Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых нейроинфекций Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к лабораторной диагностике вирусных клещевых энцефалитов и иксодовых клещевых нейроборрелиозов.

Предложен набор для параллельного выявления РНК вирусов клещевых энцефалитов Tick-borne encephalitis virus и ДНК возбудителей клещевых нейроборрелиозов Borrelia burgdorferi sensu lato (далее B. burgdorferi s.l.) и Borrelia miyamotoi (далее B. miyamotoi) посредством петлевой изотермической амплификации.

Значительная часть территорий Российской Федерации является эндемичной по основным переносчикам клещевых инфекций - клещам видов I. persulcatus (таежный клещ) и I. ricinus (собачий клещ). Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) из семейства флавивирусов (Flaviviridae), преимущественно поражает центральную нервную систему в том числе с развитием тяжелых очаговых форм энцефалита, приводящих к инвалидности или летальному исходу. Боррелии B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi также вызывают неврологические симптомы, известные как нейроборрелиоз [Halperin JJ (June 2008). "Nervous system Lyme disease". Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2): 261-74, vi. doi:10.1016/j.idc.2007.12.009.PMID 18452800.S2CID 10590435].

Среднемноголетний показатель обращаемости с присасыванием клещей составляет около 500 тыс. человек за сезон активности, а заболеваемости клещевыми нейроинфекциями - более 2000 человек. К летальному исходу заболевание приводит в среднем в 1,5% случаев инфицирования [О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2021 году: Государственный доклад. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2022. - 340 с.]. Своевременная этиологическая диагностика нейроинфекции позволяет назначить эффективную этиотропную терапию.

В настоящее время для выявления специфических нуклеиновых кислот возбудителей клещевых нейроинфекций наиболее часто используют методы полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Известны коммерческие наборы реактивов для выявления РНК вируса клещевого энцефалита методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени: «РеалБест РНК ВКЭ» и «АмплиСенс TBEV-FL». Описан способ использования тест-системы для выявления вируса клещевого энцефалита методом двухстадийной
ОТ-ПЦР в реальном времени в различных биологических образцах [патент RU2744187, опубл. 03.03.2021].

Известны коммерческие наборы реагентов для обнаружения генетического материала возбудителей клещевых инфекций методом ПЦР для выявления ДНК боррелии B. burgdorferi:

- «АмплиСенс Borrelia burgdorferi sensu lato-FL»; «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.»

и «БОРРЕЛИО-ГЕН»;

для выявления ДНК боррелии B. miyamotoi:

- «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi»; и «АмплиСенс® Borrelia miyamotoi-FL»;

Известен набор для одновременного выявления как ДНК боррелии B. burgdorferi, так и РНК вируса клещевого энцефалита «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s. l./РНК ВКЭ».

Однако для выявления специфических нуклеиновых кислот комплекса возбудителей клещевых нейроинфекций B. burgdorferi s.l., B. miyamotoi и Tick-borne encephalitis virus, требуется использование разных наборов реагентов с различными режимами амплификации, что затрудняет выполнение тестирования всех патогенов в одной постановке и удлиняет сроки постановки этиологического диагноза.

Известны наборы для выявления генетического материала одновременно нескольких возбудителей клещевых инфекций методом мультиплексной ПЦР:

- «АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis / E. muris-FL», а также «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s. l./РНК ВКЭ».

Патент [RO133178, опубл. 29.03.2019] описывает набор реагентов, который позволяет проводить методом ОТ-ПЦР одновременное обнаружение 4-х патогенов, таких как B. burgdorferi s.l., Francisella tularensis, вирус Конго-Крымской геморрагической лихорадки и ВКЭ.

Набор олигонуклеотидных праймеров, описанный в патенте RU2629604, опубл. 30.08.2017, позволяет одновременно идентифицировать вирус клещевого энцефалита вместе с 3-мя другими клещевыми инфекционными патогенами (вирус лихорадки Западного Нила, боррелии эритемного типа и риккетсии) в образцах клещей методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Однако в этих наборах также отсутствует возможность выявления широко распространенного возбудителя безэритемной формы нейроборрелиоза B. miyamotoi.

Описана тест-система [CN114317837, опубл. 12.04.2022] для обнаружения 18-ти различных патогенных вирусных инфекций, включая вирус клещевого энцефалита методом мультиплексной ПЦР с дальнейшим переносом ампликонов на генный чип для визуальной интерпретации результата реакции с помощью зондов, специфичных для каждого отдельного патогена.

