СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/18 

Изобретение относится к области медицины, а именно абдоминальной хирургии, клинической микробиологии.

Известен способ оценки влияния озона на культуры Pseudomonas aeruginosa путем воздействия озонированным физиологическим раствором различных концентраций на бактериальные взвеси (Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора / Н.А.Кувакина, С.И.Пылаева, С.П.Перетягин, А.А.Стручков. Патент РФ №2289812 от 20.12.2006 г.).

Недостатки прототипа: способ трудоемок и продолжителен во времени, направлен на изучение активно делящихся клеток, без учета покоящихся и малоактивных форм микроорганизмов, структурированных в биопленки, что приводит к недостаточной точности оценки.

Технический результат: повышение точности и объективности проводимого исследования за счет приближения условий эксперимента in vitro к ситуации in vivo.

Сущность метода заключается в том, что оценивают влияние на всю совокупность микробных клеток, в том числе малоактивных и покоящихся форм, путем сравнительного анализа состояния сформированных бактериями биопленок, до и после воздействия на них озонированного (ОФР) и неозонированного физиологического раствора (НОФР). Для этого биопленки, сформированные in vitro возбудителями инфекционных осложнений, подвергают воздействию ОФР, содержащего терапевтические концентрации озона, НОФР и оценивают степень их разрушения на основе регистрации поглощения ими генцианвиолета.

Способ осуществляется следующим образом: для формирования биопленок на поверхности 96-луночного полистиролового планшета наносят по 150 мкл изолированных от больных 18-часовых бульонных культур возбудителей, например, с использованием LB-бульона (жидкой питательной среды Луриа Бертани). Закрытые планшеты выдерживают в термостате при 37°С в течение 48 часов. Затем планшеты трижды промывают дистиллированной водой. Часть сформированных биопленок подвергают воздействию озонированного физиологического раствора - опыт, другую обрабатывают неозонированным физиологическим раствором - контроль. Время экспозиции в обоих случаях - 10 минут, после чего планшеты вновь промывают. Далее пленки окрашивают 1% водным раствором генцианвиолета в течение 45 минут. Состояние пленок определяют по интенсивности окрашивания содержимого лунок красителем, который элюируют 96% спиртом и определяют оптическую плотность элюата на спектрофотометре, например серии СФ-2000. Все эксперименты проводят не менее чем в 3-х кратных повторностях.

Затем усредненные показатели опыта и контроля сравнивают между собой. Если показатели опыта и контроля достоверно не отличаются (р>0,05), регистрируют отсутствие влияния озона на культуру возбудителя. Если показатели опыта и контроля различаются достоверно (р<0,05), регистрируют антибактериальный эффект, степень выраженности которого коррелирует с уровнем определяемых показателей.

Примеры практического применения:

Пример 1: Больная П., 36 лет (№ ИБ А 10132) поступила в стационар 22.07.2009 года через 8 часов от начала заболевания, когда появились интенсивные опоясывающие боли в животе, тошнота, рвота. 23.07.2009 г. выполнена лапароскопия, дренирование брюшной полости, сальниковой сумки, забрюшинного пространства. Амилаза брюшной полости 2780-3966ЕД. 27.07 - лапаротомия, вскрытие и дренирование забрюшинного и параколитическоо пространств, бурсостомия, редренирование брюшной полости. Поздний послеоперационный период осложнился формированием панкреатического свища. При микробиологическом исследовании отделяемого выделен полирезистентный штамм S. epidermidis. На фоне проводимого комплексного лечения, включающего комбинированную озонотерапию, удалось добиться элиминации возбудителя. Проведена оценка влияния озона на S. epidermidis по предлагаемому способу. Для этого биопленки, сформированные S. epidermidis на поверхности полистиролового планшета, обрабатывали ОФР с концентрацией озона 5 мг/л и НОФР в течение 10 минут, промывали, окрашивали генцианвиолетом, который элюировали 96% спиртом и определяли оптическую плотность элюата. При этом отличия опыта и контроля были достоверны, что указывает на антибактериальный эффект (таблица).

Пример 2: Больная Д., 27 лет (№ ИБ А94), поступила 04.01.2008 года через 20 часов от начала заболевания, когда появились жалобы на опоясывающие боли в животе, тошноту, рвоту 06.01.2008 - лапароскопия, в брюшной полости геморрагический выпот до 200 мл. Выполнено дренирование сальниковой сумки, брюшной полости. В забрюшинное пространство и круглую связку печени введен озон концентрации 3 мг/л 60.0 мл. 10.01.2008 - санация, редренирование сальниковой сумки, забрюшинного пространства. Посев экссудата из сальниковой сумки от 21.01.08: Kl. pneumonia 10⁸ КОЕ/мл, штамм устойчивый к ципрофлоксацину, цефтазидиму, гентамицину. Послеоперационный период протекал тяжело, с формированием абсцесса в области хвоста поджелудочной железы, гнойных свищей. Проводилась интенсивная инфузионная терапия, включающая введение озона в забрюшинное пространство, инфузии ОФР, промывание свищевых ходов ОФР. Комплексное лечение с включением методов озонотерапии привело к благоприятному исходу заболевания.

