Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, аллергологии, пульмонологии, дерматологии, микробиологии; ветеринарии, и может быть использовано для оценки пригодности хромогенного реактива - нитросинего тетразолия /далее - "НСТ"/ для применения в реакции фагоцитоза при оценке иммунного статуса здорового и больного организма.
Известны способы определения функциональной активности фагоцитов /далее - "ФАФ"/ по результатам пробы с восстановлением НСТ - так называемого НСТ-теста [1, 2].
Так, известен способ определения ФАФ у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях [1]. Постановку НСТ-теста согласно способу-аналогу [1] осуществляют следующим образом. Приготавливают смесь для исследования фагоцитоза /далее - "СИФ"/. При этом к 0,1 мл гепаринизированной крови (взятой из пальца обследуемого лица) добавляют 0,1 мл 0,075% раствора НСТ. Инкубируют СИФ в течение 10 мин при температуре 37°С. После истечения времени инкубации фиксируют указанную смесь 50% раствором формалина, разведенного в 0,9% растворе натрия хлорида, в течение 3 мин. Центрифугируют СИФ в течение 5 мин при 750 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, из осадка готовят мазки. Фиксируют мазки в спирт-формалине в течение 30 с. Докрашивают ядра 0,1% раствором нейтрального красного, разведенного в 0,5% растворе хлорида натрия. Под микроскопом, пользуясь иммерсионной системой, производят подсчет 200 фагоцитов и определяют процент положительно реагирующих с НСТ клеток, в цитоплазме которых отмечается образование гранул формазана (фиолетово-синего цвета) /далее - "формазан-положительные клетки"/. ФАФ оценивают путем сопоставления полученных значений НСТ-теста с аналогичными показателями здоровых детей, которые, по данным авторов способа-аналога [1], составляют в среднем (14,4±0,68)%, варьируясь в пределах 4-33%. В результате указанного сопоставления авторами рассматриваемого способа-аналога было установлено, в частности, что при инфекционных заболеваниях имеет место значимое повышение показателей НСТ-теста.
Наиболее близким к заявленному решению по совокупности существенных признаков является способ определения ФАФ [2]. Способ, принятый за прототип, осуществляют следующим образом. Приготавливают СИФ. При этом 0,1 мл крови смешивают с 0,1 мл 0,1% раствора НСТ в 0,9% растворе натрия хлорида (0,15 М NaCl). Инкубируют СИФ в течение 20 мин при 37°С; после завершения инкубации указанную смесь тщательно перемешивают. Из содержимого пробирки, полученного после инкубирования СИФ, готовят мазки и производят микроскопию. Определяют в мазке количество формазан-положительных фагоцитов в процентах от общего количества фагоцитов. ФАФ оценивают путем сопоставления полученных значений с нормой, которая, по данным авторов способа-прототипа [2], составляет около 30%.
Однако известные способ-аналог [1] и способ-прототип [2] не позволяют получить технический результат, достигаемый при использовании заявленного способа, по следующим причинам. Результаты клинических наблюдений авторов изобретения (определение ФАФ в ходе комплексного обследования 467 детей) показали, что при постановке НСТ-теста с помощью известных способов [1, 2] в 25-33% случаев были зафиксированы результаты, не коррелирующие с данными комплексного обследования и расцененные как ложноотрицательные. Было установлено, что в указанных случаях замена используемого образца НСТ на образец, соответствующий критерию пригодности (согласно заявленному способу), приводила к получению результатов НСТ-теста, полностью подтверждавшихся результатами комплексного обследования. Таким образом, авторы заявленного способа пришли к заключению о наличии прямой связи между активностью используемого в реакции фагоцитоза образца НСТ и результатами определения ФАФ. Это предположение подтверждается следующим. Известно, что НСТ представляет собой окислительно-восстановительный индикатор, который, поступая в фагоцитирующие клетки, подвергается восстановлению до нерастворимого формазана под влиянием оксидаз свободных нуклеотидов НАД·Н и НАДФ·Н [1]. Известно, что НСТ сохраняет свою активность только при соблюдении определенных условий хранения (в темноте, в герметичной упаковке) [3]. Имеются данные о фотолабильности НСТ [4]. В ряде работ, касающихся техники применения реактива НСТ, в частности в работе [5], даны рекомендации о необходимости ежедневного приготовления заново хромогенных субстратов, содержащих НСТ. По мнению авторов предложенного способа, в образце НСТ, условия хранения которого были нарушены (тем или иным способом), происходят изменения химической структуры, препятствующие превращению НСТ в гранулы формазана под влиянием соответствующих ферментов (НАД·Н и НАДФ·Н). Это, в свою очередь, препятствует достоверной оценке ФАФ с помощью НСТ-текста. Таким образом, отсутствие предварительной оценки пригодности образца НСТ для применения в реакции фагоцитоза приводит к снижению точности определения ФАФ за счет невозможности получения достоверных результатов НСТ-теста при использовании образцов НСТ с утраченной способностью к образованию восстановленной формы.
Задачей изобретения является создание способа определения ФАФ, обеспечивающего возможность предварительной оценки способности НСТ к химическому превращению в формазан под влиянием окислительно-восстановительных ферментов за счет использования тест-культуры клеток, структурно-функциональные особенности мембран и поверхностных слоев цитоплазмы которых способствуют проявлению макроскопически различимой окраски при положительном результате реакции восстановления НСТ в формазан.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения ФАФ, включающем забор крови с антикоагулянтом, приготовление СИФ путем внесения в исследуемую пробу крови предварительно приготовленного 0,1% раствора НСТ, растворенного в 0,9% растворе натрия хлорида, инкубацию СИФ, приготовление мазков из проинкубированной СИФ с последующим определением количества формазан-положительных фагоцитов в процентах от общего количества фагоцитов и оценкой ФАФ путем сопоставления полученных значений с нормальными величинами, согласно изобретению перед приготовлением СИФ готовят контрольную смесь /далее - "КС"/. Для этого часть предварительно приготовленного раствора НСТ объемом не менее 0,05 мл смешивают с дрожжами Saccharomyces cerevisiae и выдерживают полученную КС в течение не менее 6 мин при температуре (20±2)°С. Затем анализируют окраску КС и используют остальную часть раствора НСТ для приготовления СИФ только при наличии в КС розового окрашивания. Наиболее эффективно смешивать с дрожжами Saccharomyces cerevisiae часть предварительно приготовленного раствора НСТ объемом 0,05-0,1 мл. При использовании для приготовления КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae в сухом виде оптимальным является смешивать их с раствором НСТ в концентрации 50-250 мг дрожжей/мл раствора НСТ, а при использовании указанных дрожжей в виде взвеси - в концентрации (2,5-12,5)×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ /далее - "рабочая концентрация КС"/. Наиболее эффективным является выдерживание полученной КС в течение 6-10 мин. Кроме того, эффективно дополнительно центрифугировать СИФ, например в течение 5 мин при 750 об/мин, и готовить мазки из полученного после центрифигирования осадка.
Для выбора и обоснования оптимальных значений причинно-значимых параметров заявленного способа, при которых достигается наибольшая эффективность функционирования предложенного критерия пригодности НСТ для использования в ходе постановки НСТ-теста /далее - "предложенный критерий пригодности"/, были проведены двухэтапные испытания. На первом этапе оценивалась путем визуального анализа КС качественная составляющая предложенного критерия пригодности - наличие розового окрашивания КС /далее - "проверка на соответствие"/. На втором этапе подтверждалась достоверность критерия пригодности путем выявления корреляции между оцениваемой визуально качественной составляющей указанного критерия и оцениваемой клинико-лабораторными методами количественной составляющей данного критерия (подтвержденные значения показателя ФАФ).
В ходе испытаний было поставлено четыре серии опытов, в которых были исследованы 19 образцов НСТ, полученных из разных источников, хранившихся при различных условиях в течение различных сроков. В каждой из серий опытов использовались образцы с однотипными условиями и сроками хранения:
I серия опытов - образцы НСТ из партий, полученных перед испытаниями; без явных нарушений упаковки (10 образцов);
II серия опытов - образцы НСТ из тех же партий, что и в I серии опытов, прошедшие проверку на соответствие предложенному критерию пригодности с положительным результатом, хранившиеся (после проведения проверки на соответствие) на свету в течение 7 суток (3 образца);
III серия опытов - образцы НСТ из тех же партий, что и в I серии опытов, прошедшие проверку на соответствие предложенному критерию пригодности с положительным результатом, хранившиеся (после проведения проверки на соответствие) в упаковке с нарушенной герметичностью в течение 30 суток (3 образца);
IV серия опытов - образцы НСТ из разных партий, хранившиеся в лаборатории, где проводились испытания, свыше 10 лет; без явных нарушений упаковки (3 образца).
Испытания проводили в иммунологической лаборатории Детской городской больницы №1 Санкт-Петербурга /далее - "ДГБ №1"/. Визуальный анализ КС на первом этапе испытаний осуществляли с использованием метода экспертной оценки. В испытаниях первого этапа принимали участие 60 лабораторных работников в возрасте от 18 до 75 лет, из них 36 человек - со 100% зрением; 15 чел. - с близорукостью (-2)-(-8)Д; 9 чел. - с дальнозоркостью (+2)-(+6) Д /далее - "эксперты"/. Каждому из экспертов предлагалось охарактеризовать визуально различимую окраску КС, приготовленной согласно заявленному способу с использованием каждого из исследуемых образцов НСТ (каждой из серий). В соответствии с заявленным способом считали, что исследуемый образец НСТ соответствует предложенному критерию пригодности при определении цвета КС данного образца НСТ как "розовая". При этом оценку цвета исследуемой КС считали адекватной, если результаты оценки совпадали у 100% экспертов /далее - "адекватная экспертная оценка цвета КС"/.
В ходе испытаний первого этапа с помощью визуального анализа КС, приготовленной согласно заявленному способу с использованием каждого из исследуемых образцов НСТ:
- устанавливался факт наличия или отсутствия розового окрашивания КС каждого конкретного образца НСТ /далее также, соответственно, - "положительный или отрицательный результат визуального анализа"/ в условиях гарантированной адекватной экспертной оценки цвета КС;
- для всех образцов НСТ, для которых был получен положительный результат визуального анализа /далее также - "образцы НСТ, соответствующие предложенному критерию пригодности", "позитивные образцы НСТ" "ПО НСТ"/, исследовалась визуальная различимость розовой окраски КС каждого из указанных образцов НСТ при различных значениях заявленных параметров, и по суммарным результатам исследований определялись интервалы оптимальных значений указанных параметров.
