РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ИММУНОДОМИНАНТНОГО БЕЛКА BORRELIA GARINII, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК C12N15/09 C12N15/31 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, микробиологической промышленности, генно-инженерной биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантных полипептидов, несущих специфичные антигенные детерминанты белка OspC и фрагмента флагеллярного белка FlaB Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.).

Лайм-боррелиоз (ЛБ), вызываемый спирохетами трех геновидов комплекса Borrelia burgdorferi s.l. (B.garinii, B.afzelii и В.burgdorferi sensu stricto - B.burgdorferi s.s.), является острым, с переходом в хроническую форму, природно-очаговым заболеванием, переносимым клещами группы Ixodes. ЛБ широко распространен в северном полушарии. На ранних стадиях болезнь довольно эффективно поддается лечению антибиотиками, в то время как при переходе в хроническую форму лечение весьма затруднено и требует значительно большего времени и более сложной схемы лечения. Постановка диагноза, особенно ранних стадий заболевания ЛБ, на основе одной лишь симптоматики очень затруднена ввиду огромного разнообразия клинических проявлений ЛБ, сходных с другими заболеваниями. На территории России распространены только два геновида возбудителей ЛБ - B.garinii и B.afzelii, хотя в недавних сообщениях приводятся данные об обнаружении в иксодовых клещах в Северо-западном регионе России и в Московской области боррелий геновида В.burgdorferi s.s. (Семенов А.В., Алексеев А.Н., Дубинина А.Н., Кауфманн У., Йенсен П.М. Исследование генетической гетерогенности популяции Ixodes persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae) на северо-западе России и распространенность клещевых патогенов, возбудителей болезни Лайма и эрлихиоза, в клещах различных генотипов // Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2001; (3): 11-15; Масузава Т, Наумов Р.Л., Кудекен M., Харитоненков И. Г. Обнаружение Borrelia burgdorferi sensu stricto в Московской области, Россия // Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2001; (2):52.). Заболеваемость ЛБ составила в 1999 г. и в 2000 г. 8470 и 7533 человек соответственно. Однако эти цифры не отражают полной картины, т.к. в медицинской практике достоверно диагностируется лишь эритематозная форма ЛБ при наличии типичной мигрирующей эритемы в месте укуса клеща. Безэритематозные формы и хронические стадии клещевого боррелиоза практически не диагностируются в России из-за отсутствия отечественных наборов для серодиагностики ЛБ, импортные же наборы - очень дорогие. Если учесть тот факт, что на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока на долю возбудителя эритематозной формы ЛБ приходится всего 10-20% боррелий (геновид B.afzelii), а распространенность другого геновида (B.garinii) значительно доминирует, то становится очевидным, что клещевой боррелиоз у преобладающей части лиц, покусанных клещами, вообще пока не диагностируется. Таким образом, создание систем для диагностики клещевого боррелиоза, в особенности его ранних стадий, является актуальной задачей здравоохранения России.

Поскольку культивирование боррелий является длительным и дорогостоящим процессом, перспективным подходом в создании тестов для серодиагностики ЛБ является выявление специфичных для возбудителя иммунодоминантных антигенов, получение рекомбинантных форм этих белков и конструирование на их основе иммуноферментных тест-систем.

Одним из наиболее сильных антигенов В.burgdorferi s.l., индуцирующих гуморальный иммунный ответ на ранних стадиях инфекции, является флагеллярный белок FlaB, кодируемый геном flaB (Berland R., Fikrig E., Rahn D., Hardin J. and Flavell R. Molecular characterization of the humoral response to the 41 - kilodalton flagellar antigen of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent// Infection and Immunity. 1991, v.59, p.3531-35; Walich R.; Moter S. E., Simon M.M., Ebnet K., Heiberger A. and Kramer M.D. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene// Infection and Immunity, 1990, v.58, p.1711-1719).

Однако использование полноразмерного FlaB для диагностики затруднено ввиду его высокого антигенного перекреста с аналогичными белками других микроорганизмов, прежде всего возбудителя сифилиса (Luft В.J., Dunn J.J., Dattwyler R.J., Gorgone G., Goveric P.D. and Schubach W.H. Cross-reactive antigenic domains of the flagellin protein of Borrelia burgdorferi/ Res. Microbiology, 1993, v.144, p.251-257; Pavia C.S. Overview of the pathogenic spirochetes//Journal of Spirochetal and Tick-Born Diseases, 1. 1994, v.1; Subramanian G., Koonin E. and Aravind L. Comparative genome analysis of the pathogenic spirochetes Borrelia burgdorferi and Treponema pallidium //Infection and Immunity, 3.2000, v.68, p.1633-1648).

Эту проблему можно обойти, используя для диагностики лишь фрагмент FlaB, обладающий, по данным ряда исследователей, высокой антигенной специфичностью для возбудителей ЛБ (Ge Y., Li С., Corum L., Slaughter С. and Charon N.W. Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi //Journal of Bacteriology, 5. 1998, v.180, p.2418-2425; Robinson J.M., Pilot-Matias T.J., Pratt S.D., Patel С.В., Bevirt T.S. and Hunt J.S. Analysis of the humoral response to the flagellin protein of Borrelia burgdorferi: cloning of regions capable of differentiating Lyme disease from syphilis// Journal of Clinical Microbiology, 3. 1993, v.31, p.629-635).