Все описанные наборы для ПЦР тестирования подразумевают наличие специального оборудования (термоциклеров или чип-ридеров), соответствующих условий лабораторных помещений и высокой квалификации персонала, занимающегося исследованиями. Проведение исследования включает обязательный этап предварительного выделения нуклеиновых из тестируемого образца, а также требуется дополнительный этап обратной транскрипции для детекции РНК вируса клещевого энцефалита. Для получения результатов анализа требуется не менее 2-4 часов рабочего времени, и не предусматривается возможность использования в полевых условиях.

Известны наборы реагентов для обнаружения клещевых инфекций в биопробах с использованием изотермической амплификации, позволяющие проводить анализ без использования термоциклеров с возможностью визуальной детекции и не требующих специальных лабораторных условий.

Патент KR102219895, опубл. 24.02.2021, описывает тест-систему на основе петлевой изотермической амплификации (LAMP) для поиска риккетсий Orientia tsutsugamushi передаваемой личинками красно-телковых клещей (Trombididae), которая подразумевает использование 6 олигонуклеотидов, включая петлевые с детекцией результата визуально по цвету смеси.

Однако данный набор предназначен только для выявления одного возбудителя, ареал распространенности которого ограничен Азиатско-Тихоокеанским регионом и практически не регистрируется в России.

Патент US10072309, опубл. 11.09.2018, описывает реагенты для мультиплексного обнаружения до 20 возбудителей различных инфекций: бактерий, вирусов и простейших методом изотермической амплификации с обратной транскрипцией. Данный патент описывает возможность обнаружения одного из потенциальных зоонозных возбудителей нейроинфекции - японского вирусного энцефалита.

Вместе с тем, основными переносчиками японского энцефалита являются комары Culex tritaeniorhynchus, практически не распространенные на территории России. При этом изобретение не включает примеры выявления боррелиозов и вирусного клещевого энцефалита Tick-borne encephalitis virus.

Известны реагенты и способ [CN101967513, опубл. 09.02.2011], где предлагается использование одновременно 12 специфических наборов внешних и внутренних праймеров в трех комплектах для петлевой изотермической амплификации с целью раздельной детекции продуктов в последующей реакции методом гель-электрофореза конкретных 3-х патогенных видов боррелий группы B. burgdorferi s. l. (B. Burgdorferi sensu stricto, B. garinii и B. afzelii).

Вместе с тем, для назначения профилактических препаратов и лечения клещевых боррелиозов не известна какая-либо зависимость от конкретного геновида B. burgdorferi s. l. и определение конкретного возбудителя семейства B. burgdorferi s. l. не имеет клинического значения. Вместе с тем, в наборе отсутствуют реактивы для выявления возбудителя безэритермной формы клещевого боррелиоза B. miyamotoi и вируса клещевого энцефалита.

Близким к предлагаемому изобретению является способ и набор для обнаружения вирусных клещевых энцефалитов с использованием изотермической амплификации с обратной транскрипцией и возможностью визуальной детекции результата реакции в крови человека и биологических образцах грызунов [Hayasaka D., Aoki K., Morita K. Development of simple and rapid assay to detect viral RNA of tick-borne encephalitis virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification //Virology journal. - 2013. - Т. 10. - №. 1. - С. 1-10].

Данный набор не позволяет одновременно проводить тестирование на выявление возбудителей клещевых нейроборрелиозов. Кроме того, в представленной статье не показана возможность выявления вирусов клещевого энцефалита в биологических образцах инфицированных пациентов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототип) является патент RU2763595, опубл. 30.12.2021, «Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых боррелиозов», позволяющий обнаружить генетический материал одновременно двух возбудителей клещевых боррелиозов B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi с использованием изотермической амплификации. Набор реагентов содержит внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. burgdorferi s. l., и B. miyamotoi (представлены в таблице ниже как 1.1-1.6 и 2.1-2.6 соответственно), ДНК полимеразу Bst 2.0 или Bsm и соответствующий изотермический Bst 2.0 или Bsm буфер, а также MgSO₄ или MgCl₂ соответственно, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированную воду, положительный и отрицательный контроли, а также флуоресцентные красители EVA-green для приборной детекции или бромистый этидий для визуальной детекции результатов анализа. Данный набор реагентов обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить тестирование без использования термоциклеров как в лабораторных, так и в полевых условиях, в течение не более 60 мин. При этом используется недорогое и простое оборудование, такое как нагревательный блок или водяная баня. Таким образом, такой набор может использоваться для быстрого лабораторного подтверждения этиологии инфекции в условиях ограниченных ресурсов.