При этом под гарантированной адекватной экспертной оценкой понимали оценку цвета КС каждого конкретного позитивного образца НСТ при концентрации дрожжей Saccharomyces cerevisiae 250 мг дрожжей/мл раствора НСТ - при использовании дрожжей в сухом виде или 12,5×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ - при использовании дрожжей в виде взвеси при объеме вносимого раствора НСТ 0,1 мл и времени выдерживания КС 10 мин при температуре 22°С (верхние граничные значения интервалов оптимальных значений данных параметров). Визуальную различимость розовой окраски КС позитивных образцов НСТ исследовали в условиях варьирования концентрации дрожжей при постоянном (оптимальном) объеме вносимого раствора НСТ и постоянном (оптимальном) времени выдерживания КС при температуре 20°С; в условиях варьирования объема вносимого раствора НСТ при постоянной (оптимальной) концентрации дрожжей и постоянном (оптимальном) времени выдерживания КС при температуре 20°С и в условиях варьирования времени выдерживания КС при температуре 20°С при постоянной (оптимальной) концентрации дрожжей и постоянном (оптимальном) объеме вносимого раствора НСТ. Кроме того, в условиях варьирования температуры и времени выдерживания КС при каждой из температур исследуемого диапазона при постоянной (оптимальной) концентрации дрожжей и постоянном (оптимальном) объеме вносимого раствора НСТ для каждого позитивного образца НСТ фиксировали время появления розового окрашивания КС данного образца, исследовали его визуальную различимость, а также возможность адекватной экспертной оценки цвета КС.
Для постановки экспериментов первого и второго этапов испытаний предварительно готовили 0,1% раствор каждого из исследуемых образцов НСТ, растворенного в 0,9% растворе натрия хлорида. На первом этапе часть предварительно приготовленного раствора каждого из образцов НСТ использовали для приготовления КС по десяти вариантам, указанным ниже (остальную часть указанного раствора использовали для приготовления СИФ на втором этапе испытаний). Каждый из вариантов приготавливали, базируясь на методике заявленного способа, с учетом конкретных количественных значений постоянных и переменных параметров, задаваемых условиями постановки эксперимента в каждом из вариантов /далее, также - "опытные пробы"/:
время выдерживания КС 8 мин при 20°С;
время выдерживания КС 8 мин при 20°С;
Для целей визуального анализа (для предъявления экспертам) использовали прозрачные центрифужные пробирки объемом 10 мл, содержащие КС каждого из вариантов приготовления по каждому из исследуемых образцов НСТ /далее - "опытные пробирки"/. Параллельно с каждой из опытных проб в аналогичных пробирках /далее - "контрольные пробирки"/ готовили контрольные пробы. При этом в качестве исходного компонента для приготовления контрольной пробы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae того же состава и в том же количестве, что и для соответствующей опытной пробы (равная навеска дрожжей или равное количество дрожжевых клеток из плотного осадка). В каждую контрольную пробирку, содержащую дрожжевые клетки, вносили 0,9% раствор натрия хлорида в объеме, равном объему раствора исследуемого образца НСТ, вносимого в соответствующую опытную пробирку. Визуальный анализ каждой из опытных проб (КС одного из исследуемых образцов НСТ соответствующего варианта приготовления) производили дважды в сравнении с соответствующей контрольной пробой: оценивали окраску содержимого опытной и контрольной пробирок непосредственно после приготовления опытной и контрольной проб и после выдерживания указанных проб в условиях, предусмотренных соответствующим вариантом приготовления КС. При постановке экспериментов, связанных с варьированием температуры, при которой выдерживались КС исследуемых образцов НСТ, использовали холодильник фармакологический марки ХФ-250 "Позис-574" (производства "Инком центр "Вариант", ЗАО, Россия /Санкт-Петербург/) и ультратермостат "УТ-15" (производства Экспериментального завода лабораторной медицинской техники, Россия /Одесса/), предусматривающие установку требуемой температуры (соответственно, выдерживания на холоду или термостатирования).
Статистическую обработку результатов экспериментов первого этапа испытаний проводили с использованием критериев Фишера и Вилкоксона-Манна-Уитни [6].
Результаты визуального анализа КС исследуемых образцов НСТ при различных значениях концентрации дрожжей, объема вносимого раствора НСТ, времени и температуры выдерживания КС выборочно приведены в табл.1-3.
Соответствие исследованных образцов нитросинего тетразолия /НСТ/ предложенному критерию пригодности (наличие розового окрашивания контрольной смеси /КС/) в условиях гарантированной адекватной экспертной оценки
Зависимость визуальной различимости розового окрашивания контрольной смеси /КС/ образцов нитросинего тетразолия /НСТ/, соответствующих предложенному критерию пригодности (позитивных образцов НСТ), от концентрации дрожжей Saccharomyces cerevisiae, объема вносимого раствора НСТ и времени выдерживания КС при температуре 20°С
Как видно из данных табл.1, предложенному критерию пригодности соответствовали: в I серии опытов - 8 образцов НСТ из 10 исследованных; в III и в IV сериях опытов - по одному образцу из трех исследованных (в каждой серии). Во II серии опытов предложенному критерию пригодности не соответствовал ни один из трех исследованных образцов НСТ. При этом идентичные результаты были получены при использовании дрожжей как в сухом виде (вариант 1), так и в виде взвеси (вариант 2). По результатам анализа образцы НСТ, исследованные в условиях I-IV серий опытов, были распределены по партиям. Образцы, соответствовавшие предложенному критерию пригодности (позитивные образцы НСТ), и образцы, не соответствовавшие предложенному критерию пригодности /далее также - "негативные образцы НСТ", "НО НСТ"/, составили, соответственно, партии: I-ПО, I-HO (I серия); II-НО (II серия); III-ПО, III-НО (III серия); IV-ПО, IV-НО (IV серия).
Данные визуального анализа (в сравнении с контрольными пробами) КС образцов НСТ (из числа исследованных), соответствовавших предложенному критерию пригодности (партии I-ПО, III-ПО, IV-ПО), в условиях варьирования концентрации дрожжей при постоянном объеме вносимого раствора НСТ (0,1 мл) и постоянном времени выдерживания проб (8 мин) при температуре 20°С (табл.2: варианты 3 и 4) показали следующее. Непосредственно после приготовления содержимое как опытных, так и контрольных пробирок представляло собой: при концентрациях менее 25 мг дрожжей/мл раствора НСТ (при использовании дрожжей в сухом виде) или менее 1,25×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ (при использовании дрожжей в виде взвеси) - прозрачный раствор с белесовато-мутным оттенком; при концентрациях равных или превышающих 25 мг дрожжей/мл раствора НСТ (при использовании дрожжей в сухом виде) либо равных или превышающих 1,25×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ (при использовании дрожжей в виде взвеси) - молочно-белый раствор. После выдерживания в указанных условиях внешний вид контрольных проб (включая окраску) оставался без изменений, тогда как в опытных пробах отмечалось наличие розового окрашивания КС различной степени выраженности. При этом при концентрациях менее 25 мг дрожжей/мл раствора НСТ или менее 1,25×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ визуальное определение розовой окраски КС являлось крайне затруднительным (при нижних граничных значениях исследуемых диапазонов концентраций ошибочная оценка цвета КС имела место в 75,0-78,3% случаев) из-за высокой прозрачности исследуемых КС (как показали предварительные эксперименты, при концентрациях 3 мг дрожжей/мл раствора НСТ или 0,15×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ выявить наличие розовой окраски удавалось 1,7-3,3% экспертов). В диапазонах концентраций 25÷45 мг дрожжей/мл раствора НСТ или (1,0-2,25)×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ оценку цвета исследуемых КС как розового давало от 61,7 до 86,7% экспертов. При концентрациях 50-250 мг дрожжей/мл раствора НСТ или (2,5-12,5)×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ имела место адекватная экспертная оценка цвета КС как розового, что обусловило выбор концентраций указанного диапазона в качестве оптимальных. Дальнейшее увеличение концентрации дрожжей (в диапазонах 255-300 мг дрожжей/мл раствора НСТ или (12,75÷15,0)×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ) приводило к значимому снижению процента экспертов, определявших наличие розового окрашивания КС (соответственно, 83,3-41,7% и 98,3-90,0%), что обусловливалось уменьшением интенсивности указанной окраски КС вследствие того, что значительная часть дрожжевых клеток оказывалась неокрашенной.
В ходе визуального анализа (в сравнении с контрольными пробами) позитивных образцов НСТ (из числа исследованных) при использовании в качестве варьируемого параметра объема вносимого раствора НСТ при постоянной концентрации дрожжей (150 мг дрожжей/мл раствора НСТ или 7,50×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ) и постоянном времени выдерживания проб (8 мин) при температуре 20°С (табл.2: варианты 5 и 6) установлено следующее. Непосредственно после приготовления содержимое как опытных, так и контрольных пробирок представляло собой мелочно-белый раствор (разной прозрачности). После выдерживания в указанных условиях: контрольные пробы - без изменений; в опытных пробах - наличие розового окрашивания КС различной степени выраженности. При этом при малых объемах вносимого раствора НСТ (0,01-0,025 мл) наблюдался относительно высокий процент ошибок при визуальной оценке цвета КС как при использовании дрожжей в сухом виде, так и в виде взвеси (соответственно, 95,0-55,0% и 93,3-53,3%), вследствие наличия в пробирке несмоченных (и, соответственно, неокрашенных) сухих дрожжей или высокой прозрачности и малого суммарного объема КС (в случае использования взвеси дрожжей). Интервал 0,05-0,1 мл вносимого объема раствора НСТ был выбран в качестве оптимального, т.к. при указанных значениях исследуемого параметра имела место адекватная экспертная оценка цвета КС как розового при оптимальном расходе дорогостоящего химического реактива - НСТ (рекомендуемый в методиках определения ФАФ расход раствора НСТ /в концентрации 0,075-0,1%/, как правило, не превышает 0,1 мл). Увеличение объема вносимого раствора НСТ свыше 0,1 мл не меняло точность визуальной оценки окраски КС (адекватная экспертная оценка розового окрашивания), однако приводило к неоправданному возрастанию расхода раствора дорогостоящего НСТ.