Известен патент США №5618533 «Flagellin-based polypeptides for the diagnosis of lyme disease» на флагеллярные полипептиды. Работа выполнена на микроорганизмах геновида В.burgdorferi s.s., не имеющего сколько-нибудь существенного распространения на территории России, в частности отсутствующего на большей части Европейской территории России и совершенно отсутствующего в Азиатской ее части. Использованы следующие полипептиды аминокислотной последовательности белка FlaB В.burgdorferi s.s str. B31: 165-273, 197-273, 197-241.

В данной работе в качестве примера вектора для экспрессии указан GEX-2T с промотором PtaqI. Использование этого вектора не позволяет получать полипептидные продукты в чистом виде, их можно получить только в виде слитого белка с глютатион-S-трансферазой, что вызывает некоторые проблемы при их получении и использовании, а именно:

- может в некоторых случаях приводить к искажениям результатов при диагностике ЛБ из-за собственной иммунной реактивности глютатион-S-трансферазы,

- требует более дорогих материалов для очистки рекомбинантных протеинов,

- позволяет проводить их очистку только в нативных условиях,

- ввиду того, что внутри клетки синтезируется не только целевой продукт, но и дополнительная протяженная аминокислотная последовательность, количество нарабатываемого целевого продукта уменьшается,

- использованная в плазмидном векторе регуляторная область недостаточно жестко контролирует активность промотора Ptaql, что приводит к существенной экспрессии гена в отсутствие индуктора и, как следствие этого, уменьшению стабильности рекомбинантной плазмиды.

Известны патенты США №5643733 «Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof» и №5965702 «Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof». Данные работы выполнены также на не имеющем распространения в России геновиде В.burgdorferi s.s. Использованы следующие полипептиды аминокислотной последовательности белка FlaB В.burgdorferi s.s: 137-262, 64-311. В патентах использованы плазмиды рВ410, рВТ1042, рВТ445 и рВТ259. Использованные в данных патентах векторные системы позволяют получить флагеллярные полипептиды в виде слитого белка с фрагментом β-галактозидазы, что также создает дополнительные трудности при их получении и использовании, а именно:

- фрагмент β-галактозидазы может давать артефактные результаты при проведении ИФА анализа (ложноположительные результаты диагностики),

- данная система не позволяет проводить быструю и качественную очистку с использованием аффинной хроматографии (белок получается в результате многостадийного центрифугирования и недостаточно чист),

- нерастворимость или слабая растворимость слитого белка в водных растворах усложняет изготовление тест-систем и их использование,

- кроме того, использование данной системы экспрессии накладывает существенные ограничения на выбор штамма-хозяина и состав питательной среды для получения целевого продукта,

- ввиду того, что внутри клетки синтезируется не только целевой продукт, но и дополнительная протяженная аминокислотная последовательность, количество нарабатываемого целевого продукта уменьшается.

В литературе не описаны генно-инженерные конструкции, позволяющие получать флагеллярныи белок FlaB и его фрагменты, свойственные В.garinii и, в частности, свойственные западно-сибирским изолятам B.garinii.

Другим сильным антигеном B.hurgdorferi s.l., индуцирующим гуморальный иммунный ответ на ранних стадиях инфекции, является кодируемый геном ospC белок OspC, относящийся к семейству поверхностных липопротеинов боррелий (Wilske В., Preas-Mursic V., Jarius S., Hofmann A., Pradel I., Soutschek E., Schwab E., Will G. and Wanner G. Immunological and molecular polymorphism of OspC, an immunodominant major outer surface protein of Borrelia burgdorferi //Infection and Immunity, 5. 1993, v.61, p.2182-2191).

OspC и FlaB являются первыми антигенами, вызывающими иммунный ответ у больных Лайм-боррелиозом. Иммуноглобулины М против этих белков присутствуют в крови в высоком титре уже через одну - две недели после заражения (Rauer S., Spohn N., Rasiah., Neubert U. and Vogt A. Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant OspC and internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease// Journal of Clinical Microbiology, 4. 1998, v.36, p.857-861).

