементарном взаимодействии, ниже критической (ΔGk=-9). Праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R могут образовывать нестабильные кросс-димеры.

Обоснование подбора условий для проведения ПЦР

Оптимизацию температуры амплификации проводили экспериментально, при сохранении всех условий постановки ПЦР, температуру отжига праймеров изменяли от 45°С до 57°С.

При температуре отжига праймеров 45°С происходила амплификация ДНК всех исследованных штаммов Borrelia, ДНК микроорганизмов других таксономических групп при данных условиях не амплифицировались. При повышении температуры выше 56°С продукты ПЦР в геле не обнаруживаются. Оптимальное соотношение количества специфических и неспецифических продуктов амплификации ДНК бактерии В.burgdorferi установлено при температуре отжига праймеров 52°С для пары праймеров ВВsl1.F/ВВsl1.R и 51°С для ВВsl4.F/ВВsl4.R!

При использовании режима активного регулирования температуры был выявлен следующий диапазон температур: время денатурации и элонгации составило от 10 до 30 сек, оптимальное 15 сек, время отжига праймеров от 10 до 30 сек., эффективное число циклов - 35-42.

Аналитические характеристики

Аналитическая чувствительность ПЦР была определена методом лимитирующих разведений ДНК бактерии Borrelia burgdorferi, выделенной из культуры. В результате проведенной оценки установлено, что праймеры используемых в данном исследовании ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, обладают высокой аналитической чувствительностью на уровне 20 геномных эквивалентов в каждой ПЦР реакции (фиг.2; Табл.4).

Предварительная оценка аналитической специфичности используемых праймеров с помощью on-line сервера BLAST (blastn) показала отсутствие гомологии выбранной последовательности с другими видами микроорганизмов, при уровне значимости Е=10. (фиг.2).

В результате, амплификация с праймерами ВВsl4.F/ВВsl4.R (спейсерный участок 16S-23S рРНК) во всех случаях давала отрицательные результаты. В то время, как использование пары ВВsl1.F/ВВsl1.R (16S рРНК) приводило в 40% случаев к слабоположительным результатам с Preponema palidum, что послужило основанием не использовать эту пару праймеров в дальнейшем тестировании.

Набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi включает пластиковые пробирки, содержащие термостабильный фермент Tag-полимеразу, 5-кратный буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклео-тидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена флагелина бактерии, масло для ПЦР и праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы.

Предлагаемый набор укомплектован 5 пластиковыми пробирками.

Набор предназначен для выявления ДНК бактерии Borrelia burgdorferi в культуре клеток, сыворотке крови или клеще методом полимеразной цепной реакцией с визуальной индикацией полученного ампликона ДНК гель-электрофорезом в агарозе и может быть использован в клинических и эпидемиологических исследованиях. Набор рассчитан на проведение 110 анализов, включая положительный и отрицательный контроли.

Набор работает следующим образом.

Проведение ПЦР

1. Готовят пробирки для проведения амплификации, пронумеровав их и расположив соответствующим образом в штативе. Готовят две пробирки для контролей: одну для отрицательного и одну для положительного контроля.

2. Готовят смесь компонентов для амплификации из расчета на одну пробу: термостабильный фермент Tag-полимеразу, 5-кратный буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов и праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы.

3. Смесь перемешивают пипетированием и добавляют по 15 мкл в каждую пробирку для амплификации.

4. Вносят по одной капле масла для ПЦР в каждую пробирку, используя пипетку с наконечником до 1 мл.

5. Вносят по 10 мкл выделенной из клинического образца ДНК в соответствующую пробирку для проведения амплификации с помощью индивидуального наконечника с фильтром. Вносят в пробирку, помеченную как положительный контроль, 10 мкл контрольной ДНК, а в пробирку, помеченную как отрицательный контроль, 10 мкл отрицательного контрольного образца.

6. Пробирки закрывают и центрифугируют в течение 5 сек при 3 тыс. об/мин.

7. Переносят пробирки в программируемый термостат (амплификатор), прогревают при 95°С в течение 5 мин и проводят амплификацию по следующей программе (Табл.5).

Анализ результатов диагностики

1. Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР проводят методом горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозе.

2. В положительном контрольном образце для Borrelia burgdorferi выявляют полосу размером 500 нуклеотидных пар.

3. В отрицательном контрольном образце полоса, соответствующая фрагментам генома данных инфекций, должна отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации набора.

В анализируемых пробах отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии данного возбудителя в пробе. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного светофильтра.

Таким образом, предлагаемый способ и набор обладают новизной: установлены видоспецифические сайты генома бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi в области гена, кодирующего 16S рРНК (rrs); оптимальная температура отжига: время денатурации и элонгации составило от 10 до 30 сек, оптимальное 15 сек, время отжига для пары праймеров 16S рРНК от 10 до 30 сек при температуре отжига 51-52°С, число циклов амплификации 35-42, что позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью двух праймеров вместо шести, используемых в стандартной ПЦР, сократить время выявления ДНК бактерий, в течение 2 часов обнаружить до 10 фемтограмм ДНК бактерии Borrelia burgdorferi или 20 частиц в 1 мл инфекционного материала, включая пробы крови и клещей.

Источники информации

1.Yigong Ge, J Bacteriol, Мау 1998, р.2418-2425, Vol.180, No.9.

2. Dionysios Liveris, Journal of Clinical Microbiology, March 1999, р.565-569, Vol.37, No.3.

3. Манниатис Т., 1984.