Визуальный анализ (в сравнении с контрольными пробами) в условиях варьирования времени выдерживания проб при температуре 20°С при постоянной концентрации дрожжей (150 мг дрожжей/мл раствора НСТ или 7,50×10 клеток дрожжей/мл раствора НСТ) и постоянном объеме (0,1 мл) вносимого раствора НСТ (табл.2: варианты 7 и 8) показал следующее. Непосредственно после приготовления содержимое как опытных, так и контрольных пробирок имело вид молочно-белого раствора. После выдерживания в указанных условиях контрольные пробы оставались без изменений. В опытных пробах отмечалось появление розового окрашивания КС, начиная с первой минуты выдерживания при относительно высоком проценте ошибочных экспертных оценок (60% - для сухих дрожжей, 58,3% - для взвеси дрожжей), который уменьшался по мере увеличения сроков инкубации, составляя при 5 мин, соответственно, 26,7% (для сухих дрожжей) и 25,0% (для взвеси дрожжей). Адекватная экспертная оценка наличия розового окрашивания КС зафиксирована, начиная со времени выдерживания 6 мин (при использовании дрожжей как в сухом виде, так и в виде взвеси). Дальнейшее увеличение указанного параметра (7-15 мин) не влияло на точность экспертной оценки. Однако увеличение срока инкубации свыше 10 мин, по мнению авторов изобретения, нецелесообразно, т.к. приводит к непроизводительным затратам рабочего времени врача и лаборанта, проводящих анализ.
Результаты визуального анализа (в сравнении с контрольными пробами) КС позитивных образцов НСТ в условиях варьирования температуры и времени выдерживания проб при каждой из температур в диапазоне варьирования при постоянной концентрации дрожжей (150 мг дрожжей/мл раствора НСТ или 7,50×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ) и постоянном объеме (0,1 мл) вносимого раствора НСТ (табл.3: варианты 9 и 10) позволили сделать следующие выводы. Непосредственно после приготовления содержимое как опытных, так и контрольных пробирок имело вид мелочно-белого раствора. После выдерживания в указанных условиях окраска контрольных проб визуально не изменялась. В опытных пробах наблюдалось появление розового окрашивания КС, причем при увеличении температуры инкубации до некоторой критической величины (22°С) время проявления указанного изменения цвета КС сокращалось, а интенсивность окраски - увеличивалась, что приводило к повышению точности экспертных оценок; при превышении критической температуры (начиная с 23°С) процент ошибочных оценок снова возрастал. Так, при выдерживании КС, приготовленной с использованием дрожжей как в сухом виде, так и в виде взвеси, в условиях относительно невысоких температур (в диапазоне 2÷14°С) адекватная экспертная оценка наличия розового окрашивания КС становилась возможной только при относительно длительном времени выдерживания (соответственно, 20/27/÷15 мин). Увеличение температуры до 16-17°С обеспечивало возможность адекватной экспертной оценки розового цвета КС на более ранних сроках инкубации (8-10 мин). И наконец, в интервале 18÷22°С выявление всеми экспертами (100%) наличия розового окрашивания КС имело место, начиная с 6-ой минуты (нижнее граничное значение интервала оптимальных значений температуры). Дальнейшее повышение температуры выдерживания КС (в диапазоне 23÷37°С) приводило к резкому сокращению времени появления интенсивной розовой окраски КС (начиная с 32°С наибольшая точность экспертных оценок отмечалась на 2-3-минутах инкубации), однако при этом адекватная экспертная оценка наличия указанного факта становилась невозможной из-за выраженного газообразования в исследуемых пробах - образования белой пены в объеме КС (аналогичное явление наблюдалось при указанных условиях и в контрольных пробах). Таким образом, в качестве оптимального был выбран интервал температур выдерживания КС 18÷22°С.
Сопоставительный анализ результатов визуального анализа КС позитивных образцов НСТ различных вариантов приготовления в условиях варьирования исследуемых параметров (табл.2, 3) показал, что в вариантах с использованием взвеси дрожжей при варьировании концентрации дрожжей, объема вносимого раствора НСТ и времени выдерживания КС при оптимальной температуре получены незначительно (статистически недостоверно) более высокие результаты по сравнению с вариантами, основой которых являлись сухие дрожжи. Однако в условиях варьирования температуры выдерживания КС (при использовании температур, превышающих верхнюю границу интервала оптимальных значений) при оптимальных значениях прочих параметров (концентрация дрожжей, объем вносимого раствора НСТ) меньший (статистически недостоверно) процент ошибочных экспертных оценок был зафиксирован в вариантах с применением сухих дрожжей. При оптимальных значениях заявленных параметров результаты, полученные при использовании сухих дрожжей и взвеси дрожжей, были идентичны. Таким образом, проведенный анализ доказал правомерность использования при постановке НСТ-теста заявленным способом дрожжей как в сухом виде, так и в виде взвеси.
Перед началом второго этапа испытаний для установления диапазона нормальных значений ФАФ авторами изобретения были проведены исследования НСТ-теста по методике заявленного способа (при параллельной постановке теста с использованием трех позитивных образцов НСТ из партии I-ПО) у 63 "практически здоровых" детей в возрасте от 7 дней до 15 лет. При этом в группу "практически здоровых" были включены дети, у которых ни в анамнезе, ни при обследовании в ходе профилактических осмотров на базе поликлинического отделения №41 ДГБ №1 различными клиническими, инструментальными и лабораторными методами отклонений в состоянии здоровья выявлено не было /далее - "практически здоровые" дети/. В результате указанных исследований было установлено, что при постановке НСТ-теста заявленным способом ФАФ в норме составляет в среднем (27,3±3,2) формазан-положительных фагоцитов в мазке. Полученные значения ФАФ в норме коррелируют с данными авторов способа-прототипа [2].
На втором этапе испытаний были проведены сравнительные исследования ФАФ, определенной в ходе параллельной постановки НСТ-теста заявленным способом с использованием всех исследованных на первом этапе образцов НСТ (образцы партий I-ПО, III-ПО, IV-HO; I-HO, II-HO, III-HO, IV-HO) у следующих детей:
- у детей с подтвержденными при клинико-лабораторном обследовании нарушениями фагоцитоза в возрасте от 7 дней до 15 лет - 67 человек (отобраны из числа больных, госпитализированных на различные отделения ДГБ №1);
- у "практически здоровых" детей в возрасте от 7 дней до 15 лет - 30 чел. (отобраны при профилактических осмотрах на базе поликлинического отделения №41 ДГБ №1 перед плановой вакцинацией).
Распределение детей по группам выглядело следующим образом:
В ходе определения ФАФ у каждого из обследуемых детей брали по 1,9 мл крови из вены и вносили по 0,1 мл в 19 пробирок, содержащих (каждая) по 0,1 мл предварительно внесенного гепарина (2 БД гепарина в 0,1 мл). Готовили СИФ. При этом в каждую из 19 пробирок, содержащих гепаринизированную кровь конкретного обследуемого ребенка, вносили по 0,1 мл предварительно приготовленного раствора (из части, оставшейся после первого этапа испытаний) одного из образцов НСТ (раствор каждого из образцов - в отдельную пробирку). Указанную процедуру повторяли в отношении крови каждого обследуемого ребенка. Инкубировали СИФ (в каждой из пробирок) в течение 20 мин при температуре 37°С. Затем центрифугировали указанную смесь (каждую из пробирок) в течение 5 мин при 750 об/мин. Мазки, приготовленные из осадка, полученного после центрифугирования СИФ (2-3 мазка из каждой пробирки), после высушивания, фиксации и окрашивания по методике заявленного способа просматривали под микроскопом в иммерсионной системе и определяли процент формазан-положительных фагоцитов (из 200 клеток). Оценку ФАФ производили путем сопоставления полученных значений с нормой согласно методике заявленного способа.
Статистическую обработку результатов, полученных на втором этапе испытаний, проводили с использованием критериев Фишера и Вилкоксона-Манна-Уитни [6].
В табл.4, 5 представлены сравнительные результаты определения ФАФ при постановке НСТ-теста с использованием всех исследованных на первом этапе образцов НСТ у детей с подтвержденными нарушениями фагоцитоза и у "практически здоровых" детей. При этом в табл.4 приведены средние значения ФАФ в каждой из обследуемых групп по каждой партии образцов НСТ, а в табл.5 - распределение обследуемых детей в каждой из групп в зависимости от статуса полученных результатов определения ФАФ (подтвержденные или неподтвержденные).
Из данных табл.4, 5 видно, что результаты, полученные при постановке НСТ-теста заявленным способом (с использованием позитивных образцов НСТ), во всех группах обследованных детей полностью коррелировали (по направленности и по относительным по сравнению с нормой количественным значениям) с подтвержденными (при предварительном клинико-лабораторном обследовании) функциональными показателями системы фагоцитоза. Применение негативных образцов НСТ позволило получить формальное совпадение направленности нарушений в системе фагоцитоза только у больных с подтвержденной клинико-лабораторными данными пониженной ФАФ (1-я группа). Однако при этом количественные значения показателя ФАФ (снижение на 96,7-98,5% по сравнению с нормой) не соответствовали аналогичным значениям, полученным как с помощью предварительного клинико-лабораторного обследования, так и при использовании позитивных образцов НСТ (снижение на 73,6-74,7% по сравнению с нормой). У больных с подтвержденной повышенной ФАФ (2-я группа) и у "практически здоровых" детей (3-я группа) при использовании негативных образцов НСТ все результаты определения ФАФ оказались ложнозаниженными в 100% случаев. При этом в обоих указанных группах было получено снижение ФАФ по сравнению с нормой: во 2-й группе - на 95,9-96,3% (подтвержденный результат - повышение ФАФ на 68,1-75,1% по сравнению с нормой); в 3-й группе - на 95,9-96,6% (подтвержденный результат - в диапазоне нормальных значений).
Для доказательства специфичности используемой в заявленном способе тест-культуры (Saccharomyces cerevisiae) были проведены сравнительные экспериментальные исследования на предмет наличия или отсутствия розового окрашивания КС трех позитивных образцов НСТ из партии 1-ПО /далее - "НСТ-1", "НСТ-2", "НСТ-3"/, приготовленных (для каждого из указанных образцов НСТ) с использованием в качестве исходных компонентов дрожжевых клеток и лейкоцитов в различных концентрациях. Предварительно готовили в трех пробирках объемом по 10 мл (каждая) 0,1% раствор каждого из трех исследуемых в данной серии опытов позитивных образцов НСТ (НСТ-1, НСТ-2, НСТ-3), растворенный в 0,9% растворе натрия хлорида. Затем приготавливали по методике заявленного способа КС каждого из указанных образцов НСТ /далее - "КС НСТ-1", "КС НСТ-2", "КС НСТ-3"/ с использованием в качестве исходного компонента взвеси дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для получения взвеси дрожжей использовали штамм Saccharomyces cerevisiae, выращенный на плотной питательной среде Сабуро. Выращенную культуру дрожжей трехкратно промывали в 0,9% растворе натрия хлорида согласно заявленному способу. Концентрация дрожжевых клеток в объеме плотного осадка (полученного после удаления надосадочной жидкости после последнего центрифугирования) составила 2,5×1012 клеток/мл плотного осадка. Внесли клетки из плотного осадка в 12 прозрачных центрифужных пробирок (№№1-12) в следующем количестве /далее - "опытные пробирки "Д"/:
в пробирки №№1, 5, 9 - по 0,0001 мл плотного осадка;
в пробирки №№2, 6, 10 - по 0,0003 мл плотного осадка;
в пробирки №№3, 7, 11 - по 0,0005 мл плотного осадка;
в пробирки №№4, 8, 12 - по 0,0006 мл плотного осадка.