Проведена оценка влияния озона на Kl. pneumonia по предлагаемому способу. Обработка биопленок, сформированных Kl. pneumonia на поверхности полистиролового планшета, ОФР с концентрацией озона 3 мг/л привела к достоверному снижению оптической плотности элюированного генцианвиолета, что указывает на антибактериальный эффект воздействия озона (таблица).

Пример 3: Больная П., 38 лет (№ ИБ А2236), госпитализирована экстренно 14.02.2009 года через 4 суток от начала заболевания, когда появились ноющие боли в правом подреберье, тошнота. При поступлении проводилась инфузионно-спазмолитическая терапия со слабым положительным эффектом. 17.02.2009 в связи с усилением боли оперирована: выполнена лапаротомия, холецистэктомия. Амилаза экссудата брюшной полости 17.02.2009 - 2646-2692 ЕД. Последующее лечение в ОРИТ, проводилась массивная инфузионная терапия, антибактериальная терапия (тиенам, ванкомицин, цефтриаксон, метрогил), в сочетании с комбинированной озонотерапией. На фоне некоторой стабилизации состояния 27.02.2009 года появилось гнойное отделяемое по дренажам. При бактериологическом исследовании высеяна Р. aeruginosa 10⁸ КОЕ/мл, штамм, устойчивый к гентамицину, ципрофлоксацину, имипенему, амикацину, цефепиму, дорипенему. Несмотря на проводимую интенсивную терапию 11.03.2009, на фоне прогрессирующей легочно-сердечной недостаточности, явлений эндотоксикоза констатирована биологическая смерть.

Проведена оценка влияния озона на Р. aeruginosa по предлагаемому способу. Для этого 18-часовую бульонную культуру вносили в лунки 96-луночного полистиролового планшета для формирования биопленок и выдерживали в термостате при 37°С в течение 48 часов. После промывания дистиллированной водой часть сформированных биопленок подвергали 10-минутному воздействию ОФР с концентрацией озона 5 мг/л, другую обрабатывали НОФР. После окрашивания пленок 1% водным раствором генцианвиолета в течение 45 минут, краситель элюировали 96% спиртом и определяли оптическую плотность элюата. Так как показатели оптической плотности опыта и контроля достоверно не отличались, было зарегистрировано отсутствие влияния озона на выделенную культуру Р. aeruginosa.

Таблица Оценка влияния ОФР на микробные культуры Пример Опыт (А) Контроль (Б) Достоверность различий (р) Эффект А и Б Пример №1 S. epidermidis 0,11±0,005 0,66±0,033 <0,05 Антибактериальный Пример №2 Kl. pneumonia 0,135±0,013 0,44±0,262 <0,05 Антибактериальный Пример №3 P. aeruginosa 0,57±0,113 0,55±0,112 >0,05 Отсутствует

Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ позволяет оценить целесообразность включения озона в схему лечения больных хирургического профиля, а также обеспечивает объективность получаемых результатов, приближая условия эксперимента in vitro к ситуации in vivo.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клинической микробиологии. Способ предусматривает нанесение на планшет бульонной культуры возбудителей. Выдерживание этих планшет в течение 48 ч с последующим 3-х кратным промыванием дистиллированной водой с получением биопленок, сформированных бактериями. Часть биопленок обрабатывают озонированным физиологическим раствором, другую часть - неозонированным физиологическим раствором в течение 10 минут. Промывают, окрашивают 1%-ным водным раствором генцианвиалета в течение 45 минут, промывают с последующим элюированием спиртом и определением оптической плотности элюатов на спектрофотометре. Полученные результаты сравнивают между собой, и при наличии достоверных различий между ними р<0,05 делают вывод об антибактериальном действии озонированного физиологического раствора. 1 табл.

Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора путем воздействия озонированным физиологическим раствором на бактериальные культуры, отличающийся тем, что в течение 10 мин обрабатывают биопленки, сформированные бактериями в полистироловых планшетах, в одном - озонированным физиологическим раствором, в другом - неозонированным физиологическим раствором, промывают, окрашивают 1%-ным водным раствором генцианвиалета в течение 45 мин, промывают, элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, полученные результаты сравнивают между собой и при наличии достоверных различий между ними р<0,05 делают вывод об антибактериальном действии озонированного физиологического раствора.