4. Grossman L., 1987.

5. Остерман Л.А., 1981.

Таблица 1Название микроорганизмаРегистрационный номер (Genbank)ГенШтаммДата открытияРазмер гена (пн)Gb_ba:BbrnaoprU03396Rrs (16S rRNA)В3110/9311955Gb_ba:Вbu44938U44938Rrs (16S rRNA)5МТ5/961,533Gb_ba:Bor16rgL39080rrs (16S rRNA)9МТ3/951,533Gb_ba:Вbu44939U44939rrs(16S rRNA)917Y5/961,533Gb_ba:Bb16s297Х85204rrs(16S rRNA)2975/951,488Gb_ba:BorrrdL36160rrs(16S rRNA)934U9/941,536Gb_ba:Воr16rgaL39081rrs(16S rRNA)935Т3/951,542Gb_ba:BorrrdqМ64309rrs(16S rRNA)13524/921,481Gb_ba:BorrrdМ64310rrs (16S rRNA)200044/921,480Gb_ba:Вb16srrnaХ57404rrs(16S rRNA)В313/921,465Gb_ba:BorssrnaМ59293rrs(16S rRNA)В314/921,480Gb_ba:BorrnacaМ89935rrs(16S rRNA)СА2-871/931,291Gb_ba:Вb16sdk7Х85195rrs(16S rRNA)DК75/951,488Gb_ba:Вb16sdk29Х85202rrs(16S rRNA)DК295/951,488Gb_ba:Вb16sdunkХ85201rrs(16S rRNA)DUNKIRK5/951,488Gb_ba:Вbu28501U28501rrs(16S rRNA)ESP-17/951,488Gb_ba:Воrrr16saМ60967rrs(16S rRNA)G24/921,483Gb_ba:BorrnailМ89936rrs(16S rRNA)Illinois 11/931,291Gb_ba:Вb16skippХ85196rrs(16S rRNA)KIPP5/951,488Gb_ba:Вb16slipzХ85203rrs(16S rRNA)LIPITZ5/951,488Gb_ba:Воrrr16scМ60969rrs(16S rRNA)Sh-2-824/921,476Gb_ba:BorrnavsМ89938rrs(16S rRNA)VS2191/931,350Gb_ba:BorrgdaL40596Rrs(16S rRNA) 3/951,492

Таблица 2ПраймерЛокусНуклеотидная последовательностьВВsl1.F19-44 п.н.5'-CAGACAACAGAAGGGAATTTAAATG-3'ВВsl1.R532-556 п.н.5'-CAAGTGATGTATTAGCATCAACTG-3'ВВsl2.F87-111 п.н.5'-TTGTTAGCAGGAGTATGCAATATC-3'ВВsl2.R408-429 п.н.5'-GGGCTTGTAAGCTCTTTAACT-3'ВВsl3.F128-149 п.н.5'-GCTGCTGGCATGGGGGTTTCT-3'ВВsl3.R729-754 п.н.5'-CAATAGCATACTCAGTAGTACTATT-3'ВВsl4.F1224-1248 п.н.5'-AAAGAATACATTAAGTGCGATATT-3'ВВsl4.R1888-1912 п.н.5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3'Таблица 3ПраймерГенДлинаСеквенс-номерGC %Tm (оС)Та Ppt (оС)ВВsl1.Frrs251952,655,1 ВВsl1.Rrrs2453260,061,3 Продукт 1 537 45,487,753,0ВВsl4.Frrs24122454,559,5 ВВзl4.Rrrs24188850,061,9 Продукт 2 688 34,583,351,1

Таблица 4Исследуемый штаммПраймер B.Bsl1.F/B.Bsl1.R ГЭ в пробеПраймер B.Bsl4.F/B.Bsl4.R ГЭ в пробеВ.В.s.s. В31120150В.afzelii600300В.В.s.s.Taldom №17600300Таблица 5 Амплификаторы с регулированием по матрице: типа "MiniCicler"Амплификаторы с активным регулированием (по пробиркам): типа "Терцик", "Omn-Е" ТемператураВремяЦикловТемператураВремяЦиклов195°5 мин195°5 мин1295°1 мин4095°30 с40 52°1 мин 52°30 с  72°1 мин 72°30 с 372°1 мин172°1 мин1410°Хране-е 10°Хране-е 

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ для обнаружения ДНК возбудителя Лаймского боррелиоза человека в периферической крови, культуре клеток и клещах. Способ предусматривает выделение ДНК из биологического материала, синтез праймеров, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров и оценку полученных результатов. При этом используют праймеры BBsl4.F/BBsl4.R 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', к участку гена, кодирующего 16S рРНК. Способ является высокоспецифичным, чувствительным, но более простым. Кроме того, предложен набор для осуществления этого способа. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине и молекулярной биологии. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл.

1. Способ обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi, включающий выделение ДНК из биологического материала, синтез праймеров, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров и оценку проведения реакции гель-электрофорезом в 2%-ном агарозе, отличающийся тем, что при постановке полимеразной цепной реакции используют для обнаружения ДНК бактерий в культуре клеток, пробах периферической крови человека и клещах два праймера: BBs14.F/BBs14.R

5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3',

5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3',

к участку гена, кодирующего 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, отжиг праймеров производят при температуре 51-52°С в течение 10-30 с, а число циклов амплификации равно 35-42, при этом отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе, а наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии данного возбудителя в пробе.