После этого отобрали по четыре порции каждого из предварительно приготовленных растворов образцов НСТ-1, НСТ-2 и НСТ-3 объемом по 0,1 мл (каждая порция) и добавили указанные порции в пробирки (№№1-12), содержащие дрожжевые клетки из плотного осадка (в каждую из сгруппированных по четыре штуки пробирок /№№1-4; 5-8; 9-12/ - по одной порции одного из образцов НСТ /соответственно, НСТ-1, НСТ-2, НСТ-3/). Концентрация КС НСТ-1 в пробирках №№1-4; КС НСТ-2 в пробирках №№5-8 и КС НСТ-3 в пробирках №№9-12 составила, соответственно: (2,5×108), (7,5×108), (12,5×108) и (15,0×108) клеток дрожжей/мл раствора соответствующего образца НСТ /далее - "опытные пробы "Д"/. Параллельно с каждой из опытных проб "Д" в аналогичных пробирках /далее - "контрольные пробирки "Д"/ готовили контрольные пробы /далее - "контрольные пробы "Д"/. При этом в качестве исходного компонента для приготовления каждой контрольной пробы "Д" использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae в том же количестве, что и для соответствующей опытной пробы "Д" (равное количество дрожжевых клеток из плотного осадка). В каждую контрольную пробирку "Д", содержащую дрожжевые клетки, вносили 0,9% раствор натрия хлорида в объеме, равном объему раствора исследуемого образца НСТ, вносимого в соответствующую опытную пробирку "Д". Выдерживали каждую из опытных и контрольных пробирок "Д" в течение 8 мин при температуре 20°С (средние значения заявленного интервала оптимальных значений данных параметров). Визуальный анализ каждой из опытных проб "Д" производили дважды в сравнении с соответствующей контрольной пробой "Д": оценивали окраску содержимого опытной и контрольной пробирок "Д" непосредственно после приготовления опытных и контрольных проб "Д" и после выдерживания данных проб в указанных условиях.
Приготавливали КС образцов НСТ-1, НСТ-2 и НСТ с использованием в качестве исходного компонента взвеси лейкоцитов. Плазму крови, содержащую лейкоциты, получали по методике, приведенной в работе [7]. При этом к гепаринизированной крови (20 ЕД/мл) добавляли 10% желатин (на 10 мл крови - 1 мл 10% желатина). Ставили на 30 мин в термостат при 37°С. Плазму с лейкоцитами отсасывали пастеровской пипеткой и использовали для дальнейших исследований. Лейкоциты отмывали от плазмы три раза в 0,9% растворе натрия хлорида путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 15 мин. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость отсасывали пастеровской пипеткой. В объеме плотного осадка, полученного после удаления надосадочной жидкости, определили концентрацию лейкоцитов, которая составила 2,5×1011 клеток/мл плотного осадка. Внесли клетки из плотного осадка в 12 центрифужных пробирок (№№13-24) в следующем количестве /далее - "опытные пробирки "Л"/:
в пробирки №№13, 17, 21 - по 0,001 мл плотного осадка;
в пробирки №№14, 18, 22 - по 0,003 мл плотного осадка;
в пробирки №№15, 19, 23 - по 0,005 мл плотного осадка;
в пробирки №№16, 20, 24 - по 0,006 мл плотного осадка.
После этого отобрали по четыре порции каждого из предварительно приготовленных растворов образцов НСТ-1, НСТ-2 и НСТ-3 объемом по 0,1 мл (каждая порция) и добавили указанные порции в пробирки (№№13-24), содержащие лейкоциты из плотного осадка (в каждую из сгруппированных по четыре штуки пробирок /№№13-16; 17-20; 21-24/ - по одной порции одного из образцов НСТ /соответственно, НСТ-1, НСТ-2, НСТ-3/). Концентрация КС НСТ-1 в пробирках №№13-16; КС НСТ-2 в пробирках №№17-20 и КС НСТ-3 в пробирках №№21-24 составила, соответственно: (2,5×108), (7,5×108), (12,5×108) и (15,0×108) лейкоцитов/мл раствора соответствующего образца НСТ /далее - "опытные пробы "Л"/. При этом максимальная из исследуемых концентраций (15,0×10)8 лейкоцитов/мл раствора НСТ) определялась наибольшим количеством лейкоцитов, который удавалось выделить из плазмы крови с учетом допустимого объема крови, который мог быть отобран у обследуемого ребенка без ущерба для состояния его организма. Параллельно с каждой из опытных проб "Л" в аналогичных пробирках /далее - "контрольные пробирки "Л"/ готовили контрольные пробы /далее - "контрольные пробы "Л"/. При этом в качестве исходного компонента для приготовления каждой контрольной пробы "Л" использовали лейкоциты в том же количестве, что и для соответствующей опытной пробы "Л" (равное количество лейкоцитов из плотного осадка). Дальнейшее приготовление контрольных проб "Л" осуществляли аналогично описанному выше для контрольных проб "Д". Выдерживали каждую из опытных и контрольных пробирок "Л" в тех же условиях, что и пробирки "Д" (8 мин при температуре 20°С). Визуальный анализ производили аналогично описанному выше для опытных проб "Д".
Визуальный анализ КС, содержащих дрожжи и лейкоциты в различных концентрациях (соответственно, опытные пробирки "Д" №№1-12 и" опытные пробирки "Л" №№13-24), производили с использованием метода экспертной оценки, как это описано выше для постановки экспериментов первого этапа испытаний (с участием 60 экспертов). В ходе анализа устанавливался факт наличия или отсутствия розового окрашивания КС в каждой из исследуемых опытных пробирок ("Д" и "Л") после их выдерживания в заявленных условиях.
В табл.6 представлены результаты сравнительного визуального анализа КС, приготовленных с использованием в качестве исходных компонентов дрожжевых клеток и лейкоцитов в различных концентрациях (выборочно - на примере КС НСТ-1).
Сравнительные исследования возможности визуальной оценки реакции восстановления нитросинего тетразолия /НСТ/ в формазан при использовании контрольной смеси позитивного образца НСТ-1 /КС НСТ-1/, содержащей дрожжевые клетки и лейкоциты в различных концентрациях
Анализ результатов визуального анализа КС исследуемых позитивных образцов НСТ - КС НСТ-1 (данные табл.6), КС НСТ-2 и КС НСТ-3 - показал следующее. Непосредственно после приготовления содержимое опытных и контрольных пробирок "Д" представляло собой молочно-белый раствор, а содержимое опытных и контрольных пробирок "Л" - раствор с белесовато-мутным оттенком разной прозрачности в зависимости от концентрации лейкоцитов в растворе. После выдерживания в указанных условиях во всех опытных пробах "Д" (при всех исследуемых концентрациях дрожжевых клеток, для всех испытываемых образцов НСТ) всеми экспертами (в 100% случаев) было зафиксировано наличие розовой окраски КС. В то же время, при использовании лейкоцитов во всех опытных пробах "Л" (при всех исследуемых концентрациях клеток, для всех испытываемых образцов НСТ) после аналогичного выдерживания имела место адекватная экспертная оценка отсутствия розового окрашивания КС (цвет содержимого всех опытных пробирок "Л" был идентичен цвету содержимого соответствующих контрольных пробирок "Л").
Достижение обеспечиваемого изобретением технического результата обусловлено следующим. Известно, что фагоцитируемые микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы, простейшие) разрушаются в фагоцитах с помощью различных ферментов, в т.ч. и оксидаз свободных нуклеотидов НАД·Н и НАДФ·Н [2, 7]. Установлено, что многие живые клетки (преимущественно имеющие ядра) способны захватывать капли окружающей их жидкости. Это явление называется пиноцитозом [8]. При постановке НСТ-теста по методикам как способа-аналога [1], так и способа-прототипа [2] после инкубации с раствором НСТ в цитоплазме функционально активных фагоцитирующих клеток отмечается образование гранул формазана фиолетово-синего [1] или голубого [2] цвета, что видно при микроскопии с иммерсионным увеличением. Учитывая, что в указанных методиках постановки НСТ-теста реакция восстановления НСТ в нерастворимые гранулы формазана происходит в фагоцитах (лейкоцитах) в отсутствие корпускулярных объектов фагоцитоза, проникновение НСТ в фагоциты осуществляется, по мнению авторов изобретения, путем пиноцитоза.
Дрожжевые клетки традиционно не относятся к фагоцитам. Тем не менее, результаты экспериментальных исследований авторов заявленного способа показали, что после инкубации с раствором НСТ в дрожжевых клетках определяются (под иммерсионным увеличением) очень мелкие, пылевидные розовые включения, диффузно распределенные в объеме клетки. Эти включения, по мнению авторов предложенного способа, представляют собой гранулы формазана, образовавшиеся при восстановлении НСТ. Розовая (а не фиолетово-синяя или голубая) окраска указанных гранул, по-видимому, обусловлена более мелкими (по сравнению с фагоцитами) размерами этих гранул и, соответственно, более высокой их прозрачностью. Таким образом, полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что дрожжевые клетки содержат (так же как и фагоциты) оксидазы свободных нуклеодидов НАД·Н и НАДФ·Н, способные восстанавливать НСТ в формазан. Образование гранул формазана в дрожжевых клетках в присутствии НСТ, по мнению авторов изобретения, также происходит в результате пиноцитоза раствора указанного хромогенного реактива. Экспериментальные данные авторов изобретения позволили установить, что инкубация смеси, содержащей дрожжевые клетки в растворе НСТ /КС/, в некоторых случаях (при использовании ряда образцов НСТ, при определенных параметрах КС и условиях инкубации) приводила к появлению визуально (макроскопически) различимого розового окрашивания КС. При этом в пробах, где наблюдалось появление макроскопически различимой розовой окраски КС, при микроскопии под иммерсионным увеличением отмечалось образование гранул формазана розового цвета, что свидетельствовало о положительном результате реакции восстановления НСТ. Отсутствие (при тех же параметрах КС и условиях инкубации, но при использовании ряда других образцов НСТ) указанного изменения цвета КС в пробах при визуальном анализе коррелировало с полным отсутствием розовых гранул формазана при микроскопии, что свидетельствовало о том, что восстановление НСТ в этих пробах не произошло. Появление макроскопически различимой окраски КС при положительном результате реакции восстановления НСТ, по мнению авторов изобретения, обусловлено тем, что гранулы формазана образуются в поверхностных слоях дрожжевых клеток (в слоях цитоплазмы, примыкающих к мембране клетки, или в слоях клетки, находящихся в структуре мембраны) и/или относительно высокой прозрачностью мембран дрожжевых клеток, что, в свою очередь, приводит к образованию окраски КС достаточно интенсивной для визуального различения. Экспериментальные исследования авторов изобретения показали также, что после инкубации (при оптимальных значениях заявленных параметров) смеси, содержащей функционально активные фагоцитирующие клетки (лейкоциты) в растворе позитивного образца НСТ, даже при относительно высокой концентрации лейкоцитов в указанной смеси визуально различимой розовой окраски последней не наблюдалось (несмотря на наличие гранул формазана, определявшихся под иммерсионным увеличением). По мнению авторов предложенного способа, это может быть обусловлено тем, что в лейкоцитах гранулы формазана формируются в более глубоких слоях клеток (слоях, удаленных от мембраны клетки) и/или меньшей прозрачностью указанных фагоцитярующих клеток.
