СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА (ОФР) Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 C12Q1/18 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию биологической жидкости, в частности крови, и может быть использовано в гнойной хирургии и в комбустиологии при лечении пациентов с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией.

Проблема гнойной инфекции в современной комбустиологии имеет особую значимость. Среди инфекционных осложнений наибольшую опасность представляет ранний сепсис, характеризующийся молниеносным развитием, тяжелым течением и крайне высокой летальностью. По данным ННИИТО в течение последнего десятилетия 20 века основной причиной смерти тяжелообожженнных, у которых термическая травма сопровождалась развитием тяжелого и крайне тяжелого шока, остается генерализованная инфекция, 60% случаев которой составляет ранний сепсис. Многие авторы указывают на то, что сепсис ранних периодов ожоговой болезни является, как правило, грамотрицательным и наиболее часто вызывается синегнойной палочкой (Пылаева С.И., Матусис З.Е., Пахомов С.П., Кораблев С.Б., Гординская Н.А., Самойлов В.А., Храпункова Г.Г. «К проблеме профилактики гнойно-септических осложнений у тяжелообожженных». Материалы 3 Всесоюзной конференции по проблеме термической травмы «Современные средства 1 помощи и методы лечения ожоговой болезни», Москва, 1986 г., с.200-201).

Устойчивость синегнойной палочки во внешней среде, непритязательность к питанию, природная резистентность к антибактериальным препаратам определяют вероятность широкого распространения ее в больничной среде и формирования госпитальных штаммов, что превращает ожоговый стационар в "эпидемиологический очаг" синегнойной инфекции.

В связи с этим, госпитальная синегнойная инфекция представляет серьезную лечебную и эпидемиологическую проблему.

Такая ситуация требует активного поиска эффективных средств и методов борьбы с госпитальной микрофлорой в клинике термической травмы. Развитие и совершенствование новейших медицинских технологий привело к широкому внедрению в медицинскую практику различных методов озонотерапии, с успехом применяемых при лечении большого спектра заболеваний. Широта использования озона обусловлена, в том числе, неспецифическим бактерицидным и противовоспалительным действием. Однако до настоящего времени идут споры о методологии применения озона для достижения оптимального антибактериального эффекта, о спектре антибактериального действия озона в различных средах - носителях.

Известен способ исследования действия озонированного физиологического (ОФР) раствора на рост микроорганизмов (см. Гречко В.Н. «Влияние озона на патогенную микрофлору гнойных ран». // Тез. докладов 3 Всероссийской научно-практической конференции «Озон и методы эфферентной терапии в медицине» г. Н.Новгород. - 1998 г. - С. - 28-29).

Автором было изучено влияние ОФР на микрофлору, наиболее часто высеваемую с поверхности гнойных ран (S.aureus, S.epidermidis, S.haemolyticus, E.coli, E.cloaceae, P.mirabilis, P.vulgaris, P.aeruginosa). Суточная культура микроорганизмов засевалась газоном на чашку Петри с голодным агаром. Далее культуры контрольной группы омывали 4 мл 0,89% NaCl и помещали в термостат. Культуры опытных серий омывали 4 мл приготовленного ex tempore 0,89% NaCl (раствор готовился путем барботирования в течение часа 400 мл физиологического р-ра озонокислородной смесью с концентрацией озона на выходе 5 мг/л).Чашки также ставили в термостат. Оценку результатов проводили количественно по числу выросших колоний. В контрольных сериях имел место сплошной рост микрофлоры на чашке, неподдающийся подсчету. В опытной серии имело место прорастание отдельных групп колоний.

Недостатками известного способа являются:

а) неизвестны исходные биологические свойства микроорганизмов;

б) неизвестна исходная посевная доза микроорганизмов;

в) омывание чашек с посевом могло механически удалить какую-то часть микробных клеток;

г) оценка результатов визуальная, приблизительная.

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ оценки антибактериального действия озонотерапии путем исследования действия ОФР на рост бактерий, включающий подготовку штамма для исследования, воздействие ОФР и оценку результатов (см. Г.В.Родоман, В.Н.Оболенский, Л.А.Лаберко, А.Л.Коротаев, В.Г.Никитин, И.Р.Сумеди, Т.В.Черненькая, А.К.Иванов "Проблемы комбинированной антибактериальной терапии хирургических инфекций" // интернет сайт "Эверест" автоматизированная информационная система для больниц и поликлиник ГКБ №13 г.Москва).