Известен патент US6464985 «Compositions arid methods using the borreliacidal epitope(s) of Borrelia burgdorferi outer surface protein С (OspC) for the diagnosis and prevention of Lyme disease». Эта работа выполнена также на геновиде Borrelia burgdorferi s.s. Использован фрагмент DraI-SmaI гена ospC Borrelia burgdorfen s.s., кодирующий фрагмент белка OspC с 145 по 194 аминокислотный остаток (а.о.). Однако белок OspC характеризуется высокой гетерогенностью среди различных геновидов, достигающей 40% аминокислотного состава. С аминокислотной вариабельностью коррелирует и антигенная изменчивость. Сыворотки лиц, инфицированных каким-либо геновидом Borrelia burgdorferi s.l., как правило, плохо связываются с антигеном OspC других геновидов (Bunkis J., Olsen В., Westman G. and Bergstrum S. Variable serum immunoglobulin responses against different Borrelia burgdorferi sensu lato species in population at risk for patients with Lyme disease // Journal of Clinical Microbiology, 6. 1995, v.33, p.1473-1478). Внутри геновидов, а тем более групп штаммов, вариабельность значительно меньше и обычно не превосходит нескольких процентов (Wang I.-N., Dykhuezen D.Е., Qiu W., Dunn J.J., Bosler E.M. and Luft B.J. Genetic diversity of ospC in local population of Borrelia burgdorferi sensu stricto // Genetics, 1.1999, v.151, p.15-30). Использованная в этой работе плазмида предназначена для клонирования генов, состыкованных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей олигопептид, способный биотинилироваться in vivo. При экспрессии клонируемых генов синтезируются химерные белки, содержащие биотинилированный полипептид, который обеспечивает аффинную очистку целевых химерных белков на колонках с авидином или стрептавидином. Но такой способ очистки является сравнительно дорогим и пригоден для очистки белков только в нативных условиях. Кроме того, полученные очищенные антигены нельзя использовать в тест-системах с применением биотинилированных антител.

Известен патент WO 0216422 «Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi». Работа выполнена на Borrelia burgdorferi s.s. В клетках E.coli были экспрессированы как полный белок OspC, так и его фрагменты, содержащие аминокислотные остатки с 19 по 204, с 19 по 211, с 19 по 213. Получен гибридный белок, состоящий из аминокислотной последовательности зрелого OspC, слитой с аминокислотной последовательностью зрелого OspA, вследствие чего обе последовательности находятся в неацилированной форме и таким образом теряют соответствующие антигенные детерминанты нативных белков.

Известен патент US 5620862 «Methods for diagnosing early Lyme disease».

Работа выполнена на Borrelia burgdorferi s.s. В данной работе в качестве примера вектора для экспрессии указан GEX-2T с промотором PtaqI. Использование этого вектора позволяет получать полипептидные продукты в виде слитого белка с глютатион-S-трансферазой. Выше (US 5618533) уже были указаны проблемы, возникающие при их получении и использовании.

В литературе не описаны генно-инженерные конструкции, позволяющие получать OspC или его фрагменты, свойственные B.garinii, в частности свойственные западно-сибирским изолятам B.garinii.

Задачей изобретения является создание рекомбинантных полипептидов, несущих специфичные антигенные детерминанты белка OspC и фрагмента флагеллярного белка FlaB, свойственные изолятам Borrelia garinii, распространенным в России, в частности в западной Сибири.

Другой задачей изобретения является создание таких рекомбинантных плазмидных конструкций, которые бы обеспечивали:

а) эффективную строго контролируемую индуцируемую экспрессию встраиваемых структурных областей генов иммунодоминантных белков В. garinii (OspC и FlaB) в клетках E.coli,

б) последующую быструю и эффективную аффинную очистку рекомбинантных белков в широком диапазоне условий (денатурирующих и нативных) без использования дорогих реагентов,

с) отсутствие каких-либо ограничений на модификации антител при конструировании тест-системы.

Целевые белки, получаемые с помощью заявляемых плазмидных ДНК pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25, не содержат протяженных чужеродных аминокислотных последовательностей, вследствие чего не дают неспецифических сигналов в иммуноферментных анализах. Это, в свою очередь, обеспечивает повышение специфичности диагностики. Целевой белок, получаемый с помощью заявляемой плазмидной ДНК pREB9-H6-C25 экспрессируется целиком и содержит все антигенные детерминанты нативного белка.

В сконструированных плазмидах экспрессия клонированных генов находится под строгим контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis, благодаря чему практически исключается неиндуцируемая экспрессия клонированных генов, продукты которых могут быть токсичными для клетки хозяина. Это обеспечивает более высокую стабильность рекомбинантных плазмид и продуктивность рекомбинантных штаммов.

Для решения указанных задач были сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-F7 обеспечивает синтез специфичного для Borrelia garinii фрагмента белка FlaB в Rec⁺ штаммах Е.coli под воздействием индукторов, активирующих систему SOS-репарации. Она содержит:

• фрагмент размером 0,10 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность α-токсина Staphylococcus aureus (CAT) и восемь N-концевых аминокислотных остатков зрелого CAT;

• специфичный для Borrelia garinii фрагмент гена flaB размером 0,50 т.п.о.;

• нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена flaB, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6-ти гистидинов;

• BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 (SU1761805 A1) с внутренним уникальным сайтом рестрикции XmaI, содержащий ген bla β-лактамазы в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток E.coli к ампициллину, и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis;

• уникальные сайты рестрикции: XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI.