Таким образом, именно структурно-функциональные особенности мембран и поверхностных слоев цитоплазмы используемой тест-культуры клеток обеспечивают возможность предварительной макроскопической оценки способности НСТ к восстановлению в формазан. Это позволяет предварительно (до начала постановки НСТ-теста) оценить пригодность конкретного образца НСТ для использования в реакции фагоцитоза, что обеспечивает достоверность результатов НСТ-теста и, тем самым, повышает точность определения ФАФ.
В экспериментально подобранном интервале оптимальных значений концентраций КС достигается такое соотношение между количеством дрожжевых клеток и количеством внесенного хромогенного реактива - НСТ, которое является необходимым и достаточным для того, чтобы вызвать образование формазан-положительных клеток в количестве, достаточном для появления окраски КС такой интенсивности, которая является адекватной физиологической разрешающей способности органа зрения человека /далее - "физиологически адекватная интенсивность окрашивания КС"/, что обусловливает возможность адекватной экспертной оценки цвета КС как розового. Использование концентраций КС за пределами нижней и верхней границ интервала оптимальных значений приводит к образованию формазан-положительных клеток в количестве, недостаточном для обеспечения физиологически адекватной интенсивности окрашивания КС (интенсивность окрашивания КС - за пределами физиологических границ разрешающей способности органа зрения человека), в первом случае - из-за недостатка дрожжевых клеток по отношению к НСТ, а во втором случае - из-за их избытка. Это затрудняет либо делает невозможным визуальное установление факта наличия розового окрашивания КС и, как следствие, приводит к невозможности адекватной экспертной оценки указанного факта.
Оптимальный объем внесенного раствора НСТ (не менее 0,05 мл), с одной стороны, позволяет получить оптимальное соотношение между количеством дрожжевых клеток и количеством внесенного реактива (НСТ), что обусловливает физиологически адекватную интенсивность розового окрашивания КС и, соответственно, создает условия для адекватной экспертной оценки указанного цвета КС. С другой стороны, использование оптимальных значений указанного параметра (не более 0,1 мл) позволяет избежать неоправданного расхода дорогостоящего хромогенного реактива - НСТ (дополнительное преимущество).
Оптимальные температурные и временные параметры инкубации КС способствуют наиболее быстрому появлению физиологически адекватной интенсивности окрашивания КС при исключении возможности негативного воздействия физических факторов, затрудняющих визуальную оценку цвета КС. При выдерживании КС в условиях температур, находящихся за пределами нижней границы интервала оптимальных значений данного параметра (менее 18°С), возрастает время, необходимое для завершения реакции восстановления НСТ в дрожжевых клетках с образованием гранул формазана в количестве, обеспечивающем появление физиологически адекватной интенсивности окрашивания КС, и, соответственно, время, когда результаты экспертной оценки розового цвета КС становятся адекватными. При инкубации КС при температурах, превышающих верхнюю границу интервала оптимальных значений (более 22°С), сокращается время, требующееся для образования гранул формазана в количестве, достаточном для достижения физиологически адекватной интенсивности розового окрашивания КС. Однако при этом резко усиливается образование дрожжевыми клетками углекислого газа (СО2), что приводит к образованию белой пены в объеме КС уже на первых минутах инкубации, что, в свою очередь, исключает возможность адекватной экспертной оценки розового цвета КС при любом времени выдерживания, в т.ч. и при оптимальном. В условиях оптимальных температур использование оптимальных значений сроков инкубации КС (6-10 мин) обеспечивает возможность адекватной экспертной оценки розового окрашивания КС (при времени не менее 6 мин) при исключении (при времени не более 10 мин) возможности непроизводительных затрат рабочего времени персонала иммунологической лаборатории, участвующего в постановке НСТ-теста (дополнительное преимущество).
Дополнительное центрифугирование СИФ в ходе постановки НСТ-теста (в частности, в течение 5 мин при 750 об/мин) позволяет сконцентрировать клетки крови, в т.ч. фагоциты (за счет удаления жидкой части СИФ), и, тем самым, сократить время, затрачиваемое на определение ФАФ, в частности на подсчет в мазке формазан-положительных фагоцитов среди всех фагоцитов (дополнительное преимущество).
Использование заявленных интервалов оптимальных значений концентраций КС, объемов вносимого раствора НСТ, а также температурных и временных параметров инкубации обеспечивает возможность равноценного применения дрожжевых клеток независимо от их функционального состояния, что расширяет возможности заявленного способа. По мнению авторов изобретения, сухие дрожжи находятся, преимущественно, в функционально неактивном состоянии, и для восстановления их функциональных свойств при помещении их в раствор НСТ требуется некоторое время. Во взвеси дрожжевые клетки находятся в функционально активном состоянии и при заявленном разведении сохраняют свои функциональные свойства на том же уровне. Соответственно, использование взвеси дрожжей при варьировании указанных параметров инкубации за пределами интервалов оптимальных значений обусловливало более быстрое протекание реакции восстановления НСТ в клетках (с появлением в результате физиологически адекватной интенсивности окрашивания КС) при более низких температурах и при меньших концентрациях КС, чем в случае использования сухих дрожжей. Однако при высоких температурах (за верхней границей интервала оптимальных значений) более высокая изначальная функциональная активность дрожжевых клеток во взвеси (по сравнению с сухими) приводила к более выраженному газообразованию, что снижало точность визуальной оценки и исключало возможность адекватной экспертной оценки цвета КС. В пределах заявленных интервалов оптимальных значений параметров инкубации КС имела место адекватная экспертная оценка цвета КС независимо от функционального состояния используемых дрожжевых клеток, что свидетельствовало о возможности использования в рамках заявленного способа как сухих дрожжей, так и взвеси дрожжей при одинаковой достоверности получаемых результатов.
Способ осуществляют следующим образом. Предварительно готовят, например в пробирке объемом более 0,2 мл, 0,1% раствор НСТ, растворенный в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9%. Приготавливают КС рабочей концентрации, для чего часть предварительно приготовленного раствора НСТ смешивают с соответствующим количеством дрожжей Saccharomyces cerevisiae. При использовании в качестве исходного компонента для приготовления КС сухих дрожжей соответствующую навеску дрожжей помещают в прозрачную пробирку, например центрифужную. Отбирают, например дозированной пипеткой, часть предварительно приготовленного раствора НСТ объемом 0,05-0,1 мл и вносят в пробирку, содержащую навеску дрожжей. Массу навески определяют в зависимости от конкретного объема вносимого раствора НСТ с тем, чтобы обеспечить рабочую концентрацию КС 50-250 мг дрожжей/мл раствора НСТ. При использовании в качестве исходного компонента взвеси дрожжей КС готовят следующим образом. Для получения взвеси используют штаммы Saccharomyces cerevisiae, выращенные, например, на плотной питательной среде Сабуро. Выращенную культуру дрожжей смывают 0,9% раствором натрия хлорида и затем промывают три раза в 0,9% растворе натрия хлорида путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость отсасывают, например пастеровской пипеткой. В объеме плотного осадка, полученного после удаления надосадочной жидкости, определяют концентрацию дрожжевых клеток /далее - "исходная концентрация дрожжевых клеток"/. Отбирают, например с помощью автоматической дозированной микропипетки, соответствующее количество клеток из плотного осадка и вносят их в прозрачную пробирку, например центрифужную. Отбирают, например дозированной пипеткой, часть предварительно приготовленного раствора НСТ объемом 0,05-0,1 мл и вносят в пробирку с дрожжевыми клетками. Количество вносимых дрожжевых клеток определяют в зависимости от исходной концентрации дрожжевых клеток и конкретного объема вносимого НСТ с тем, чтобы обеспечить рабочую концентрацию КС (2,5-12,5)×108 клеток дрожжей/мл раствора НСТ. Выдерживают КС в течение 6-10 мин при температуре (20±2)°С, после чего производят визуальный анализ ее окраски. При наличии в КС розового окрашивания остальную часть предварительно приготовленного раствора НСТ используют для приготовления СИФ. Производят забор крови с антикоагулянтом у обследуемого лица. При этом в силиконированную центрифужную пробирку, содержащую 0,1 мл предварительно внесенного гепарина (2 ЕД гепарина в 0,1 мл), вносят 0,1 мл крови, взятой из пальца, и осторожно смешивают с гепарином. Приготавливают СИФ. При этом в силиконированную центрифужную пробирку, содержащую гепаринизированную кровь, вносят 0,1 мл предварительно приготовленного раствора НСТ (из оставшейся части). Инкубируют СИФ в течение 20 мин при температуре 37°С (например, в термостате). Оптимально после инкубации производить центрифугирование СИФ, например (как это предусмотрено методикой способа-аналога [1]) в течение 5 мин при 750 об/мин. Из содержимого пробирки, полученного после инкубирования СИФ, или из осадка, полученного после центрифугирования СИФ (если последнее производилось), готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах (2-3 мазка из каждой пробирки /пробы крови/). Приготовленные мазки сушат на воздухе, затем фиксируют по одной из известных методик, например в смеси этиловый спирт:формалин (в соотношении 9:1) в течение 30 с [1] или в абсолютном метиловом спирте в течение 10 мин [9]. Затем мазки окрашивают (по одной из известных методик) красителем, обеспечивающим избирательную окраску клеточных ядер, например (как это предусмотрено в способе-аналоге [1]) 0,1% раствором нейтрального красного, разведенного в 0,5% растворе натрия хлорида. После окрашивания ядер мазки просматривают под микроскопом в иммерсионной системе: на каждом из мазков считают не менее 200 клеток (общее число фагоцитов) и из их числа определяют процент формазан-положительных фагоцитов. Вычисляют средний процент формазан-положительных фагоцитов в мазке. Полученное значение указанного показателя сопоставляют с нормой, которая, по данным авторов изобретения, составляет (27,3±3,2) % формазан-положительных фагоцитов в мазке. По результатам сопоставления устанавливают наличие или отсутствие изменения исследуемого показателя по сравнению с нормой. При нахождении значений показателя в пределах нормы определяют нормальную ФАФ, при снижении показателя по сравнению с нормой - пониженную ФАФ, а при увеличении значения показателя по сравнению с нормой - повышенную ФАФ.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Мальчик Дима С., 6 лет. Доставлен в сопровождении родителей в поликлиническое отделение №41 ДГБ №1 для получения разрешения для плановой ревакцинации против полиомиелита. Жалоб ребенок и родители не предъявляли. Ребенок от нормальной беременности, срочных родов; период новорожденности без патологии. В анамнезе у ребенка редкие (1-2 раза в год) ОВРИ. Специалистами не наблюдается. Аллергических заболеваний нет. Предшествующие вакцинации без осложнений. Ребенок осмотрен педиатром. Диагноз: Практически здоров. Противопоказаний к вакцинации нет.
