СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, к области патофизиологии и иммунологии. Описан способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов путем приготовления мазков крови на предметных стеклах после предварительной 30-минутной инкубации ее при 37^oC с окрашенными анилиновым черным микробами; фиксацией их высушиванием на воздухе и обработкой метиловым алкоголем с последующим окрашиванием их 2% водным раствором метилового зеленого в течение 15 минут и докрашиванием 0,1% водным раствором эозина; последующей отмывкой мазка от избытка красителей, повторным высушиванием его и подсчетом ста или в лучшем случае несколько сот лейкоцитов (Авторское свидетельство N 4345976/14 "Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов").

Задачей изобретения является улучшение дифференцировки объекта фагоцитоза от субцеллюлярных частиц лейкоцитов, упрощение технологии и сокращение расхода времени.

Решение поставленной задачи достигается путем замены определения показателей фагоцитоза (фагоцитарного числа, индекса захвата) в мазках на предметных стеклах, фиксацией их, окрашиванием, отмывкой и повторным высушиванием - на определение их в счетной камере Горяева с использованием в качестве объекта фагоцитоза клеток пекарских дрожжей (ПД), меченных предварительно трепановой синькой в интенсивно синий цвет, что обеспечивает хорошую дифференцируемость их от субцеллюлярных частиц фагоцитов; подготовка ПД не требует специальной микробиологической технологии, как в случае использования микробов в качестве объекта фагоцитоза; дополнительно отпадает необходимость в отдельном подсчете общего (абсолютного) числа лейкоцитов для перевода процентных величин показателей фагоцитоза в абсолютные величины в 1 мкл. Способ осуществляется следующим образом. Готовят взвесь клеток ПД. Для этого вносят в центрифужную пробирку на 10 мл 20-50 мг замороженных ПД, хранимых в холодильнике, добавляют 4 мл дистиллированной воды, инкубируют 5-10 мин при 37^oC, периодически встряхивая пробирку. Переносят 0,4 мл полученной взвеси в пробирку объемом на 10 мл, добавляют 1,5-2 мл 10% водного раствора трипановой синьки, смесь кипятят на водяной бане 30 мин, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, супернатант сливают. Осадок, состоящий из меченных трипановой синькой (ТС) клеток ПД, отмывают от свободного избытка ТС, обычно двукратно добавлением 3 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 1000 об/мин. Признаком достаточной отмывки является просветление супернатанта, который сливают; к полученному осадку добавляют 1,2 мл плазмы крови IV группы человека (для опсонизации), инкубируют 30 мин при 37^oC; центрифугируют; осадок отмывают от избытка свободной плазмы добавлением 2 мл физ.раствора (0,9%) поваренной соли и последующим повторным центрифугированием при 1000 об/мин 7 мин; осадок ресуспендируют в 0,4 мл физиологического раствора (0,9%) поваренной соли. Приготовленную взвесь ПД можно хранить для опытов в холодильнике при 4^oC в течение 3-6 дней. Параллельно выделяют лейкомассу из 5-6 мл исследуемой гепаринизированной крови путем отстаивания в течение 1,5-2 часов и последовательного центрифугирования при 500 и 1000 об/мин (60-200 g) 10 мин; лейкомассу освобождают от примеси эритроцитов "мягким" осмолизисом дистиллированной водой в течение 1-2 с, с последующим добавлением к системе гипертонического (3,6%) раствора поваренной соли из расчета 1 мл 3,6% раствора NaCl на 3 мл H₂О. Центрифугируют; к осадку лейкоцитов добавляют 0,5-1 мл физиологического раствора (0,9%) NaCl. Подсчитывают в камере Горяева исходную концентрацию лейкоцитов и готовят взвесь лейкоцитов, содержащую 12-25 тыс. клеток в 1 мкл. Подробно технология выделения лейкомассы описана в авторском свидетельстве N 1735784 "Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе" (Бюлл. "Изобретения", 1992, N 19 и журнал "Патологическая физиология и экспериментальная терапия", 1991, N 1: с.46-50).

Выравнивают концентрации меченных трипановой синькой клеток ПД добавлением физиологического раствора (0,9% NaCl) так, чтобы величина ее превышала концентрацию лейкоцитов минимум в 3-5 раз. Готовят фагоцитарную смесь, состоящую из 0,4 мл приготовленной лейкомассы (12-15 тыс. грануло- и моноцитов в 1 мкл) и 0,4 мл взвеси меченных трипановой синькой и опсонизированных клеток ПД, инкубируют смесь при 37^oC 40 минут. После окончания инкубации к 0,19 мл "фагоцитарной смеси" добавляют для фиксации и слабой светло-синей окраски лейкоцитов 0,38 мл 3% уксусной кислоты и 0,015 мл 1% метиленовой синьки. Каплю полученной смеси вводят в камеру Горяева. Лейкоциты и их субцеллюлярные частицы окрашиваются в светло-синий цвет, четко отличающиеся от окрашенных в темно-синий или фиолетовый цвет клеток ПД. Лейкоциты имеют вид точно такой, как показано в гематологическом практикуме (см. Козловская Л.В. , Мартынова М.А. "Учебное пособие по клиническим методам исследования". - М. Медицина, 1975. - с. 60-63); клетки ПД по форме близки к шарикам, сходным с тромбоцитами.