Недостатком данного набора является отсутствие возможности одновременно с выявлением возбудителей нейроборрелиозов выполнять тестирование на вирус клещевого энцефалита.

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка набора реагентов, позволяющего в одной аналитической постановке осуществлять детектирование всех трех основных возбудителей клещевых нейроинфекций: B. burgdorferi s. l., B. miyamotoi и Tick borne encephalitis virus.

Технический результат изобретения достигается тем, что в наборе реагентов для обнаружения возбудителей клещевых нейроинфекций, содержащем специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. burgdorferi s. l. и следующие специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. miyamotoi:

F3: 5’-TTCTAACAAAGGACAATATTCCT-3’;

B3: 5’-TTCATTTAAGGGGAAACGATT-3’;

FIP: 5’-CGTTTTCTCTAGCTCGATTGGGAAACACGACCCAGAAATTGACA-3’;

BIP: 5’-CGATATTACGCCACTGACTTCACATGGTTTTTTGTTTTCAGGATCA-3’;

LF: 5’-TGTGCAACATTTGTGGTTG-3’;

LB: 5’- TCACTAAGTCTCAGTGAAAGA-3’,

ДНК полимеразу Bsm вместе с соответствующим реакционным буфером, а также MgCl₂, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированную воду, положительный и отрицательный контроли, краситель бромистый этидий для визуальной детекции результата анализа или флуоресцентный краситель EVA-green для приборной детекции, новым является то, что набор содержит следующие специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. burgdorferi s. l.:

F3: 5’- AGCCTTTAAAGCTTCGCT-3’

B3: 5’- TTCATTCACGCAGTGTCG-3’

FIP: 5’- GGCCGGTTACTTATCATCGTCTTTCTGCGTCTTATTAGTTAGTTGG-3’

BIP: 5’- GAGAGGGTGAACGGTCACACCATTGCGGAAGATTCTTAGC-3’

LF: 5’- GGTAGGCATTTACCCCA-3’

LB: 5’- AGATACGGTCCAGACTCC-3’,

специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления РНК Tick borne encephalitis virus:

F3: 5’-GAAGACGGCATCCTTCAC-3’

B3: 5’-CACGGTAGAGGCAGATCA-3’

FIP: 5’-TCTGCANAACAAGGACACATCTCGTCTCCTCAGAAAANACCA-3’

BIP: 5’-GACTTGGCTCAGACTGTCATTCTGAACCAGTCACGATGGAC-3’

LF: 5’-CATAGTCCCCCATNGTCAANA-3’

LB: 5’-GAGCTNGACAAGACTCTGGAACAC-3’,

где N = G или A или C или T,

а также обратную транскриптазу.

Таблица 1 - Праймеры для выявлений клещевых нейроинфекций прототипа и заявляемого изобретения № Возбудитель Праймер Последовательность 5’-3’ 1.1 B. burgdorferi s. l. (прототип) F3 GCTGTTGAGCTCCTTCTTG 1.2 B3 CACCAGCGTCACTTTCAG 1.3 FIP TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA 1.4 BIP ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC 1.5 LF TGCTCCCACATGAACTCTTAA 1.6 LB AAGGAGCTCAGGCTGCTCAGA 2.1 B. miyamotoi F3 TTCTAACAAAGGACAATATTCCT 2.2 B3 TTCATTTAAGGGGAAACGATT 2.3 FIP CGTTTTCTCTAGCTCGATTGGGAAACACGACCCAGAAATTGACA 2.4 BIP CGATATTACGCCACTGACTTCACATGGTTTTTTGTTTTCAGGATCA 2.5 LF TGTGCAACATTTGTGGTTG 2.6 LB TCACTAAGTCTCAGTGAAAGA 3.1 B. burgdorferi s. l. F3 AGCCTTTAAAGCTTCGCT 3.2 B3 TTCATTCACGCAGTGTCG 3.3 FIP GGCCGGTTACTTATCATCGTCTTTCTGCGTCTTATTAGTTAGTTGG 3.4 BIP GAGAGGGTGAACGGTCACACCATTGCGGAAGATTCTTAGC 3.5 LF GGTAGGCATTTACCCCA 3.6 LB AGATACGGTCCAGACTCC 4.1 Tick borne encephalitis virus F3 GAAGACGGCATCCTTCAC 4.2 B3 CACGGTAGAGGCAGATCA 4.3 FIP TCTGCANAACAAGGACACATCTCGTCTCCTCAGAAAANACCA 4.4 BIP GACTTGGCTCAGACTGTCATTCTGAACCAGTCACGATGGAC 4.5 LF CATAGTCCCCCATNGTCAANA 4.6 LB GAGCTNGACAAGACTCTGGAACAC * где N = T или C или G или A