По желанию родителей было проведено комплексное обследование ребенка с применением различных клинических, инструментальных и лабораторных методов, в т.ч. и определение ФАФ с использованием известных методик. Кроме того, определение ФАФ производили также с помощью заявленного способа.
Согласно методике заявленного способа была произведена предварительная проверка двух образцов НСТ, полученных из разных источников /далее - "НСТ-К" и "HCT-L"/, на соответствие предложенному критерию пригодности. В ходе указанной проверки предварительно в двух пробирках, объемом по 1,5 мл каждая, готовили по 0,3 мл 0,1% раствора каждого из испытываемых образцов (НСТ-К и HCT-L), растворенного в 0,9% растворе натрия хлорида. Приготавливали КС каждого из испытываемых образцов (НСТ-К и HCT-L) с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в сухом виде и в виде взвеси. При использовании в качестве исходного компонента сухих дрожжей две навески дрожжей, массой по 2,5 мг каждая, поместили в две прозрачные центрифужные пробирки объемом по 10 мл. Дозированной пипеткой отобрали по 0,05 мл предварительно приготовленного раствора каждого из образцов НСТ и внесли в пробирки, содержащие навески дрожжей (каждый образец НСТ - в отдельную пробирку). Рабочая концентрация КС в каждой из указанных пробирок составила 50 мг дрожжей/мл раствора соответствующего образца НСТ /далее - "пробирки №№1К и 1L"/. Непосредственно после приготовления КС в пробирках №№1К и 1L имела молочно-белую окраску. При использовании в качестве исходного компонента взвеси дрожжей КС каждого из испытываемых образцов НСТ готовили следующим образом. Использовали штамм Saccharomyces cerevisiae, выращенный на плотной питательной среде Сабуро. Выращенную культуру дрожжей смыли 0,9% раствором натрия хлорида и затем промыли три раза в 0,9% растворе натрия хлорида путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость отсосали с помощью пастеровской пипетки. В объеме плотного осадка, полученного после удаления надосадочной жидкости, определили исходную концентрацию дрожжевых клеток, которая составила 2,5×1012 клеток/мл плотного осадка. Отобрали с помощью автоматической дозированной микропипетки по 0,0000125 мл плотного осадка и внесли в две прозрачные центрифужные пробирки объемом по 10 мл. Дозированной пипеткой отобрали по 0,05 мл предварительно приготовленного раствора каждого из образцов НСТ и внесли в пробирки с дрожжевыми клетками (каждый образец НСТ - в отдельную пробирку). Рабочая концентрация КС в каждой из указанных пробирок составила 2,5×108 клеток дрожжей/мл раствора соответствующего образца НСТ /далее - "пробирки №№2К и 2L"/. Непосредственно после приготовления КС в пробирках №№2К и 2L имела молочно-белую окраску. Выдерживали пробирки №№1К, 1L, 2К и 2L, содержащие КС испытываемых образцов НСТ, в течение 6 мин при температуре 18°С, после чего производили визуальный анализ окраски КС в каждой из исследуемых пробирок. В пробирках №№1К и 2К отмечено наличие выраженного розового окрашивания КС, что позволило сделать вывод о соответствии образца НСТ-К предложенному критерию пригодности и, соответственно, о возможности использования данного образца для приготовления СИФ в ходе постановки НСТ-теста. Содержимое пробирок №№1L и 2L после выдерживания в указанных условиях имело молочно-белую окраску, что свидетельствовало о несоответствии образца HCT-L предложенному критерию пригодности и, соответственно, о нецелесообразности использования данного образца для постановки НСТ-теста.
У обследуемого ребенка из пальца отобрали 0,1 мл крови, внесли ее в силиконированную центрифужную пробирку, содержащую 0,1 мл предварительно внесенного гепарина (2 ЕД гепарина в 0,1 мл), и осторожно смешали кровь с гепарином. Приготовили СИФ. При этом в силиконированную центрифужную пробирку, содержащую гепаринизированную кровь, внесли 0,1 мл предварительно приготовленного раствора образца НСТ-К (из оставшейся части). Проинкубировали СИФ в течение 20 мин при температуре 37°С (в термостате). Отцентрифугировали СИФ в течение 5 мин при 750 об/мин. Из осадка, полученного после центрифугирования СИФ, приготовили три мазка на обезжиренных предметных стеклах, высушили их на воздухе, после чего фиксировали в смеси этиловый спирт:формалин (в соотношении 9:1) в течение 30 с. Мазки окрасили 0,1% раствором нейтрального красного, разведенного в 0,5% растворе натрия хлорида (для окрашивания ядер). После окрашивания ядер мазки просматривали под микроскопом в иммерсионной системе: на каждом из мазков считали не менее 200 клеток (общее число фагоцитов) и из их числа определяли процент формазан-положительных фагоцитов. Вычислили средний процент формазан-положительных фагоцитов в мазке, который составил 27,9%. Сопоставление с нормой позволило определить у обследуемого ребенка нормальную ФАФ.
В ходе комплексного клинико-лабораторного обследования пациента выявлено следующее. При клиническом осмотре отклонений со стороны внутренних органов не обнаружено.
Анализ крови с формулой - без патологии.
В иммунограмме (относительное и абсолютное количество Т- и В-лимфоцитов; концентрация иммуноглобулинов А, М, G; содержание компонентов системы комплемента; спонтанная и индуцированная продукция цитокинов; уровень циркулирующих иммунных комплексов /ЦИК/; хемотаксис нейтрофилов; показатели ФАФ) отклонений от нормы не выявлено. В частности, показатели ФАФ, определенные согласно методике, изложенной в описании изобретения к патенту РФ №2242763 [9], составили: ФИ30=93% при норме 94,18%±1,55%); ФЧ30=10,9 (при норме 11,29±1,00); КФЧ=1,18 (при норме 1,16±0,04); ФИ120=94% (при норме 92,00%±2,52%); ФЧ120=9,2 (при норме 9,81±0,96); ИБН=68% (при норме 66,30%±2,58%). Значения всех указанных показателей фагоцитоза - в пределах нормы.
Таким образом, результаты комплексного обследования свидетельствовали об отсутствии нарушений в системе фагоцитоза. При этом результаты определения ФАФ, полученные с помощью заявленного способа, соответствовали результатам, полученным другими методами в рамках комплексного обследования.
Пример 2.
Больная Настя В., 7 лет. Доставлена в поликлиническое отделение №41 ДГБ №1 с жалобами на кашель и повышение температуры до 39°С. Больна в течение трех дней. Получала симптоматическую терапию (жаропонижающие и отхаркивающие средства), но состояние не улучшалось, в связи с чем обратилась в ДГБ №1. В анамнезе у ребенка редкие (1-3 раза в год) ОВРИ. Специалистами не наблюдается. Наследственность не отягощена.
При осмотре ребенка педиатром состояние расценено как среднетяжелое: лихорадит до 38,5°С, небольшая одышка, умеренный периоральный цианоз. При перкуссии грудной клетки выявлено притупление перкуторного звука над нижней долей правого легкого; здесь же при аускультации обнаружено ослабление дыхания, крепитирующие хрипы. Со стороны других внутренних органов патологии не выявлено. На рентгенограмме грудной клетки обнаружена инфильтрация нижней доли правого легкого. На основании клинических и рентгенологических данных поставлен диагноз: Внебольничная острая правосторонняя нижнедолевая пневмония. В этот же день девочка была госпитализирована на соматическое отделение №7 ДГБ №1, и ей было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование, в т.ч. и определение ФАФ известными методами. Кроме того, было произведено сравнительное определение ФАФ с использованием способа-прототипа [2] и заявленного способа.
В связи с временным отсутствием в иммунологической лаборатории как сухих дрожжей, так и культуры Saccharomyces cerevisiae, сначала был поставлен НСТ-тест по методике способа-прототипа [2] с использованием одного из имеющихся в иммунологической лаборатории образцов НСТ /далее - "НСТ-М"/ без предварительной оценки его пригодности. Согласно способу-прототипу [2] у обследуемого ребенка произвели забор крови в пробирку с гепарином аналогично примеру 1. Приготовили СИФ. При этом 0,1 мл гепаринизированной крови смешали с 0,1 мл 0,1% раствора образца НСТ-М в 0,9% растворе натрия хлорида. Проинкубировали СИФ в течение 20 мин при температуре 37°C. Из содержимого пробирки, полученного после инкубирования СИФ, приготовили три мазка и произвели их микроскопию (под иммерсионным увеличением). В каждом из мазков определили количество формазан-положительных фагоцитов в процентах от общего количества фагоцитов и вычислили средний процент формазан-положительных фагоцитов в мазке, который составил 0,7%. Сопоставление с нормой [2] свидетельствовало о выраженном снижении ФАФ (на 97,4% по сравнению с нормой).
При комплексном клинико-лабораторном обследовании больной были получены следующие результаты.
В анализе крови с формулой выявлено увеличение количества лейкоцитов до 16,7×10%; сдвиг в формуле влево (палочкоядерные 11%); увеличение СОЭ до 32 мм/ч.
В иммунограмме выявлено: незначительное увеличение количества В-лимфоцитов (СД20 25% при норме 11-16%); незначительное увеличение концентрации иммуноглобулина М (Ig M 150 мг % при норме 24-112 мг %); незначительное повышение ИЛ-1β (спонтанная продукция 53 пг/мл при норме 30-50 пг/мл) и ИЛ-2 (спонтанная продукция 0,65 ед./мл при норме 0-0,5 ед./мл); незначительное увеличение хемотаксиса нейтрофилов (индекс миграции под влиянием FMLP 3,1 при норме 2,6-2,8). Остальные иммунологические показатели - содержание Т-лимфоцитов; концентрация иммуноглобулинов A, G; содержание компонентов системы комплемента; индуцированная продукция цитокинов и уровень ЦИК - находились в пределах возрастных норм. Показатели ФАФ [9] составили: ФИ30=99%; ФЧ30=17,2; ФИ120=100%; ФЧ120=14,9; КФЧ=1,15; ИБН=67,3%. При сопоставлении с нормальными величинами выявлено повышение ФЧ30 (на 52,3% по сравнению с нормой) и ФЧ120 (на 51,9% по сравнению с нормой); остальные показатели - в пределах нормы.