Подсчитывают: 1. Общее абсолютное количество лейкоцитов в 100 больших квадратах сетки камеры Горяева; 2. Число фагоцитов, захвативших клетки ПД - абсолютное и процентное - это фагоцитарное число; 3. Количество клеток ПД в каждом фагоците, захватившем их; суммируют их и делят на фагоцитарное число - это индекс захвата; 4. Наконец умножают фагоцитарное число в абсолютном и процентном выражении на индекс захвата - это общая фагоцитарная емкость - абсолютная (в 1 мкл) и процентная. Считают число клеток с помощью объектива 20 и окуляра 15 или объектива 70 с водной иммерсией и окуляра 10.

Пример: Из 5-6 мл гепаринизированой крови венозной крови пациента или донора выделяем отстаиванием и последовательным центрифугированием при 500-1000 об/мин лейкомассу, готовят взвесь лейкоцитов (содержащую фагоциты - грануло- и моноциты) с конечной концентрацией 12-25 тыс. в 1 мкл. В качестве объекта фагоцитоза используют заранее меченные трипановой синькой в интенсивно синий цвет ПД. Подсчитывают концентрацию клеток ПД в 1 мкл и выравнивают ее так, чтобы на 1 лейкоцит приходилось 3-5 или более клеток ПД. 0,4 мл взвеси лейкоцитов инкубируют с 0,4 мл взвеси клеток ПД при 37^oC в течение 40 мин. К 0,19 мл инкубированной смеси добавляют для фиксации и слабой окраски лейкоцитов 0,38 мл 3% уксусной кислоты и 0,015 мл 1% метиленовой синьки; каплю этой смеси вводят в камеру Горяева; лейкоциты и их субцеллюлярные частицы окрашены в светло-синий цвет и четко отличимы от окрашенных в темно-синий цвет клеток ПД, имеющих круглую форму (d=2-2,5 мкм) и сходных с тромбоцитами. Лейкоциты имеют вид точно такой, как показано на выпускаемых медучпособиях и гематологических таблицах. Подсчитывают в 100 больших квадратах сетки камеры Горяева с последующим переводом в 1 мкл общее число лейкоцитов, оно было равно у пациента - 12000 в 1 мкл, фагоцитарное число - абсолютное = 5500 в 1 мкл взвеси, процентное = 45,8, индекс захвата через 40 минут = 1,4 клеток ПД. Рассчитывают общую фагоцитарную емкость путем умножения индекса захвата на фагоцитарное число - его абсолютную (в 1 мкл) и процентную величины. Фагоцитарная емкость равна: абсолютная - 7700 клеток ПД, и процентная 45,8 • 1,4 = 64.12 клеток ПД.

Изобретение относится к медицине, к области патофизиологии и иммунологии. Задачей изобретения является улучшение дифференцировки объекта фагоцитоза от субцеллюлярных частиц лейкоцитов, упрощение технологии и сокращение расхода времени. У обследуемого проводят забор 5-6 мл гепаринизированной крови. Отстаиванием и центрифугированием выделяют лейкоциты. Готовят взвесь лейкоцитов с конечной концентрацией 12-25 тыс. клеток в 1 мкл. В качестве объекта фагоцитоза используют предварительно меченные трипановой синькой в интенсивно синий цвет пекарские дрожжи (ПД). Концентрацию ПД выравнивают до 3-5 или более клеток на 1 лейкоцит. Взвесь лейкоцитов инкубируют с 0,4 мл взвеси клеток ПД при 37°С в течение 40 мин. Подсчет фагоцитарных клеток проводят в камере Горяева. Способ позволяет одновременно подсчитывать абсолютные и процентные величины фагоцитарных показателей в 1 мкл исследуемой взвеси, сократить число манипуляций, при этом улучшается дифференцировка объекта фагоцитоза от субцеллюлярных частиц фагоцитов, отпадает необходимость в микробиологической технике подготовки объекта фагоцитоза и в отдельном дополнительном подсчете общего (абсолютного) числа лейкоцитов, в целом повышается точность и упрощается вся технология определения фагоцитарных показателей.

Способ определения показателей фагоцитарной активности лейкоцитов, включающий выделение лейкоцитов, подготовку объекта фагоцитоза, его окрашивание, инкубацию лейкоцитов с объектом фагоцитоза и подсчет клеток, отличающийся тем, что в качестве объекта фагоцитоза используют клетки пекарских дрожжей, предварительно меченых трипановым синим, а подсчет ведут в камере Горяева.