Ниже приведено словесное описание плазмиды pREB9-H6-F7, которая представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 1. Указанная плазмида имеет размер 4061 п.о., молекулярную массу - 2,8 мегадальтон и состоит из следующих элементов (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pREB9-H6-F7):

I. фрагмента, кодирующего сигнальную последовательность α-токсина Staphylococcus aureus и восемь первых N-концевых аминокислотных остатков зрелого CAT (позиции 195-296 п.о.) и содержащего кодон инициации трансляции (позиции нуклеотидов 195-197);

II. фрагмента гена flaB В.garinii (позиции 297-800 п.о.), который кодирует аминокислотную последовательность фрагмента белка FlaB В.garinii (100-267 аминокислотные остатки (а.о.) оригинальной последовательности). Нуклеотидная последовательность фрагмента гена flaB Borrelia garinii и кодируемая им аминокислотная последовательность фрагмента белка FlaB представлены в перечне последовательностей: SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3;

III. нуклеотидной последовательности в рамке считывания гена flaB, кодирующей аминокислотный остаток глицина (позиции 801-803) и полигистидиновый тракт (позиции 804-821 п.о.) - 6-гистидиновую последовательность для последующей очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на Ni²⁺-хелатном сорбенте (Ni²⁺-NTA-sepharose-Cl 6B). Глицин необходим, чтобы придать подвижность 6-гистидиновой последовательности;

IY. кодона терминации трансляции (позиции 822-824 п.о.);

Y. BamHI - EcoRI фрагмента ДНК плазмиды pIL-2/21 (825-194 п.о.), который содержит:

• фрагмент генома бактериофага лямбда (позиции 1662-1756 п.о.), который содержит Т0-терминатор транскрипции (позиции 1719-1745);

• фрагмент ДНК плазмиды pBR322 (позиции 1763-4059 п.о.) длиной 2297 п.о., соответствующий фрагменту (позиции 2065-4361 п.о.) оригинальной последовательности pBR322, который содержит:

а. участок начала репликации (позиция 2233 п.о.),

b. ген bla, кодирующий β-лактамазу, в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток E.coli к ампициллину;

с. регуляторную область гена recA Proteus mirabilis, обеспечивающую под воздействием индукторов (налидиксовая кислота, митомицин С, УФ-воздействие, радиоизлучение) инициацию транскрипции матричной РНК, кодирующей целевой продукт (позиции 44-194 п.о.).

Уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции имеют следующие координаты:

XmaI - (CCCGGG) 5-10, EcoRI (GAATTC) - 189-194; BstEII (GGTCACC) - 801-807, BamHI (GGATCC) - 825-830.

Фрагменты III, IV и V составляют вектор pREB9-H6.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-C25 обеспечивает синтез белка OspC В.garinii в RecA⁺ штаммах Е.coli под воздействием индукторов, активирующих систему SOS-репарации. Она содержит:

• фрагмент размером 0,66 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий белок OspC В.garinii и нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена ospC, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6-ти гистидинов;

• BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 (SU1761805 А1) с внутренним уникальным сайтом рестрикции XmaI, содержащий ген bla β-лактамазы в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток E.coli к ампициллину, и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis,

• уникальные сайты рестрикции: XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI.

Ниже приведено словесное описание плазмиды pREB9-H6-C25, которая представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 4. Указанная плазмида имеет размер 4097 п.о., молекулярную массу -2,8 мегадальтон и состоит из следующих элементов (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pREB9-H6-C25):

I. структурной части гена ospC В.garinii (позиции 195-836 п.о.), который кодирует аминокислотную последовательность белка OspC В.garinii. Нуклеотидная последовательность гена ospC Borrelia garinii и кодируемая им аминокислотная последовательность белка OspC представлены в перечне последовательностей: SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6;

II. нуклеотидной последовательности в рамке считывания гена ospC, кодирующей аминокислотный остаток глицина (позиции 837-839) и 6-гистидиновую последовательность (позиции 840-857 п.о.) - для последующей очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на Ni²⁺-хелатном сорбенте. Глицин необходим, чтобы придать подвижность 6-гистидиновой последовательности:

III. кодона терминации трансляции (позиции 858-860);

IV. BamHI - EcoRI фрагмента ДНК плазмиды pIL-2/21 (861-194), который содержит:

• фрагмент генома фага лямбда (позиции 1698-1792), который содержит Т0-терминатор транскрипции (позиции 1755-1781);

• фрагмент ДНК плазмиды pBR322 1799-4095 п.о. (2297 п.о.), соответствующий 2065-4361-фрагменту оригинальной последовательности pBR322, который содержит:

а. участок начала репликации (позиция 2269 п.о.),

Ь. ген bla β-лактамазы, в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток Е.coli к ампициллину;

с. регуляторную область гена recA Proteus mirabilis, обеспечивающую под воздействием индукторов (налидиксовая кислота, митомицин С, УФ-воздействие, радиоизлучение) инициацию транскрипции матричной РНК, кодирующей целевой продукт (позиции 44-194 п.о.).

Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами имеют следующие координаты:

XmaI - (CCCGGG) 5-10, EcoRI (GAATTC) - 189-194; BstEII (GGTCACC) - 837-843, BamHI - (GGATCC) 861-866.

Фрагменты II, III и IV составляют вектор pREB9-H6.

Перечень фигур иллюстративного материала:

Фиг.1. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pREB9-H6-F7.

Фиг.2. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pREB9-H6-C25.

Примеры конструирования плазмид.

Пример 1.

Получение вектора pREB9-H6 было осуществлено в два шага.