Таким образом, результаты комплексного обследования свидетельствовали об активации системы фагоцитоза у данной больной.
В связи с тем что результаты определения ФАФ, полученные с помощью способа-прототипа [2], противоречили результатам, полученным с помощью других методов в рамках комплексного клинико-лабораторного обследования, из бактериологической лаборатории были получены образцы Saccharomyces cerevisiae в сухом виде и в виде выращенной культуры (штамм Saccharomyces cerevisiae, выращенный на плотной питательной среде Сабуро), и в этот же день было произведено повторное исследование крови ребенка в НСТ-тесте с другим образом НСТ /далее - "HCT-N"/ согласно заявленному способу.
В ходе осуществления заявленного способа предварительно была произведена проверка образца HCT-N на соответствие предложенному критерию пригодности. Параллельно такая же проверка на соответствие была проведена и в отношении образца НСТ-М, использованного ранее для постановки НСТ-теста по способу-прототипу. Проверка на соответствие образцов НСТ-М и HCT-N производилась аналогично примеру 1, включая приготовление 0,1% раствора каждого из указанных образцов, растворенного в 0,9% растворе натрия хлорида; приготовление КС каждого из указанных образцов с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в сухом виде и в виде взвеси и выдерживание каждой из исследуемых КС с последующим визуальным анализом их окраски. При использовании в качестве исходного компонента сухих дрожжей:
- масса каждой из двух навесок дрожжей, вносимых в две прозрачные центрифужные пробирки, - 15,0 мг;
- объем раствора каждого из исследуемых образцов НСТ, вносимого в пробирки, содержащие навески дрожжей, - по 0,1 мл;
- рабочая концентрация КС в каждой из указанных пробирок - 150 мг дрожжей/мл раствора соответствующего образца НСТ /далее -"пробирки №№1М и 1N"/;
- окраска КС в пробирках №№1М и 1N непосредственно после приготовления - молочно-белая.
При использовании в качестве исходного компонента взвеси дрожжей:
- исходная концентрация дрожжевых клеток - 3,0×1012 клеток/мл плотного осадка;
- количество дрожжевых клеток, вносимых в каждую из двух прозрачных центрифужных пробирок, - по 0,000025 мл плотного осадка;
- объем раствора каждого из исследуемых образцов НСТ, вносимого в пробирки с дрожжевыми клетками, - по 0,1 мл;
- рабочая концентрация КС в каждой из указанных пробирок - 7,5×108 клеток дрожжей/мл раствора соответствующего образца НСТ /далее - "пробирки №№2М и 2N"/;
- окраска КС в пробирках №№2М и 2N непосредственно после приготовления - молочно-белая.
Выдерживали пробирки №№1М, 1N, 2M и 2N, содержащие КС испытываемых образцов НСТ, в течение 10 мин при температуре 20°С. Результаты визуального анализа окраски КС:
- в пробирках №№1М и 2М после выдерживания в указанных условиях содержимое имело молочно-белую окраску, что позволило дать заключение о непригодности образца НСТ-М для использования при постановке НСТ-теста;
- в пробирках №№1N и 2N после выдерживания наблюдалась выраженная розовая окраска КС, что свидетельствовало о годности образца HCT-N для постановки НСТ-теста.
После завершения проверки на соответствие у обследуемого ребенка произвели забор крови в пробирку с гепарином аналогично примеру 1.
Приготовили СИФ с использованием образца HCT-N аналогично примеру 1. Средний процент формазан-положительных фагоцитов в мазке составил 41,8%, что позволило диагностировать у ребенка повышенную ФАФ (превышение нормы на 53,1%).
Таким образом, результаты определения ФАФ, полученные с помощью заявленного способа, полностью коррелировали с данными, полученными с помощью других методов в ходе комплексного обследования, не только в части, касающейся направленности изменений в системе фагоцитоза, но и в части, количественно характеризующей уровень указанного сдвига.
Пример 3.
Больной Миша В., 8 лет. Родители доставили ребенка в приемное отделение ДГБ №1 с жалобами на боли в животе, повышение температуры до 40°С. Ухудшение состояния ребенка отмечено в течение последней недели перед обращением: нарастающие по интенсивности боли в животе, ухудшение аппетита, нарастающая гипертермия. Родители считали ребенка больным с 3-летнего возраста, когда последний с аналогичной клинической картиной был госпитализирован в стационар; тогда же после проведенного обследования был диагностирован абсцесс печени, по поводу чего ребенок был прооперирован. С тех пор мальчик неоднократно госпитализировался в стационар с рецидивирующими аденофлегмонами мягких тканей; один раз - по поводу абсцедирующей пневмонии.
При поступлении в ДГБ №1 ребенок был осмотрен дежурным хирургом. При пальпации живота выявлена резкая болезненность в правом подреберье, увеличение печени на 3 см. Со стороны других органов патологии не обнаружено. При ультразвуковом исследовании органов брюшной полости выявлено округлое образование диаметром 4 см с уровнем жидкости в печени. Заподозрен абсцесс печени.
Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование, включая иммунологическое обследование, в т.ч. и определение ФАФ известными методами. Кроме того, было произведено определение ФАФ с использованием заявленного способа. Поскольку наличие абсцессов в печени требует проведения дифференциальной диагностики с эхинококкозом, в комплексное обследование было включено также серологическое исследование на эхинококк. Результаты серологического исследования оказались отрицательными, в связи с чем эхинококкоз был исключен.
Непосредственно после проведения комплексного обследования ребенок был прооперирован. При оперативном вмешательстве выявлен абсцесс в правой доли печени.
При постановке НСТ-теста по методике заявленного способа предварительно была проведена проверка выбранного для использования (из партии, полученной иммунологической лабораторией) образца НСТ (производства фирмы "ICN Pharmaceuticals, Inc.", США) /далее - "НСТ-Р"/, на соответствие предложенному критерию пригодности. Проверка на соответствие образца НСТ-Р осуществлялась аналогично примеру 1, включая приготовление 0,1% раствора указанного образца, растворенного в 0,9% растворе натрия хлорида; приготовление КС указанного образца с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в сухом виде и в виде взвеси и выдерживание исследуемой КС с последующим визуальным анализом ее окраски. При использовании в качестве исходного компонента сухих дрожжей:
- масса навески дрожжей, вносимой в прозрачную центрифужную пробирку, - 18,75 мг;
- объем раствора образца НСТ-Р, вносимого в пробирку, содержащую навеску дрожжей, - 0,075 мл;
- рабочая концентрация КС в указанной пробирке - 250 мг дрожжей/мл раствора образца НСТ-Р /далее - "пробирка №1P"/;
- окраска КС в пробирке №1P непосредственно после приготовления - молочно-белая. При использовании в качестве исходного компонента взвеси дрожжей:
- исходная концентрация дрожжевых клеток - 2,5×1012 клеток/мл плотного осадка;
- количество дрожжевых клеток, вносимых в прозрачную центрифужную пробирку, - 0,0000375 мл плотного осадка;
- объем раствора исследуемого образца НСТ-Р, вносимого в пробирку с дрожжевыми клетками, - 0,075 мл;
- рабочая концентрация КС в указанной пробирке - 12,5×108 клеток дрожжей/мл раствора образца НСТ-Р /далее - "пробирка №2Р"/;
- окраска КС в пробирке №2Р непосредственно после приготовления - молочно-белая.
Выдерживали пробирки №№1р и 2Р, содержащие КС испытываемого образца НСТ-Р, в течение 8 мин при температуре 22°С. Результаты визуального анализа окраски КС:
- в пробирках №№1Р и 2Р после выдерживания в указанных условиях отмечалось выраженное розовое окрашивание КС, что говорило о пригодности образца НСТ-Р для применения в реакции фагоцитоза.
После завершения проверки на соответствие у обследуемого ребенка произвели забор крови в пробирку с гепарином аналогично примеру 1. Приготовили СИФ с использованием образца НСТ-Р аналогично примеру 1. Средний процент формазан-положительных фагоцитов в мазке составил 0,8%, что свидетельствовало о пониженной ФАФ у пациента (снижение на 97,1% по сравнению с нормой).
В ходе комплексного клинико-лабораторного обследования больного было установлено следующее.
В анализе крови с формулой: увеличение количества лейкоцитов до 18,9×109/л; сдвиг в формуле влево (палочкоядерные 13%); увеличение СОЭ до 58 мм/ч.
В иммунограмме: увеличение количества В-лимфоцитов (СД20 32% при норме 11-16%); гипериммуноглобулинемия М и G (JgM 180 мг % при норме 24-112 мг %; JgG 1900 мг % при норме 583-1783 мг %); повышение ИЛ-2 (спонтанная продукция 0,8 ед./мл при норме 0-0,5 ед./мл); повышение уровня ЦИК (132 ед./мл при норме до 120 ед./мл). Остальные иммунологические показатели - содержание Т-лимфоцитов; концентрация иммуноглобулина А; содержание компонентов системы комплемента; индуцированная продукция цитокинов; хемотаксис нейтрофилов - в пределах возрастных норм. Показатели ФАФ [9] составили: ФИ30=36%; ФЧ30=2,0; ФИ120=28%; ФЧ120=2,0; КФЧ=0; ИБН=1,8%. В результате сопоставления с нормальными величинами выявлено значительное снижение всех показателей фагоцитоза по сравнению с нормой, особенно КФЧ (снижение на 100%) и ИБН (снижение на 97,3%).
Таким образом, данные комплексного обследования свидетельствовали о глубоких нарушениях в системе фагоцитоза, в частности о резком снижении переваривающей способности фагоцитов. При этом характер и выраженность (по сравнению с нормой) изменений ФАФ, выявленные с помощью заявленного способа, находились в полном соответствии с результатами, полученными с помощью других методов в рамках комплексного обследования. В целом, результаты комплексного обследования, в частности указание в анамнезе на повторные операции по поводу рецидивирующих абсцессов печени и мягких тканей в сочетании с резко сниженными показателями ФАФ, позволили поставить диагноз хронической гранулематозной болезни.