Авторами было проведено экспериментальное исследование антибактериального действия ОФР на музейные штаммы микроорганизмов S.aureus ATCC 25923, E.coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853. Готовились убывающие концентрации микроорганизмов в физиологическом растворе 10⁸ 10⁷ 10⁶ 10⁵, т.о. степень обсемененности опытных образцов соответствовала критическому уровню бактериальной контаминации ран или превышала его. В каждую пробу с микроорганизмами добавляли ОФР в соотношении 1:1. Концентрация озона в растворе соответствовала 20 мкг/мл (20 мг/л). В качестве контроля использовали пробы с аналогичным содержанием микроорганизмов, но добавляли неозонированный физиологический раствор в том же объеме. После 20 минутной экспозиции все пробы подвергались бактериологическому исследованию путем посева на твердые питательные среды. В образцах, подвергнутых воздействию озона, роста микрофлоры не было выявлено ни в одном из случаев вне зависимости от родовой принадлежности микроорганизмов. При этом в контрольных пробах отмечен рост микрофлоры в соответствие с исходным уровнем микробной обсемененности. Аналогичные результаты были получены в сериях с содержанием озона в растворе 10 мкг/мл (10 мг/л).

Известный способ имеет следующие недостатки:

а) применяемые авторами насыщающие концентрации озона для физиологического раствора - 10-20 мг/л могут быть опасны для парентерального использования вследствие повреждающего действия на эндотелий сосудов, кроме того, в экспериментальных исследованиях Т.А.Васиной и соавт. 1995 г. (Т.А.Васина, Е.Б.Лазарева, В.Е.Шестоперов, Б.М.Богось «Коррекция антибактериальной терапии при лечении озоном гнойно-воспалительных процессов в неотложной хирургии». // Тезисы докладов 2 Всероссийской научно-практической конференции «Озон в биологии и медицине». - Н.Новгород. - 1995. - С.32), отмечалась инактивация антибиотиков при их сочетанном применении с озоном концентрации свыше 6 мг/л;

б) в настоящее время ОФР, благодаря бактерицидному действию, используется в качестве антисептического средства в основном для наружного применения. В этой ситуации высокие концентрации озона в физиологическом растворе (ОЗ)=2-4-6 мг/л обеспечивают максимальное бактерицидное воздействие на микрофлору ран. В этом отношении показательны исследования Кожинова В.Ф и соавт. («Озонирование воды», Москва. - 1974.), которые свидетельствуют о высокой бактерицидности озона в отношении микстной микрофлоры в концентрациях 0,95-2,2 мг/л. Эти данные подтверждают антисептические свойства озона для условий его непосредственного контакта с микрофлорой в водной среде.

Для нашей конкретной ситуации, когда у пациентов диагностируют септическое состояние, подтверждаемое выделением из крови конкретного возбудителя - синегнойной палочки госпитального происхождения, антибиотикотерапия не всегда эффективна вследствие высокой устойчивости микроорганизма к антибактериальным средствам. Комплексная терапия, включающая применение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 10-20 мг/л, не приемлема, т.к. введение в вену высококонцентрированных растворов окислителей чревато осложнениями в виде быстропрогрессирующих флебитов.

Задачей предлагаемого изобретения является возможность включения озонотерапии с внутривенным введением ОФР с концентрациями озона 1 мг/л, 3 мг/л и 5 мг/л в комплексное лечение пациентов с термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией.

Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки антибактериального действия ОФР, включающем исследование действия ОФР на рост микроорганизмов и оценку результатов, из крови больного с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией, выделяют штамм микроорганизма, определяют его исходные свойства, выращивают на скошенном агаре, заливают ОФР с концентрацией озона 1 мг/л, 3 мг/л, 5 мг/л и инкубируют в термостате в течение 24 часов, из суточных культур готовят стандартные взвеси, содержащие 5×10⁵ КОЕ/мл, которые инкубируют в питательной среде в условиях микробиологического анализатора в течение 18 часов, при этом осуществляют динамическое измерение оптической плотности среды с построением графиков кривых роста бактерий, по которым производят оценку антибактериального действия ОФР на штамм микроорганизма, определяя удлинение ЛАГ-фазы, время удвоения численности бактерий и количество микроорганизмов в 1 мл питательной среды.

Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», т.к. в процессе проведения патентно-информационных исследований не выявлено сведений, порочащих новизну способа, а также технических решений с существенными признаками предлагаемого способа. Известна методика «Модели роста», заложенная в программу «ВАСТ 3.5» (АОЗТ «Аналитика», г.Москва; свидетельство о пригодности к использованию в здравоохранении Российской Федерации №055 от 05.09.2000 г., действительное до 05.09.2005 г., утверждено Приказом МЗ РФ №359 от 11.12.1998 г.). Программа предназначена для автоматизации измерений и выполнения расчетов на комплексе iEMS Reader (Labsystems, Финляндия) - персональный компьютер IBM PC/AT совместимый.

Раздел программы "Модели роста" предназначен для построения кинетических моделей роста микроорганизмов в решении различных научно-практических задач (в т.ч. изучения антимикробного действия различных антимикробных препаратов).

Для подтверждения клинической эффективности проводимой озонотерапии, в т.ч. ее антибактериальных свойств, исследовали воздействие тех же концентраций озона в физиологическом растворе 1-3-5 мг/л на рост госпитальных синегнойных бактерий в условиях in vitro. Результатам оценки предшествует выделение микроорганизма из крови пациента с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией, определение исходных биологических свойств штамма, выращивание на скошенном агаре, контакт его с ОФР с концентрацией озона 1 мг/л, 3 мг/л, 5 мг/л в термостате в течение 24 часов, повторное выращивание на скошенном агаре и приготовление стандартной взвеси, содержащей 5×10⁵ КОЕ/мл с последующей икубацией в условиях микробиологического анализатора.

Предлагаемый способ позволяет получить следующий положительный эффект:

1) в предлагаемом способе показано влияние на бактерии средних терапевтических концентраций озона (1-3-5 мг/л) в физ. р-ре, которые могут применяться парентерально. Указанные концентрации озонированного физиологического раствора наиболее оптимальны в плане бактерицидного действия, и при сочетанном использовании их с антибактериальными препаратами наблюдается потенцирование антибактериальной активности последних (Т.А.Васина, Е.Б.Лазарева, В.Е.Шестоперов, Б.М.Богось «Коррекция антибактериальной терапии при лечении озоном гнойно-воспалительных процессов в неотложной хирургии». // Тезисы докладов 2 Всероссийской научно-практической конференции «Озон в биологии и медицине». - Н.Новгород. - 1995. - С.32);

2) в предлагаемом способе взяты госпитальные штаммы синегнойных бактерий, выделенные от тяжелых ожоговых пациентов с сепсисом. Определены биологические свойства выделенных штаммов, в том числе и патогенные. Все микроорганизмы обладали высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам, что подтверждалось наличием у них плазмид резистентности. Экспериментальные штаммы псевдомонад имели высокий индекс адгезивности ИАМ 2,5-4,0 и выше (адгезивная способность микроорганизмов является одним из маркеров патогенности и играет важную роль в развитии инфекционного процесса, обеспечивая прикрепление бактерий к клеткам и тканям макроорганизма). Таким образом, исследования проведены на особо «проблемных» госпитальных микроорганизмах, борьба с которыми является серьезной медицинской проблемой;

3) нами показана возможность влияния средних терапевтических концентраций озона на фазы роста госпитальных микроорганизмов, что выражается графически в виде кривых роста и объективно показывает снижение количества и скорости размножения бактерии во времени. Способ повышает информативность оценки результатов угнетающего действия озонированного физиологического раствора (1-3-5 мг/л) на госпитальные штаммы микроорганизмов с целью дальнейшей разработки оптимальных режимов (кратность и доза) введения озонированных растворов пациентам с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией;

4) предлагаемый способ повышает точность оценки антибактериального действия ОФР на микроорганизмы, т.к. доказано инактивирующее действие ОФР терапевтических концентраций на рост синегнойных бактерий, выделенных от конкретного больного, что будет иметь большое практическое значение для дальнейшей разработки оптимальных режимов (кратность и доза) введения озонированных растворов пациентам с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией.

Способ осуществляют следующим образом: у пациента с тяжелой термической травмой с подозрением на сепсис берут кровь и выделяют микроорганизм (по стандартной методике, регламентируемой Приказом №535 МЗ РФ от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»).