А) Плазмидную ДНК pIL-2/21 (SU 1761805 А1) гидролизовали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем отжигали и лигировали с олигонуклеотидами AATTCCGGCCGGGTCACCG и GATCCGGTGACCCGGCCGG. При этом происходила вырезка гена интерлейкина и его замена на линкерную последовательность, содержащую сайты узнавания рестриктазами Есо52I и BstEII.

Полученной плазмидой трансформировали (метод трансформации описан ниже) клетки Е.coli штамм DH5α (ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ ККМ) затем нарабатывали необходимое количество плазмидной ДНК для второго этапа (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, стр.98-106).

Б) На втором этапе плазмидную ДНК из А) гидролизовали рестриктазами BsfEII и BamHI, затем отжигали с олигонуклетидами 5'-GTCACCAT-CACCATCACCATTAAG и GATCCTTAATGGTGATGGTGATG. На этом этапе происходила встройка в плазмидную молекулу нуклеотидной последовательности, кодирующей а.о. глицина и 6-ти гистидинов (шестигистидиновый тракт). Полученным плазмидным вектором трансформировали клетки Е.coli штамм DH5α и после его наработки использовали для дальнейшего получения рекомбинантных плазмид pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25.

Гидролиз ДНК рестриктазами и сшивку фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигазы фага Т4 проводили согласно прилагаемым к препаратам ферментов инструкциям фирм-производителей.

Пример 2.

Получение плазмид pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25.

а) Введение фрагмента гена flaB и лидерной последовательности стафилококкового альфа-токсина в вектор pREB9-H6 и получение рекомбинантной плазмиды pREB9-H6-F7.

В качестве источника ДНК боррелий служили иксодовые клещи вида Ixodes persulcatus, инфицированные B.garinii NT29 и собранные в лесопарковой зоне ННЦ. Для амплификации структурных областей генов, кодирующих CAT S.aureus штамм Wood 46 (НИИ им. Н.Ф.Гамалеи) и белок FlaB B.garinii NT29 использовали две пары праймеров PR22+PR31 и PR87+PR88 соответственно. Нуклеотидные последовательности праймеров:

PR22 - 5'-GGAATTCATGAAAACACGTATAGTC-3'

PR31 - 5'-AGGTCACCATTTGTCATTTCTTCTTTTTC 3'

PR87 - 5'-GTTAACGGCACATATTCAGATGC-3'

PR88 - 5'-GAGGTGACCTAAATTTGCCCTTTGATC-3'

Для клонирования и экспрессии фрагмента гена flaB использовали бактериальный штамм E.coli C600 (ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ ККМ) и плазмидный вектор pREB9-H6, в котором экспрессия клонируемых генов осуществляется под контролем регуляторной области гена recA P.mirabilis.

Выделение ДНК из клещей. В качестве сорбента при выделении ДНК применяли коммерческий препарат диоксида кремния фирмы "Sigma" (USA)-товарное название "Силика".

Живого клеща помещали на 2 мин в раствор 70% этанола и подсушивали промоканием на фильтровальной бумаге. Край брюшка клеща отрезали лезвием бритвы на предметном стекле, после чего содержимое брюшной полости выдавливали в 50 мкл буфера №1 следующего состава: 4М гуанидин-изотиоцианат, 1% лаурил-саркозил натрия, 10 мМ ЭДТА, 0,01% 2-меркаптоэтанол. Смесь переносили в пробирку типа Еппендорф, выдерживали при 65°С 1 час и удаляли белки экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1). В водную фазу, содержащую ДНК, вносили 5 мкл суспензии силики (3 мг/мл) с сорбционной емкостью в отношении ДНК 2.5 мг/мл и инкубировали при комнатной температуре на шейкере в течение 30 мин. Диоксид кремния с сорбированой на нем ДНК осаждали центрифугированием при 2000×g 5 мин. Осадок дважды промывали буфером №1, дважды 70% этанолом и 96% этанолом и подсушивали. ДНК элюировали с сорбента с помощью инкубации в буфере ТЕ 8-10 мин при 50°С.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ Трис-Cl рН 8.3, 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 1.5 мМ MgCl₂, 0.03%(об/об) Твин 20, 10% (об/об) глицерин, по 10 pmol каждого праймера, по 0.05 мМ каждого их 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, 4 мкл раствора ДНК (10% всей ДНК, выделенной из клеща), 1.5 ед Taq-полимеразы фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск). Амплификацию фрагмента структурной области гена flab проводили под минеральным маслом в пробирках объемом 0,5 мл ('QSP", USA) на многоканальном термоциклере МС2 ("ДНК-технология", Москва) в режиме активного регулирования температуры реакционной смеси в следующих температурно-временных условиях каждого цикла: денатурация ДНК при 94°С 0,4 мин; отжиг праймеров с ДНК при 60°C 0,6 мин; полимеризация цепи ДНК при 72°С 0,6 мин; количество циклов - 30. На 31-ом цикле время отжига и полимеризации составляло 5 мин и 9 мин соответственно.