Заявленный способ был применен при обследовании 186 детей в возрасте от 7 дней до 16 лет, которое проводилось на базе стационара и поликлинического отделения (№41) ДГБ №1. Всем детям было проведено комплексное обследование с применением различных клинических, инструментальных и лабораторных методов, включая иммунологические методы (определение количества Т- и В-лимфоцитов; концентрации иммуноглобулинов А, М, G; содержания компонентов системы комплемента; определение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов; определение уровня ЦИК; исследование хемотаксиса лейкоцитов периферической крови по методике, приведенной в работе [2]; определение ФАФ по методике, приведенной в работе [9]). С учетом анамнеза, клинической картины и проведенного комплексного обследования были поставлены клинические диагнозы /далее - "результаты контрольного комплексного обследования (ККО)"/. При этом обследованные дети были распределены на следующие группы:
В ходе обследования дополнительно осуществляли также параллельную постановку НСТ-теста по методикам заявленного способа и способа-прототипа [2]. При этом, с целью моделирования реальных условий работы иммунологической лаборатории, а также учитывая необходимость получения воспроизводимых данных, достаточных для статистической обработки, анализы проводились с использованием четырех образцов НСТ /далее - "НСТ-А", "НСТ-В", "НСТ-С", "НСТ-Д"/, полученных перед обследованием из разных источников (без явных нарушений упаковки).
Статистическую обработку результатов обследования проводили с использованием критериев Фишера и Вилкоксона-Манна-Уитни [6].
Полученные результаты представлены в табл.7, 8. В таблице 7 дан сравнительный анализ точности определения ФАФ у детей с различными заболеваниями (по группам) и у практически здоровых детей с помощью заявленного способа и способа-прототипа при использовании четырех образцов НСТ (НСТ-А, НСТ-В, НСТ-С и НСТ-Д). В табл.8 приведены суммарные данные, характеризующие точность определения ФАФ с помощью заявленного способа и способа-прототипа.
Сравнение точности определения функциональной активности фагоцитов /ФАФ/ с помощью заявленного способа и способа-прототипа (по суммарным результатам) при использовании четырех образцов нитросинего тетразолия /НСТ-А, НСТ-В, НСТ-С, НСТ-Д/ (результаты определения ФАФ подтверждены с помощью контрольного комплексного обследования /ККО/)
Данные, приведенные в табл.7, 8, свидетельствуют о следующем. При обследовании детей с помощью заявленного способа в результате предварительного тестирования четырех образцов НСТ (НСТ-А, НСТ-В, НСТ-С, НСТ-Д) было выявлено несоответствие образцов НСТ-В и НСТ-Д предложенному критерию пригодности (негативные образцы НСТ). В соответствии с заявленным способом указанные негативные образцы НСТ не использовались для постановки НСТ-теста. Все результаты определения ФАФ заявленным способом (при параллельном применении позитивных образцов НСТ-А и НСТ-С) полностью коррелировали (как по направленности нарушений в системе фагоцитоза, так и по относительным /по сравнению с нормой/ количественным значениям) с данными ККО во всех группах (I-VIII) обследованных детей (результаты достоверны в 100% случаев). Постановка НСТ-теста по методике способа-прототипа осуществлялась с параллельным использованием всех четырех образцов НСТ (НСТ-А, НСТ-В, НСТ-С и НСТ-Д). При применении образцов НСТ-А и НСТ-С (согласно заявленному способу - позитивные образцы НСТ) наблюдалось полное совпадение результатов определения ФАФ с результатами ККО. При использовании в ходе постановки НСТ-теста образцов НСТ-В и НСТ-Д (согласно заявленному способу - негативные образцы НСТ) у 98,4% детей (I-VI, VIII группы) были получены ложнозаниженные результаты определения ФАФ, которые не подтверждались данными ККО (ни по направленности нарушений, ни по относительным /по сравнению с нормой/ количественным значениям) и не соответствовали данным, полученным с помощью способа-прототипа с использованием образцов НСТ-А и НСТ-С. При этом указанные ложнозаниженные результаты определения ФАФ (снижение на 95,6-99,3% по сравнению с нормой) достоверно не различались как между исследуемыми группами (как больных /I-VI/, так и здоровых /VIII/ детей), так и в пределах каждой из групп, куда входили больные с различной направленностью и выраженностью нарушений в системе фагоцитоза, установленными с помощью ККО (I группа -38 чел. с нормальной ФАФ, 19 чел. с повышенной ФАФ; II группа - 3 чел. с нормальной ФАФ, 19 чел. с повышенной ФАФ; III группа - 2 чел. с нормальной ФАФ, 15 чел. с повышенной ФАФ; IV группа - 33 чел. с нормальной ФАФ, 3 чел. с повышенной ФАФ; VI группа - 16 чел. с пониженной ФАФ, 1 чел. с нормальной ФАФ, 1 чел. с повышенной ФАФ). У 3 детей VII группы (больные с хронической гранулематозной болезнью) при формальном совпадении направленности нарушений в системе фагоцитоза с данными ККО количественные значения ФАФ, полученные при использовании образцов НСТ-В и НСТ-Д, были достоверно снижены по сравнению со значениями рассматриваемого показателя, полученными при использовании образцов НСТ-А и НСТ-С (соответственно, 0,83±0,45; 0,92±0,36; 0; 0% формазан-положительных клеток в мазке). Таким образом, результаты определения ФАФ, полученные с помощью способа-прототипа, оказывались достоверными только в случае использования позитивных (согласно заявленному способу) образцов НСТ. В случае использования негативных (согласно заявленному способу) образцов НСТ результаты определения ФАФ расценивались как ошибочные практически в 100% случаев. Таким образом, анализ данных табл.7, 8 позволяет сделать следующие выводы. При постановке НСТ-теста в условиях случайного чередования образцов НСТ из разных источников (без предварительного их тестирования согласно заявленному способу) вероятность получения ошибочных результатов определения ФАФ может колебаться от 0% (в обследуемой группе все используемые для анализа образцы НСТ соответствуют предложенному критерию пригодности) до 100% (в обследуемой группе все используемые для анализа образцы НСТ несоответствуют предложенному критерию пригодности). Условно допуская, что в обследуемой группе анализы проводятся с одинаковой вероятностью использования позитивных (согласно заявленному способу) и негативных (согласно заявленному способу) образцов НСТ, частота ложнозаниженных результатов составит 49,2% (табл.8).
Согласно практическому опыту авторов изобретения в реальных условиях работы иммунологической лаборатории частота ложнозаниженных результатов определения ФАФ, полученных при постановке НСТ-теста по методикам способа-прототипа [2] и способа-аналога [1] в условиях случайного чередования образцов НСТ из разных источников, составляет 25-33%. Это свидетельствует о том, что негативные (согласно заявленному способу) образцы НСТ составляют 25-33% от общего количества образцов НСТ, поступающих в иммунологическую лабораторию. Таким образом, реализация заявленного способа позволяет повысить точность определения ФАФ на 25-33% за счет исключения возможности получения ложнозаниженных результатов, обусловленных применением образцов НСТ с утраченной способностью к восстановлению в формазан.
Источники информации
1. Шубич М.Г., Медникова В.Г. NBT-тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях // Лабораторное дело. - 1978. - №9. - С.515-517.
2. Иммунологические методы: Пер. с нем. / Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.333-338, 378-386, 387-389 (прототип).
3. Nitroblue Tetrazolium. - Internet.: http: // www. jtbaker.com /msds/ englishhtml / n5100.htm.
4. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С.301.
5. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия: Пер. с англ. / Под ред. В.В.Португалова. - М.: Мир, 1969. - С.130-134, 304-305.
6. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С.72-75, 84-91.
7. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. - СПб.: ТОО Издательство "Гиппократ", 1998. - С.113, 143-144.
8. Энциклопедический словарь медицинских терминов: В 3 т./ Гл. ред. Б.В.Петровский. - М.: Советская энциклопедия, 1983. Т.2. - С.323.
9. Патент РФ №2242763, G 01 N 33/53, 20.12.2004, Бюл. №35.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ПОМОЩИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА | 2019 |
|
RU2727880C1 |
| СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПРЕСС НСТ-ТЕСТА ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ СОБАК | 2007 |
|
RU2379685C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ | 1999 |
|
RU2143693C1 |
| Способ определения активности фагоцитов крови | 1984 |
|
SU1326998A1 |
| ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ | 1999 |
|
RU2172631C2 |
| Способ получения биологически активных компонентов из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и лечебное средство на их основе | 2018 |
|
RU2722731C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ | 2003 |
|
RU2242763C1 |
| ДОБАВКА БЕЛКОВАЯ СУШЕНАЯ ИЗ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE | 2017 |
|
RU2686810C2 |
| СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОГЛОТИТЕЛЬНОЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЕТОДАМИ ФАГОЦИТОЗА И НСТ-ТЕСТА | 2003 |
|
RU2249215C2 |
| Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов | 1987 |
|
SU1652871A1 |
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, аллергологии, пульмонологии, дерматологии, микробиологии; ветеринарии, и может быть использовано для оценки пригодности хромогенного реактива - нитросинего тетразолия /НСТ/ для применения в реакции фагоцитоза при оценке иммунного статуса здорового и больного организма. Способ включает: приготовление контрольной смеси /КС/; забор крови с антикоагулянтом; приготовление смеси для исследования фагоцитоза /СИФ/ путем внесения в исследуемую пробу крови предварительно приготовленного 0,1% раствора НСТ, растворенного в 0,9% растворе натрия хлорида; инкубацию СИФ; приготовление мазков из проинкубированной СИФ с последующим определением количества формазан-положительных фагоцитов в процентах от общего количества фагоцитов и оценкой ФАФ путем сопоставления полученных значений с нормальными величинами. Для приготовления КС часть предварительно приготовленного раствора НСТ объемом не менее 0,05 мл смешивают с дрожжами Saccharomyces cerevisiae и выдерживают полученную КС в течение не менее 6 мин при температуре (20±2)°С, затем анализируют окраску КС и используют остальную часть раствора НСТ для приготовления СИФ только при наличии в КС розового окрашивания. Реализация заявленного способа позволяет повысить точность определения ФАФ на 25-33% за счет исключения возможности получения ложнозаниженных результатов, обусловленных применением образцов НСТ с утраченной способностью к восстановлению в формазан. 6 з.п. ф-лы, 8 табл.
| Иммунологические методы | |||
| Под.ред | |||
| Г.ФРИМЕЛЯ | |||
| - М.: Медицина, 1987, с.333-338, 384-389 | |||
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ | 2003 |
|
RU2242763C1 |
| RU 22446113 C1, 10.02.2005 | |||
| US 2004171013 A, 02.09.2004 | |||
| US 5858690 A, 12.01.1999 | |||
| DE 19632671 A1, 19.02.1998. | |||