Определяют исходные свойства микроорганизма: культуральные, биохимические, адгезивные, определяют чувствительность микроорганизма к антибактериальным препаратам. Выращенные на скошенном агаре микроорганизмы заливают ОФР с концентрацией озона на выходе из апарата 1-3-5 мг/л, т.е. готовят 3 производных от исходного штамма образца, обработанных ОФР физиологическим раствором, и инкубируют в термостате в течение 24 часов. Затем готовят стандартную взвесь, содержащую 5,0×10⁵ КОЕ/мл, инокулируют по 100 мкл в пластиковый планшет с таким же количеством питательной среды - бульона Мюллер-Хинтона. Инкубируют в условиях анализатора iEMS Reader (Labsystems, Финляндия) 18 часов. При этом каждые 10 минут происходит динамическое измерение приращения оптической плотности в лунках планшета. После инкубации оценивают антибактериальное действие озонированного физиологического раствора по кривым роста микроорганизмов на экране дисплея в режиме графического изображения: по оси абсцисс - время (чч:мм); по оси ординат - приращение оптической плотности в единицах оптической плотности. Анализируют фазы развития микроорганизмов, наиболее показательные в отношении их роста и размножения: адаптационную или ЛАГ-фазу (характеризует приспособляемость микроорганизмов к условиям питательной среды, в норме составляет 4-5 часов), и экспоненциальную или фазу логарифмического роста (характеризует максимальную скорость роста и размножения бактерий и составляет в норме 5-6 часов), в соответствие с полученными данными назначают парентерально озонированный физиологический раствор с концентрацией озона 1-3-5 мг/л.

Способ апробирован на 10 штаммах госпитальных синегнойных палочек, выделенных от пациентов.

Усредненные данные представлены чертежом.

При оценке кривых роста отмечают удлинение ЛАГ-фазы, которая характеризует адаптацию бактерий к условиям среды. В норме продолжительность ее составляет 4-5 часов. У микроорганизмов, взятых в эксперимент, до озонирования она составляла, в среднем, 5 часов. После контакта тех же бактерий с ОФР концентрации 1 мг/л ЛАГ-фаза увеличилась до 6 часов 50 мин, 3 мг/л - 7 часов 20 мин, 5 мг/л - 7 часов 30 мин. Кроме того, время удвоения численности бактерий (фаза логарифмического роста) после воздействия ОФР концентрации 3 мг/л и 5 мг/л увеличилось в среднем на 1 час, ОФР концентрации 1 мг/л не влиял на эту фазу роста.

Полученные данные показывают дозозависимый эффект действия ОФР на рост микроорганизмов (с увеличением концентрации озона в физиологическом растворе от 1 мг/л до 5 мг/л удлинялись по времени фазы роста микроорганизмов). Кроме того, количество колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий в питательном бульоне опытных образцов через 18 часов инкубации было на 1-2 порядка ниже, чем в контроле. В соответствие с полученными данными пациентам с термической травмой, осложненной генерализованной синегнойной инфкцией, назначают парентерально ОФР с концентрацией озона 1-3-5 мг/л.

Пример конкретного осуществления.

Пациент Х-ов находился на лечении в Российском ожоговом центре по поводу ожога пламенем III АБ степени на площади 40% поверхности тела, ожоговой болезни в стадии септикотоксемии. Течение ожоговой болезни осложнилось развитием сепсиса. Из крови была выделена Pseudomonas aeruginosa (№480). Были определены исходные свойства микроорганизма:

а) культуральные - на 5% кровяном агаре колонии мукоидные, плоские, неправильной формы, склонные к слиянию с наличием пигмента пиоцианина;

б) биохимические - сахаролитическая активность низкая, выраженная протеолитическая и гемолитическая активность;

в)антибиотикограмма показала наличие у данного штамма резистентности к практически всем антибактериальным препаратам с антисинегнойной направленностью за исключением карбенициллина и полимиксина. Полирезистентность к антибиотикам подтверждена наличием R-плазмиды с молекулярной массой 40 мд;