Для амплификации полноразмерной структурной области гена CAT использовали ДНК S.aureus шт. Wood 46, выделенную по следующей схеме. Клетки золотистого стафилококка S.aureus выращивают в 1 л культуры (в 4 пробирки, содержащие по 5 мл мясопептонного бульона, засевают клетки S.aureus и инкубируют в условиях аэрации 18 час при 37°С. 20 мл полученной культуры инокулируют в 1 л мясопептонного бульона и инкубируют в условиях аэрации еще 18 час при 37°С). Клетки золотистого стафилококка из 1 л культуры осаждают центрифугированием при 5000 g, 20 мин при 0-4°С и дважды промывают буфером А, содержащим 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 145 мМ NaCl, с помощью центрифугирования клеточной суспензии при 5000g, 15 мин при 0-4°C. Осадок клеток после последней промывки суспендируют в 12,5 мл буфера А и добавляют 1-1,5 мл раствора лизостафина (100 мкг/мл). Суспензию инкубируют 1 час при 37°С. В суспензию вносят ДСН (додецил-сульфат натрия) до конечной концентрации 1% и прогревают 5 мин при 60°С. ДНК депротеинизируют, экстрагируя равным объемом фенола, насыщенного 100 мМ Трис-HCl, рН 8,5, затем дважды экстрагируя смесью фенол-хлороформ (1:1) и дважды хлороформом. ДНК из водной фазы осаждают двумя объемами этанола в присутствии 0,2 М натрия ацетата. Осадок ДНК промывают 70%-м этанолом, подсушивают в вакуумном термостате при 20°С, растворяют в 10 мл ТЕ-буфера (10 мМ Трис - Cl рН 8.0, 1 мМ ЭДТА). К раствору добавляют рибонуклеазу А до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 1 час при 37°С. В инкубационную смесь вносят протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 3 часа при 37°С. ДНК очищают от белка, как описано выше. Заключительную водную фазу, содержащую ДНК, диализуют против 3-х смен ТЕ-буфера (по 300 объемов каждая).

Для ПЦР полноразмерной структурной области гена CAT использовали праймеры PR22 и PR31. Условия проведения амплификации были аналогичны выше описанным для гена flaB, но отжиг праймеров с ДНК проводили при 58°С, а время полимеризации цепи на каждом цикле составляло 1.5 мин.

Электрофорез ДНК проводили в 5% полиакриламидном или 0.8% агарозном гелях.

Выделение фрагментов ДНК из гелей. Фрагменты ДНК размером менее 700 п.о. экстрагировали из вырезанного участка пластины 5% ПААГ при помощи пассивной элюции в 5-10-кратный объем буфера №2 (2 мМ ЕДТА, 10 мМ Трис-Cl рН 8.0, 100 мМ NaCl) в течение 4-6 часов при 65°С с последующей депротеинизацией элюата фенолом и хлороформом. ДНК из водной фазы осаждали 2-мя объемами этанола в присутствии 20 мкг/мл гликогена. В случае разделения фрагментов ДНК в агарозном геле нужный фрагмент ДНК извлекали путем растворения соответствующего участка геля в равном объеме 8М NaClO₄. Полученный раствор инкубировали с суспензией силики в течение 30-40 мин на шейкере, после чего силику с сорбированной ДНК осаждали центрифугированием при 2000×g, 1 мин. Осадок силики ресуспендировали в 200 мкл 4М NaClO₄, вновь осаждали центрифугированием и повторяли промывку 4М NaClO₄ еще раз. Для того чтобы освободиться от NaClO₄, осадок «силики» дважды промывали 70% этанолом, затем обезвоживали 96% этанолом и высушивали. Сорбированную на «силике» ДНК элюировали с помощью инкубации на шейкере в 10-50 мкл буфера ТЕ (1 мМ ЕДТА, 10 мМ Трис-Cl рН 8.0) в течение 8-10 мин при 50°С. После удаления силики центрифугированием при 10000g 5 мин в растворе оказывалось около 70% исходной ДНК, не содержащей примесей в виде моно- или олигонуклеотидов.

Очищенный ампликон фрагмента гена flaB западно-сибирского изолята B.garinii NT29 лигировали с гидролизованной рестриктазой SspI последовательностью полноразмерной структурной области гена CAT. На продуктах лигирования проводили дополнительную ПЦР с использованием праймеров PR22 и PR88, при режиме: денатурация ДНК при 94°С 0,4 мин; отжиг праймеров с ДНК при 58°С 0,6 мин; полимеризация цепи ДНК при 72°С 0,6 мин; количество циклов - 12. Продукт амплификации гидролизовали рестриктазами EcoRI и Есо065I (изошизомер BstEII), очищали с помощью «силики», лигировали с вектором pREB9-6H, предварительно гидролизованным теми же рестриктазами, и получали целевую плазмиду pREB9-H6-F7. Рекомбинантной плазмидой pREB9-H6-F7 трансформируют клетки грамотрицательных бактерий с генотипом RecA⁺, чувствительных к налидиксовой кислоте (или другому веществу, используемому в качестве индуктора), например штаммы E.coli BL21 или С600, в которых проводят экспрессию рекомбинантного антигена. Синтез целевого белка в клетках определяют методом электрофореза в ПААГ, а его идентификацию проводят с помощью иммуноферментного анализа.