Сущность изобретения

Для выполнения реакции LAMP на выявление возбудителей клещевого боррелиоза и вирусного клещевого энцефалита готовят смеси, содержащие праймеры на B. burgdorferi s. l. и B. miyamotoi и на Tick-borne encephalitis virus в конченых концентрациях F3, B3 - 0,2 мкМ, FIP, BIP - 1,6 мкМ, LF, LB - 0,4 мкМ, 0,8 М бетаин, 1,4 мМ dNTP, 8 ед. Bsm полимеразы, 100 ед. обратной транскриптазы, 4 мМ MgCl₂, и 1X реакционный буфер. Для детекции результатов реакции к смеси до амплификации добавляют флуоресцентный краситель 0,4X Eva green (если детекция будет осуществляться в реальном времени с использованием реал-тайм амплификатора) или 3 мкг/мкл бромистого этидия (если детекция будет осуществляться визуально при дневном или УФ свете) после проведения реакции амплификации. Возможно добавление бромистого этидия к смеси, содержащей краситель Eva green. К реакционной смеси добавляется выделенная ДНК или РНК в объеме 5 мкл. Объем смеси доводится до 25 мкл деионизированной водой в расчете на 1 образец.

Для проведения анализа заявляемые реагенты делят на 3 флакона. Состав флаконов №1 и №2 представлен следующими компонентами: Bsm буфер, MgCl₂, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированная вода, флуоресцентный краситель EVA-green для приборной детекции. Флакон №1, предназначенный для выявления B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi, содержит праймеры 2.1-2.6 и 3.1-3.6 (см. таблица 1) соответственно. Флакон № 2, предназначенный для выявления Tick-borne encephalitis virus, содержит праймеры 4.1-4.6 (там же). Флакон № 3 содержит ферментную смесь из ДНК полимеразы Bsm и обратной транскриптазы. В случае визуальной детекции при дневном или УФ свете во флаконы 1 и 2 добавляют 3 мкг/мкл бромистого этидия после проведения реакции амплификации.

Использование изобретения осуществляется следующим образом.

Для проведения анализа на выявление возбудителей клещевых нейроинфекций используют клещей или биологический материал пациента. Выделение нуклеиновых кислот проводят с использованием любого коммерческого набора для экстракции ДНК и РНК из анализируемых образцов.

С учетом количества проб и контрольных материалов в расчете на 1 исследуемый образец добавляется по 19 мкл реакционной смеси из флаконов №1 и №2 в предварительно подготовленные чистые пробирки объемом 1,5 мл для выявления боррелий и энцефалита, соответственно. Далее, в каждую пробирку из флакона № 3 вносится по 1,3 мкл ферментной смеси из ДНК полимеразы Bsm и обратной транскриптазы в расчете на 1 образец. В заранее подготовленные по количеству исследуемых проб микропробирки объемом 0,2 мл добавляется по 5 мкл образцов и по 20 мкл подготовленной реакционной смеси. Для выполнения изотермической амплификации микропробирки помещаются в прибор, поддерживающий постоянную температуру в диапазоне 55-95°C.

ПРИМЕР 1

Выявление возбудителей боррелиоза и вирусного клещевого энцефалита в образцах ДНК и вирусного энцефалита в образцах РНК, выделенных из клещей.

Для выполнения реакции LAMP готовили смеси из флаконов № 1 и № 3 и из флаконов № 2 и № 3. К подготовленным смесям добавлялось по 5 мкл ДНК/РНК. Инкубация образцов проводилась на real-time амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad) при постоянной температуре 60°C в течение 60 мин. Регистрация результата проводилась в реальном времени по подъему кривых флуоресценции. Результаты реакции LAMP сравнивались с результатами исследования образцов методом ПЦР-РВ при использовании коммерческих наборов для тестирования «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s. l./РНК ВКЭ» и «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» компании Вектор-Бест. Итоги сравнения результатов тестирования клещевых боррелиозов и вирусных энцефалитов методами LAMP и ПЦР представлены в таблице 2. Пример выявления таких образцов изображен на Фиг.1.