г) штамм обладает высокой адгезивной способностью (ИАМ=4,0). Микроорганизм, выращенный на скошенном агаре, контактировал с ОФР с концентрацией озона 1, 3, 5 мг/л в течение 24 часов. Далее из суточных культур готовили стандартные взвеси, содержащие 5,0×10⁵ КОЕ/мл, инокулировали по 100 мкл в пластиковый планшет с питательной средой - бульоном Мюллер-Хинтона. Планшет с образцами микроорганизмов инкубировали в условиях анализатора в течение 18 часов. При этом каждые 10 минут происходило динамическое измерение приращения оптической плотности в лунках планшета. Считается, что приращение оптической плотности питательной среды с микроорганизмами прямо пропорционально коррелирует с их количеством (см. графики 3,4,5). После инкубации оценивали кривые роста. Отмечали удлинение ЛАГ-фазы, которая характеризует адаптацию бактерий к условиям среды. В норме продолжительность ее составляет 4-5 часов. У штамма №480 она до озонирования составляла 5 ч 45 мин. После контакта с ОФР концентрации 1 мг/л ЛАГ-фаза увеличилась до 7.20 мин, 3 мг/л - 8 ч 35 мин, 5 мг/л - 8 ч 45 мин. Кроме того, время удвоения численности бактерий (фаза логарифмического роста) с 8 ч 15 мин (контроль) увеличилось после контакта с ОФР концентрации 1 мг/л и 3 мг/л до 9 ч, 5 мг/л - до 10 ч. Количество микроорганизмов в 1 мл питательной среды, выращенных после контакта бактерий с ОФР тех же концентраций, снизилось одинаково с 5,0×10⁵ до 5,0×10³.

Проведенные нами исследования показали эффективность ОФР с концентрациями озона 1 мг/л, 3 мг/л и 5 мг/л в отношении конкретного штамма синегнойной палочки №480, выделенного от конкретного больного.

Больному был проведен двухнедельный курс озонотерапии, включавший в/в введение ОФР с концентрацией озона 3 мг/л на выходе из аппарата. Количество раствора - 200 мл/сут 3 раза в неделю. В результате отмечено клиническое улучшение состояния пациента, которое выражалось в снижении температуры тела от гектической до субфебрильной, улучшении сна, аппетита. Со стороны местного течения раневого процесса - раны очистились от гнойного отделяемого, появились признаки активной краевой эпителизации ран, дно ран покрылось яркими мелкозернистыми грануляциями, таким образом, раны были подготовлены к проведению аутодермопластики. После проведения нескольких этапов аутодермопластики и консервативной комплексной терапии кожный покров восстановлен, больной в удовлетворительном состоянии выписан на амбулаторное лечение. Продолжительность стационарного лечения составила 39 суток.

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию антибактериального действия озонированного физиологического раствора (ОФР), и может быть использовано в гнойной хирургии и комбустиологии. Из крови больного с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией, выделяют штамм микроорганизмов, определяют его исходные свойства, выращивают на скошенном агаре, заливают ОФР с концентрацией озона 1 мг/л, 3 мг/л, 5 мг/л и инкубируют в термостате в течение 24 часов. Из суточных культур готовят стандартные взвеси, содержащие 5×10⁵ КОЕ/мл, которые инкубируют в питательной среде в условиях микробиологического анализатора в течение 18 часов. Осуществляют динамическое измерение оптической плотности среды с построением графиков кривых роста бактерий, по которым производят оценку антибактериального действия ОФР на штамм микроорганизмов, определяя удлинение ЛАГ-фазы, время удвоения численности бактерий и количество микроорганизмов в 1 мл питательной среды. Использование способа позволяет повысить точность и информативность оценки антибактериального действия ОФР. 1 ил.

Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора (ОФР), включающий исследование действия ОФР на рост микроорганизмов и оценку результатов, отличающийся тем, что из крови больного с тяжелой термической травмой, осложненной госпитальной инфекцией, выделяют штамм микроорганизмов, определяют его исходные свойства, выращивают на скошенном агаре, заливают ОФР с концентрацией озона 1 мг/л, 3 мг/л, 5 мг/л и инкубируют в термостате в течение 24 ч, из суточных культур готовят стандартные взвеси, содержащие 5·10⁵ КОЕ/мл, которые инкубируют в питательной среде в условиях микробиологического анализатора в течение 18 ч, при этом осуществляют динамическое измерение оптической плотности среды с построением графиков кривых роста бактерий, по которым производят оценку антибактериального действия ОФР на штамм микроорганизмов, определяя удлинение ЛАГ-фазы, время удвоения численности бактерий и количество микроорганизмов в 1 мл питательной среды.