б) Получение плазмиды pREB9-H6-C25

В качестве источника ДНК боррелий служили те же иксодовые клещи вида Ixodes persulcatus, инфицированные B.garinii NT29 и собранные в лесопарковой зоне ННЦ. При клонировании гена ospC использовали те же методики, что и для гена flaB.

Для амплификации структурной области гена ospC использовали ДНК, выделенную из клещей, инфицированных B.garinii NT29. ПЦР проводили в два раунда. В первом раунде, проведенном с праймерами PR56 и PR57

(PR56: 5' ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATT 3'

и PR57 5' TTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC 3') при следующем температурном режиме:

1) денатурация - 94°С - 0,4 мин; отжиг - 58° - 0,6 мин; полимеризация 72°С - 0,8 мин; - 30 циклов;

2) денатурация - 94°С - 0,4 мин; отжиг - 58°C - 6 мин; полимеризация 72°С - 8 мин; - 30 циклов; - 31-ый цикл

Во втором раунде, состоящем из 8 циклов, в нуклеотидную последовательность ампликона вводили сайты узнавания для рестриктаз EcoRI и Есо065I, проводя ПЦР в присутствии праймеров PR47 и PR48, структура которых приведена ниже:

PR47: (5'-CGGAATTCATGAAAAAGAATACATTAAGTGC-3')

PR48:(5'-TTGGTGACCAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3').

ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация - 94°С - 0,4 мин; отжиг - 58°С - 0,6 мин; полимеризация 72°С - 0,8 мин; - 8 циклов.

Концентрация целевого ампликона после второго раунда составляла около 15 мкг/мл. После второго раунда ПЦР продукт амплификации гидролизовали рестриктазами EcoRI и Есо065I, очищали с помощью «силики» и лигировали с вектором pREB9-6H, предварительно гидролизованным теми же рестриктазами, в результате чего получали целевую плазмиду pREB9-Н6-С25.

Пример 3. Трансформация клеток Е.coli рекомбинантными плазмидными ДНК.

Ночную культуру клеток E.coli шт. С-600 пересаживали в 5 мл среды ЛБ (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, стр.390) и доращивали до оптической плотности (OD₅₉₅) 0.5-0.8 о.е. Полученную прекультуру пересаживали в 60 мл ЛБ и растили до плотности 0.5-0.6 о.е. Последующие этапы проводили при 4°С. Клетки собирали центрифугированием при 3000×g, 10 мин два раза промывали деионизованной водой, суспендировали в 100 мкл деионизованной воды. В суспензию клеток вносили лигазные смеси, содержащие плазмиды, из примеров 2 (а) и (б) и после пятиминутной инкубации подвергали электропорации. После электропорации трансформированные клетки сразу же переносили в 1.5 мл среды ЛБ, инкубировали 1 час при 37°С и затем концентрировали центрифугированием при 3000×g и высаживали на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин в концентрации 150 мкг/мл.

Из выросших клонов выделяют плазмидные ДНК pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25 и подтверждают окончательную структуру путем секвенирования.

Пример 4. Экспрессия рекомбинантного фрагмента флагеллярного белка FlaB и рекомбинантного белка OspC Borrelia garinii в клетках E.coli BL21.

Рекомбинантную плазмиду трансформируют в клетки E.coli BL21 (ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ ККМ). Бактериальные клетки культивируют в 5 мл LB-среды, содержащей ампициллин с начальной концентрацией 100 мкг/мл, до плотности 1.5-2.0 оптических единиц при длине волны 600 нм, затем добавляют налидиксовую кислоту до концентрации 50 мкг/мл и продолжают культивирование при интенсивной аэрации в течение 3-4 часов (налидиксовую кислоту можно заменить другим веществом, активирующим SOS-репарацию, например митомицином С). 1 мл клеточной суспензии центрифугируют и клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера (0.15 М Трис-HCl, рН 6.8, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2% ДСН, 5% глицерин, 0.1% бромфеноловый синий). 10 мкл полученного лизата наносят на 12% ПААГ (полиакриламидный гель) с 0.1% ДСН и проводят электрофорез. Пластину геля обрабатывают в течение 20 минут 10% ТХУ (трихлоруксусная кислота) и помещают на 30 минут в 0.25% раствор Кумасси R-250 в 20% этаноле. Затем выдерживают 1 час в 15% уксусной кислоте. Рекомбинантный белок наблюдается в виде четко выраженной окрашенной полосы размером около 20 кДа для FlaB и около 24 кДа для OspC. Уровень синтеза фрагмента флагеллярного белка В.garinii FlaB в сконструированном штамме Е.coli составляет при плотности культуры 10⁹ клеток/мл около 10 мг/л или 10-15% от общего количества клеточного белка, для OspC соответствующие показатели - 6 мг/л и 8-12%.

Пример 5. Очистка и иммуноферментный анализ очищенных рекомбинантных белков В.garinnii: фрагмента флагеллярного белка FlaB и белка OspC.