Таблица 2 - Сравнение результатов тестирования клещевых боррелиозов и вирусных энцефалитов методами LAMP и ПЦР № образца Результат тестирования методом ПЦР Результат тестирования методом LAMP B. burgdorferi s.l. B. miyamotoi ВКЭ B. burgdorferi s.l.+
B. miyamotoi ВКЭ К54 Не выявлен Выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен К94 Выявлен Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен КЛ8203 Выявлен Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен КЛ8205 Выявлен Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен КЛ7970 Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен Выявлен КЛ8053 Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен Выявлен КЛ8076 Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен Выявлен КЛ8178 Не выявлен Не выявлен Выявлен Не выявлен Выявлен КЛ8193 Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен КЛ8202 Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен КЛ8209 Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен КЛ8210 Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен Не выявлен

ПРИМЕР 2

Выявление возбудителей боррелиоза и вирусного клещевого энцефалита в образцах цельной крови и ликвора.

Образцы крови и ликвора взяты у пациентов, не имеющих нейроинфекций в анамнезе. Образцы контаминировали десятикратными разведениями плазмидных ДНК, специфическими для B. burgdorferi s.l., B. miyamotoi и Tick borne encephalitis virus.

Для выполнения реакции LAMP готовили смеси из флаконов № 1 и № 3 и из флаконов № 2 и № 3. Образцы для анализа готовили путем контаминации проб ликвора плазмидными ДНК боррелиозов и энцефалитов. Аналогично готовили пробы крови. К смесям добавлялось по 5 мкл подготовленных образцов. В качестве отрицательных контролей использовалась плазмидная ДНК, не содержащая последовательности клещевых нейроинфекций, и пробы крови и ликвора, не контаминированные плазмидными ДНК. Положительными контролями являлись плазмидные ДНК B. burgdorferi s.l. с концентрацией аналита 46500 копий/мкл, B. miyamotoi с концентрацией аналита 36100 копий/мкл и Tick-borne encephalitis virus с концентрацией аналита 35800 копий/мкл. Инкубация образцов проводилась на real-time амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad) при постоянной температуре 60°C в течение 60 мин. По окончании инкубации к образцам добавлено по 3 мкг/мкл бромистого этидия. Регистрация результата с использованием ликвора проводилась в реальном времени по подъему кривых флуоресценции и по изменению цвета смеси/свечении проб при их облучении ультрафиолетом. При использовании цельной крови образцы только освещались ультрафиолетом.

Результаты тестирования отображены в таблице 3 и на Фиг.2, 3, 4 и 5.

Таблица 3 - Результаты тестирования на наличие нейроинфекций в образцах крови и ликвора Образец Результат реакции LAMP заявляемым набором (положительный результат достигается в течение 30 мин) Отр. плазмидная ДНК Не выявлен Ликвор без плазмид Не выявлен Цельная кровь без плазмид Не выявлен Ликвор+B. burgdorferi s.l. Выявлен Цельная кровь+B. burgdorferi s.l. Выявлен Ликвор+B. miyamotoi Выявлен Цельная кровь+B. miyamotoi Выявлен Ликвор+Tick-borne encephalitis virus Выявлен Цельная кровь+Tick-borne encephalitis virus Выявлен Плазмидная ДНК B. burgdorferi s.l. Выявлен Плазмидная ДНК B. miyamotoi Выявлен Плазмидная ДНК Tick borne encephalitis virus Выявлен

Таким образом, приведенное выше описание изобретения подтверждает возможность детектирования всех трех основных возбудителей клещевых нейроинфекций (B. burgdorferi s. l., B. miyamotoi и Tick borne encephalitis virus) заявляемым набором реагентов в одной аналитической постановке, при этом на детекцию затрачивается не более 40-60 минут.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень

последовательностей.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-01-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022135052</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-29</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-29</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью &quot;Нуклеотест&quot; (ООО

&quot;Нуклеотест&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>&quot;Nucleotest&quot; Limited Liability Company

(&quot;Nucleotest&quot;) LLC</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор реагентов для обнаружения

возбудителей клещевых нейроинфекций</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>18</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia

burgdorferi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcctttaaagcttcgct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia

burgdorferi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcattcacgcagtgtcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>46</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..46</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia

burgdorferi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggccggttacttatcatcgtctttctgcgtcttattagttagttgg</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia

burgdorferi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagagggtgaacggtcacaccattgcggaagattcttagc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia

burgdorferi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtaggcatttacccca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia

burgdorferi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agatacggtccagactcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia miyamotoi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttctaacaaaggacaatattcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia miyamotoi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcatttaaggggaaacgatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>44</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia miyamotoi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgttttctctagctcgattgggaaacacgacccagaaattgaca</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>46</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..46</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia miyamotoi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgatattacgccactgacttcacatggttttttgttttcaggatca</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia miyamotoi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtgcaacatttgtggttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Borrelia miyamotoi</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcactaagtctcagtgaaaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Tick-borne encephalitis

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaagacggcatccttcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Tick-borne encephalitis

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacggtagaggcagatca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>42</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..42</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Tick-borne encephalitis

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tctgcayaacaaggacacatctcgtctcctcagaaaaracca</INSDS

eq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Tick-borne encephalitis

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacttggctcagactgtcattctgaaccagtcacgatggac</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Tick-borne encephalitis

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catagtcccccatrgtcaara</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="18">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Tick-borne encephalitis

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagctygacaagactctggaacac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к лабораторной диагностике вирусных клещевых энцефалитов и иксодовых клещевых нейроборрелиозов. Представлен набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых нейроинфекций. Набор содержит специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. burgdorferi s. l., ДНК B. miyamotoi и РНК Tick borne encephalitis virus; ДНК полимеразу Bsm вместе с соответствующим реакционным буфером, а также MgCl₂, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированную воду, положительный и отрицательный контроли, краситель бромистый этидий для визуальной детекции результата анализа или флуоресцентный краситель EVA-green для приборной детекции, а также обратную транскриптазу. Изобретение позволяет в одной аналитической постановке осуществлять детектирование всех трех основных возбудителей клещевых нейроинфекций: B. burgdorferi s. l., B. miyamotoi и Tick borne encephalitis virus. 5 ил., 3 табл., 2 пр.

Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых нейроинфекций, содержащий специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. burgdorferi s. l. и следующие специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. miyamotoi:

F3: 5’-TTCTAACAAAGGACAATATTCCT-3’;

B3: 5’-TTCATTTAAGGGGAAACGATT-3’;

FIP: 5’-CGTTTTCTCTAGCTCGATTGGGAAACACGACCCAGAAATTGACA-3’;

BIP: 5’-CGATATTACGCCACTGACTTCACATGGTTTTTTGTTTTCAGGATCA-3’;

LF: 5’-TGTGCAACATTTGTGGTTG-3’;

LB: 5’- TCACTAAGTCTCAGTGAAAGA-3’,

ДНК полимеразу Bsm вместе с соответствующим реакционным буфером, а также MgCl₂, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированную воду, положительный и отрицательный контроли, краситель бромистый этидий для визуальной детекции результата анализа или флуоресцентный краситель EVA-green для приборной детекции, отличающийся тем, что набор содержит следующие специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления ДНК B. burgdorferi s. l.:

F3: 5’- AGCCTTTAAAGCTTCGCT-3’

B3: 5’- TTCATTCACGCAGTGTCG-3’

FIP: 5’- GGCCGGTTACTTATCATCGTCTTTCTGCGTCTTATTAGTTAGTTGG-3’

BIP: 5’- GAGAGGGTGAACGGTCACACCATTGCGGAAGATTCTTAGC-3’

LF: 5’- GGTAGGCATTTACCCCA-3’

LB: 5’- AGATACGGTCCAGACTCC-3’,

специфические внешние, внутренние и петлевые праймеры для выявления РНК Tick borne encephalitis virus:

F3: 5’-GAAGACGGCATCCTTCAC-3’

B3: 5’-CACGGTAGAGGCAGATCA-3’

FIP: 5’-TCTGCANAACAAGGACACATCTCGTCTCCTCAGAAAANACCA-3’

BIP: 5’-GACTTGGCTCAGACTGTCATTCTGAACCAGTCACGATGGAC-3’

LF: 5’-CATAGTCCCCCATNGTCAANA-3’

LB: 5’-GAGCTNGACAAGACTCTGGAACAC-3’,

где N = G или A или C или T,

а также обратную транскриптазу.