Клетки E.coli шт. BL21, содержащие плазмиду pREB9-H6-F7 или плазмиду pREB9-H6-C25, выращивают в 100 мл LB-среды и индуцируют налидиксовой кислотой, как описано в предыдущем примере. После окончания индукции бактериальные клетки собирают центрифугированием и лизируют в 5 мл 6 М гуанидингидрохлорида. Лизат центрифугируют при 40000×g 30 мин и надосадочную жидкость пропускают через хроматографическую колонку, содержащую аффинный сорбент - Ni²⁺-NTA-сефарозу 6В. Рекомбинантный белок (FlaB или OspC), содержащий С-концевой 6-ти гистидиновый тракт, остается связанным с сорбентом, в то время как бактериальные белки свободно проходят через колонку. Смыв рекомбинантных белков В.garinii FlaB или OspC осуществляют 0.5 М имидазолом рН 6,8. Выход рекомбинантного белка составляет в среднем 10 мг с одного литра индуцированной культуры клеток E.coli, степень чистоты более 95%.

Очищенные антигены наносят на нитроцеллюлозную мембрану и облучают в течение 2-3 минут ультрафиолетом с длиной волны λ_max 302 nm. Нитроцеллюлозу с пришитым фрагментом флагеллярного белка В. garinii FlaB или белком OspC помещают на 1 час в физраствор, содержащий 0.2% сухое обезжиренное молоко, затем в физраствор, содержащий 0.1% твин-20 и сыворотку больного Лайм-боррелиозом в разведении от 1:50 до 1:200 и инкубируют 1 час при легком покачивании. Затем промывают физраствором и вносят на один час в физраствор, содержащий конъюгат анитело-пероксидаза хрена против человеческих иммуноглобулинов М. Нитроцеллюлозную полоску промывают водой и помещают в раствор, содержащий 10% этанола, 0.1% Tris-HCl, pH 10.0, 0.05% перекиси водорода и 0.05% 2-хлорнафтола. Рекомбинантный антиген проявляется в виде хорошо окрашенных темных, почти черных пятен.

Рекомбинантный фрагмент FlaB специфически связывается с антителами сывороток всех больных Лайм-боррелиозом (были исследованы образцы сывороток от 38 больных Лайм-боррелиозом), но не реагируют с антителами сывороток здоровых лиц (было обследовано 10 человек). Из 8-ми исследованных сывороток больных сифилисом слабый положительный сигнал был получен только с антителами одной сыворотки. На исследованной ограниченной выборке сывороток чувствительность выявления антител к рекомбинантному FlaB составила 100%, специфичность - 97%.

Рекомбинантный OspC специфически связывается с антителами сывороток большей части 79% (11 из 14) больных Лайм-боррелиозом, но не реагирует с антителами сывороток здоровых лиц (было обследовано 10 человек) и сыворотками больных сифилисом (было исследовано 8). Чувствительность определения - 79%, специфичность определения - 100%.

Перечень нуклеотидных и аминокислотных последовательностей приведен в конце описания.

Изобретение относится к генно-инженерной биотехнологии и может быть использовано в медицине. Задачей изобретения является создание полипептидов, несущих специфичные антигенные детерминанты белка OspC и фрагмента флагеллярного белка FlaB, свойственные распространенному в России геновиду Borrelia garinii. Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-F7, обеспечивающая синтез фрагмента белка FlaB В. garinii, содержит следующие элементы: фрагмент размером 0,10 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность α-токсина Staphylococcus aureus (CAT) и восемь N-концевых аминокислотных остатков зрелого CAT; фрагмент гена flaB В. garinii размером 0,50 т.п.о.; нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена flaB, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6-ти гистидинов; BamHI - EcoR1 фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 с внутренним уникальным сайтом рестрикции Xmal, содержащий ген bla β-лактамазы и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis; уникальные сайты рестрикции XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI. Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-C25, обеспечивающая синтез белка OspC В. garinii, содержит следующие элементы: фрагмент размером 0,66 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий белок OspC В. garinii; нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена ospC, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6-ти гистидинов; BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 с внутренним уникальным сайтом рестрикции XmaI, содержащий ген bla β-лактамазы и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis; уникальные сайты рестрикции XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI. Использование изобретения позволяет повысить специфичность и, как следствие, точность диагностики заболеваний. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-F7, обеспечивающая синтез специфичного для Borrelia garinii фрагмента белка FlaB, содержащая фрагмент размером 0,10 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность α-токсина Staphylococcus aureus (CAT) и восемь N-концевых аминокислотных остатков зрелого CAT; специфичный для Borrelia garinii фрагмент гена flaB размером 0,50 т.п.о.; нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена flaB, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6 гистидинов; BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 с внутренним уникальным сайтом рестрикции Xmal, содержащий ген bla β-лактамазы и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis; уникальные сайты рестрикции XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI.2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-C25, обеспечивающая синтез белка OspC Borrelia garinii, содержащая фрагмент размером 0,66 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий белок OspC В. garinii; нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена ospC, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6 гистидинов; BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 с внутренним уникальным сайтом рестрикции Xmal, содержащий ген bla β-лактамазы и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis; уникальные сайты рестрикции XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI.