СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ПРИ ДИСБАКТЕРИОЗЕ Российский патент 2025 года по МПК A61K36/64 A61P1/00 A23L7/104 

Изобретение относится к медицине, более точно к фармации, и может быть использовано при разработке препаратов пребиотиков и метапребиотиков.

Пребиотики и метапребиотики это пищевые вещества, избирательно стимулирующие рост и (или) биологическую активность представителей защитной микрофлоры кишечника человека, способствующие поддержанию ее нормального состава и биологической активности, т.е. обеспечивающие как профилактический, так и лечебный эффекты.

Известен способ получения препарата, обладающего вышеуказанной биологической активностью, включающий культивирование Saccharamyces cerevisiae (vim) ВКМП Y-511 на отрубях (см патент RU 2206330 C1, 2003). Цитируемый способ используется также при получении таких препаратов как ««Ультрасорб» (https://www.100best.ru/content/tovary-i-predpriyatiya?i1=1920&i2=5219) и «Рекифлор»(https://e-ecolog.ru/crc/77.99.23.3.Y.3620.4.06?ysclid=1wt8h610k6801401828&utm_referrer=https%3A%2F%2 Fya.ru%2F). Важная роль в реализации действия указанных препаратов принадлежит растворимым и нерастворимым пищевым волокнам, а также содержащимся в них биологически активным веществам. Как установлено в последнее время большое значение в реализации действия пребиотиков имеют короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), образующиеся при ферментировании волокон препарата в желудочно-кишечном тракте. КЖК участвуют в поддержании целостности барьеров организма (кожа, слизистые), в т.ч. желудочно-кишечного тракта, являющихся важнейшим фактором врожденного иммунитета. Недостаток КЖК, ведет к эндогенному голоданию энтероцитов и может быть причиной язвенного колита и других воспалительных состояний. (Wilson A.J., Byron К., Gibson P.R., 1999). Такие КЖК, как ацетат, пропионат, бутират и валерат стимулируют выработку IL-8, являющегося физиологическим инициатором хемотаксической миграции лейкоцитов, а также миграции клеток эпителия толстой кишки в модели in vitro (см. Ферментированные пищевые волокна и короткоцепочечные жирные кислоты как компоненты функционального питания https://cvberleninka.ru/article/n/fermentirovannye-pischevye-volokna-i-korotkotsepochechnye-zhirnye-kisloty-kak-komponenty-f unktsionalnogo- pitaniya?ysclid=lwt8vma6rr124479503).

Однако во многих случаях, несмотря на наличие нормального потребления волокон, сам процесс ферментации волокон в желудочно-кишечном тракте может быть нарушен, что приводить к недостаточной выработке КЖК и их недостаточного количества кишечнике и организме. Такие состояния развиваются при приеме в пищу веществ, замедляющих развитие и нормальный рост флоры, например антибактериальных агентов, консервантов, антибиотиков и т.д. Таким образом, в результате общего пищевого-ферментного истощения выработка КЖК может снижаться, например, до такого уровня, что отсутствует адекватное энергетическое и защитное снабжение кишечника. При уменьшенной или недостаточной концентрации КЖК в полости толстой кишки самым подходящим действием является экзогенное поступление достаточного количества их непосредственно в толстую кишку. Однако отсутствие коммерческих препаратов затрудняет применение короткоцепочечных жирных кислот в клинической практике. В России с 2011 года зарегистрирован и широко применяется для лечения ряда заболеваний ЖКТ только 1 препарат Закофальк на основе масляной кислоты и инулина в дозе по 250 мг, которые помещены в полимерную мультиматриксную капсулу NMX. Этот препарат показал высокую эффективность при терапии гастроэнтерологических заболеваний. Однако он содержит только 1 компонент из числа КЖК - масляную кислоту. Аналогичный препарат описан в патенте RU 2528106 C2, который представляет собой пероральную фармацевтическую композицию для лечения кишечных нарушений, содержащую масляную кислоту или ее соли, в сочетании с растворимым или диспергируемым в воде пищевым волокном, выбранным из инулина, мальтодекстрина или их смеси Известна роль остальных представителей КЖК (ацетат, пропионат и валерат), что свидетельствует о необходимости включения их в лечебные средства. Мы предположил, что целесообразно увеличить содержание КЖК в выпускаемых нами препаратах пребиотиках, изготовленных на основе пищевых волокон, которые поставляют в кишечник адсорбированные требуемые метаболиты - недостающие КЖК.

Неожиданно нами было обнаружено, что если при получении средства по патенту RU 2206330 C1 провести предварительное неоднократное культивирование Saccharamyces cerevisiae (vini) ВКМП Y-511, то можно получить продукт, содержащий намного больше КЖК, чем продукт по прототипу.

Прототипом заявленного изобретения является техническое решение по вышеуказанному патенту RU 2206330 C1, 2003 г., в котором описан способ получения лечебно профилактического средства, обладающего выраженной биологической активностью. Способ включает культивирование Saccharamyces cerevisiae (vini) ВКМП Y-511 на отрубях путем их предварительного увлажнения водой определенного состава, засева отрубей вышеуказанной культурой, последующей тепловой обработки субстрата и стерилизации конечного продукта.

Недостатком его является то, что указанное средство содержит низкое количество короткоцепочных жирных кислот.

Техническим результатом изобретения является создание средства, расширяющего арсенал лечебно-профилактических средств при дисбактериозе.

Этот технический результат достигается тем, что в способе получения лечебно-профилактического средства, включающем ферментацию пшеничных отрубей путем засеивания их дрожжами штамма Saccharоmyces cerevisiae (vini) ВКМП Y-511, последующее выдерживание субстрата при температуре 29°С при постоянном перемешивании его до достижения в среде требуемого количества микроорганизмов, инактивирование микробной культуры путем прогрева всей среды при температуре 100°С, с последующей сушкой полученного субстрата и фасовкой конечного продукта, перед засеиванием отрубей винными дрожжами штамма Saccharomyces cerevisiae vini ВКПМ Y-511 культуру этого штамма подвергают неоднократному культивированию, для чего вначале культивирование ведут в пробирках на среде, 1 л которой содержит глюкозы 20,0 г, пептона - 10,0 г, дрожжевого экстракта - 5,0 г, агара - 20,0 г, воды - остальное, до достижения концентрации дрожжевых клеток 30 млрд клеток на 1 грамм микробной массы, затем культуру из пробирки переносят в жидкую питательную среду, приготовленную из расчета 72 г отрубей пшеничных на 1,25 л артезианской воды, и выдерживают при температуре 29°С в течение 48 часов, далее культивирование ведут на твердом субстрате, для чего в предварительно автоклавированные пшеничные отруби, увлажненные водой из расчета 1,25 л воды на 1 кг отрубей, вносят по 75 мл жидкой культуры дрожжей, полученной на предыдущей стадии культивирования, и выдерживают в стационарном положении в термальной комнате при температуре 29°С в течение 20 часов, а засев пшеничных отрубей производят полученным субстратом в смесителе, для чего пшеничные отруби предварительно увлажняют УФ-стерилизованной водой, после внесения субстрата образовавшуюся массу тщательно перемешивают и помещают на поддоны, распределяя их слоем толщиной 4 см, поддоны помещают в термостат для проведения стадии ферментации, ферментацию ведут при температуре 29°С в течение 22 часов, образовавшийся после ферментации субстрат высушивают до влажности продукта 10% и инактивации дрожжей, высушенные ферментированные отруби пропускают через дробилку-измельчитель для получения конечного продукта в виде крупки.

Способ осуществляют следующим образом.

В производстве используется штамм винных дрожжей Saccharomyces cerevisiae vini ВКПМ Y-511, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва. Условия культивирования штамма - в соответствии с паспортом, на полноценной среде производства https://vkpm.genetika.ru/katalog-mikroorganizmov/show30933/, 1 л которой содержит глюкозы 20,0 г, пептона - 10,0 г, дрожжевого экстракта - 5,0 г, агара - 20,0 г, воды -остальное, при температуре 29°С.

Норма расхода среды на одну пробирку приблизительно 8 мл. Перед использованием пробирок для рассева их тщательно проверяли на обсемененность посторонней микрофлорой.

Все манипуляции с культурой дрожжей проводят с соблюдением требований асептики: тщательная мойка и обеззараживание посуды, оборудования, помещений, стерилизация питательных сред, воды и растворов, обеззараживание воздуха с помощью бактерицидных ламп и фильтров.

Пересевы культуры проводятся в универсальной настольной бактерицидной камере. Осуществляется постоянный контроль на отсутствие контаминации культуры посторонней микрофлорой путем микроскопирования.

Концентрацию дрожжевых клеток на всех этапах технологического процесса определяют путем их подсчета в камере Горяева.

Минимальная концентрация клеток дрожжей после культивирования на 30 млрд клеток на 1 грамм среды микробной массы.

1. Культивирование в жидкой питательной среде

Для этого в 2-л колбы с жидкой питательной средой, приготовленной из расчета отруби пшеничные 72,0 г на 1,25 л воды артезианской, вносят культуру из пробирки на полноценной среде. Культивирование ведут в термальной комнате при температуре 29°С стационарно в течение 48 часов. Обычно к концу культивирования количество микробных клеток составляет 1 млрд клеток в 1 мл среды.

2. Культивирование на твердофазной среде

В пшеничные отруби добавляют воду из расчета 1,25 л воды на 1 кг отрубей, перемешивают до равномерного смачивания твердой фазы. Далее отруби автоклавируют и помещают в поддоны из сплава, разрешенного для использования в пищевой промышленности. В эти смоченные и автоклавированные отруби вносят по 75 мл жидкой культуры дрожжей, полученной на предыдущей стадии, культивируют в стационарном положении в термальной комнате при температуре 29°С в течение 20 часов.

3. Засев

Отруби пшеничные взвешивают на весах, загружают в смеситель, добавляют теплую (30°С) воду, пропущенную через ультрафиолетовую обеззараживающую установку и твердофазную культуру дрожжей.

Концентрация дрожжевых клеток в жидкой культуре перед культивированием, в начале культивирования составляет 2,5 млрд дрожжевых клеток в 1 г. твердофазной культуры. Форма клеток элипсоидальная, овальная, круглая. Субстрат тщательно перемешивают, Продолжительность замеса около 6 мин. Скорость вращения месильного органа обычно 51 об/мин.

4. Ферментация отрубей

После тщательного перемешивания засеянные отруби помещают на поддоны, распределяя их слоем толщиной 4 см, поддоны устанавливают на рамы и помещают в термостат. Ферментацию ведут при температуре 29°С в течение 22 часов. Температуру регистрируют с помощью термометров. Концентрация дрожжевых клеток в конце процесса не менее 50 млрд клеток на 1 кг отрубей.

5. Высушивание субстрата и термоинактивация дрожжей

Отруби, ферментированные винными дрожжами, (полуфабрикат) достают из термостата, проверяют органолептические данные (запах, вид), определяют рН, концентрацию дрожжевых клеток. Затем полуфабрикат отправляют на сушку. Высушивание ведут при температуре 100°C до достижения влажности продукта 10%.

6. Подготовка к фасовке и фасовка

Высушенные ферментированные отруби пропускают через специальную дробилку-измельчитель для получения крупки.

Фасовка проводится с использованием автоматического устройства.

Вышеописанным способом были получены 5 образцов предлагаемого средства.

Определение содержания короткоцепочечных жирных кислот

(КЖК) в супернатанте предлагаемого средства.

Предварительно готовили образцы. Навеску средства в количестве 0,1 г помещали в пробирку с коническим дном, приливали 2 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора, перемешивали путем встряхивания в течение 10 минут, добавляли 0,5 мл 1 N HCI (для определения связанных кислот) (при определении свободных кислот добавление HCI не требуется), центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин.

Методом газожидкостной хроматографии исследовали количественное и качественное содержание короткоцепочечных жирных кислот.

Микрошприцем вводят пробу надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования исследуемого образца, около 1 мкл. В испаритель хроматографа с детектором ионизации в пламени, снабженном кварцевой капиллярной колонкой длиной 36 м с внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,33 мкм.

Режим работы хроматографа: изотермический с температурой термостата 150°С, температурой испарителя и детектора 230°С. Газ-носитель - азот, расход газа-носителя 2,0 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Соотношение потоков газа - носителя на сброс и в колонку 50: 1. Время хроматографирования около 8 мин.

Определение абсолютного содержания индивидуальных кислот в смеси осуществляли как путем расчета площадей хроматографических пиков как методом «треугольника», так и методом компьютерной обработки хроматограмм.

В таблице 1 представлены результаты количественного определения КЖК в 5 образцах средства, полученного согласно заявленному способу.

При статистической обработке полученных результатов содержание уксусной кислоты составило 0,949±0,015, пропионовой кислоты 0,148±0,014, масляной кислоты 0,746±0,022, валериановой кислоты 0,029±0,016 мг/мл при общем содержании КБК, равном 1,334±0,026 мг/мл.

При исследовании Рекицен РД, полученного по способу прототипу, содержание ацетата составляло 0,262±0,021 мг/г. пропионовой кислоты 0,050±0,012 мг/г масляной кислоты 0,012±0,014 мг/г, валериановой кислоты 0,013±0,006 мг/г.при общем содержании КЖК равном 0,476±0,035 мг/мл.

Из представленных результатов наглядно следует, что согласно заявленному способу получается продукт не только с большим количеством КЖК (1,334 мг/г) против 0,476 мг/г (по прототипу), но и с большим количеством биологически активных короткоцепочечных кислот: уксусной, пропионовой, масляной и валериановой.

Мы полагаем, что в процессе предлагаемого нами способа культивирования Saccharamyces cerevisiae (vini) ВКМП Y-511 имеет место активация генов, ответственных за синтез короткоцепочных жирных кислот, что и приводит к их повышенному накоплению.

Следует указать, что в супернатантах фекалий здоровых людей показатели относительного содержания уксусной кислоты находятся в пределах 0,634±0,014, пропионовой - 0,189±0,011 и масляной кислоты 0,176±0,011 в суммарном относительном содержании С2-С6.

Одним из важных свойств пищевых волокон как пребиотиков является их сорбционная способность, в том числе для лактобацилл, обеспечивающая их рост и размножение. В толстом кишечнике пищевые волокна, ферментируясь, становятся субстратом для этой микрофлоры.

Было исследовано влияние сорбционной способности препарата в отношении штаммов лактобацилл.

Методика сорбции. Бактерии 5 штаммов: L. plantarum 8РА-3, L. fermentum 90-4С, L. rhamnosum GG, L. plantarum 206 и L. casei 33. Использовали 10% (в конечном объеме) суспензию исследуемого средства на основе 0,9% физиологического раствора хлорида натрия (NaCl). В опытные образцы с начальным объемом 4,5 мл вносили 0,5 мл бактериальной взвеси с концентрацией микробных клеток 109 /мл, перемешивали и ставили на инкубацию при 37°С на 30 минут. После инкубации пробирки откручивали при 3 тыс. об/мин в течение 1-2 минут. Осадок набирали бактериологической петлей, наносили на предметное стекло, распределяя суспензию по поверхности стекла, мазок высушивали, фиксировали над пламенем горелки, окрашивали по Граму и микроскопировали. Установлено, что бактериальные клетки разных штаммов, в том числе L. plantarum 8РА-3, L. fermentum 90-4С, L. rhamnosum GG, L. plantarum 206 и L. casei 33 по-разному сорбируются на волокнах препарата. Наибольшей активностью характеризуется штамм L. plantarum 206, выделенный в лаборатории генетики вирулентности бактерий ранее и сохраненный в музее живых культур. Lactobacillus plantarum LZ206 - потенциальный пробиотический штамм, выделенный из сырого коровьего молока, обладающий антимикробной активностью в отношении различных патогенов, включая грамположительные бактерии (золотистый стафилококк и Listeria monocytogenes), грамотрицательные бактерии (кишечная палочка и сальмонелла энтерика) и грибок Candida albicans. Внесение бактериальных клеток в количестве 109/мл в 1 мл 10% суспензии предлагаемого средства на основе стандартного раствора сахарозы (криопротектора) с последующим лиофильным высушиванием и хранением в условиях рефрижератора позволило констатировать сохранность жизнеспособности бактериальных клеток практически в мало измененном титре (108/мл) в течение года. Это свидетельствует о потенциально высоких лечебных эффектах средства.

Полученное заявленным способом средство было испытано в клинике.

Средство показало высокую эффективность, результаты этого были неоднократно озвучены на специализированных конференциях и в печати.

Клинический эффект (уменьшение метеоризма, нормализация стула, купирование болевого синдрома) регистрировался на 2-5 день лечения;

Средство, предварительно замоченное в воде, применяли по 1 столовой ложке, за 30 минут до еды 3 раза в день, запивая 1 стаканом воды.

Пример 1. Больной Т., 56 лет. Обратился в гастроэнтерологическое отделение с жалобами на нерегулярный стул (1 раз в 3 дня). Жалобы на снижение аппетита, изжогу, тошноту, повышенное газообразование в кишечнике, боли в области живота. В анамнезе - длительное лечение антибиотиками, сульфаниламидными препаратами. В течение 6 месяцев до обращения в клинику принимал Рекицен РД (поступающий в продажу после изготовления по способу прототипу) согласно инструкции. Анализ кала на дисбактериоз: кишечная палочка - до 1 млн, лактобактерий - роста в 104, бифидобактерии - роста не отмечено. Патогенной флоры не выявлено. Диагноз: дисбактериоз толстой кишки, IV ст.

Проведен курс лечения, заключающийся в приеме средства по заявленному изобретению в количестве 1 столовой ложки 3 раза в день за 30 минут до еды. Длительность лечения составила 21 день. Через пять дней после начала лечения отмечено начало улучшения общего состояния больного - прошли боли и метеоризм в кишечнике. Нормализация стула наступила на 15 день. В последующие дни стул был регулярный и оформленный. Через 20 дней проведена бактериограграмма: Кишечная палочка 295 млн/г, лактобактерий растут в разведении 109, бифидумбактерий - в 1011. Наблюдение через 6 и 12 месяцев не выявили патологии со стороны желудочно-кишечного тракта.

Пример 2. Больная С., 56 лет. Поступила с диагнозом кишечный дисбактериоз 2-й степени. Жалобы на диспепсию, метеоризм, (жидкий стул). Бактериограмма показала значительное снижение уровня бифидо- и лактофлоры (кишечная палочка 24 млн/г, лактобактерий 0, бифидумбактерий 0). Страдает около 10 лет. По этому поводу находится на строгой диете. В анамнезе лечение антибиотиками, энзимотерапия, прием пребиотиков, в том числе и Рекицена РД. (приобретенный в аптеке и изготовленный по способу прототипу).

Проведено комплексное лечение с использованием препарата по изобретению в течение 4 недель. Значительное улучшение на 5 день. Исчез метеоризм, болевые ощущения, диспептические явления значительно уменьшились. Через 3 недели в кале обнаружена нормализация лакто и бифидобацилл. Стул однократный, оформленный. Больной рекомендован периодический прием средства по изобретению. При исследовании кала через 6 и 12 месяцев установлено сохранение нормальной бактериогаммы. Таким образом, предлагаемый препарат показал высокую терапевтическую активность в тех случаях, когда традиционная терапия, в том числе и с использованием препарата по способу прототипу давала только краткосрочное улучшение.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ получения лечебно-профилактического средства при дисбактериозе, включающий ферментацию пшеничных отрубей путем засеивания их дрожжами штамма Saccharomyces cerevisiae (vini) ВКМП Y-511, последующее выдерживание субстрата при температуре 29°С при постоянном перемешивании его до достижения в среде требуемого количества микроорганизмов, инактивирование микробной культуры путем прогрева всей среды при температуре 100°С с последующей сушкой полученного субстрата до содержания воды не более 10% и фасовкой конечного продукта, перед засеиванием отрубей винными дрожжами штамма Saccharomyces cerevisiae vini ВКПМ Y-511 культуру этого штамма подвергают неоднократному культивированию, для чего вначале культивирование ведут в пробирках на полноценной среде, затем на жидкой питательной среде, приготовленной из отрубей пшеничных и артезианской воды, далее культивирование ведут на увлажненных водой автоклавированных пшеничных отрубях, образовавшийся после ферментации субстрат высушивают до влажности продукта 10% и инактивации дрожжей и измельчают для получения конечного продукта в виде крупки. 1 табл., 2 пр.

Способ получения лечебно-профилактического средства при дисбактериозе, включающий ферментацию пшеничных отрубей путем засеивания их дрожжами штамма Saccharomyces cerevisae (vini) ВКМП Y-511, последующее выдерживание субстрата при температуре 29°С при постоянном перемешивании его до достижения в среде требуемого количества микроорганизмов, инактивирование микробной культуры путем прогрева всей среды при температуре 100°С с последующей сушкой полученного субстрата и фасовкой конечного продукта, отличающийся тем, что перед засеиванием отрубей винными дрожжами штамма Saccharomyces cerevisiae vini ВКПМ Y-511 культуру этого штамма подвергают неоднократному культивированию, для чего вначале культивирование ведут в пробирках на среде, 1 л которой содержит глюкозы 20,0 г, пептона - 10,0 г, дрожжевого экстракта - 5,0 г, агара - 20,0 г, воды - остальное, до достижения концентрации дрожжевых клеток 30 млрд клеток на 1 грамм микробной массы, затем культуру из пробирки переносят в жидкую питательную среду, приготовленную из расчета 72 г отрубей пшеничных на 1,25 л артезианской воды, и выдерживают при температуре 29°С в течение 48 часов до достижения количества микроорганизмов не менее 50 млрд клеток на 1 кг отрубей, далее культивирование ведут на твердом субстрате, для чего в предварительно автоклавированные пшеничные отруби, увлажненные водой из расчета 1,25 л воды на 1 кг отрубей, вносят по 75 мл жидкой культуры дрожжей, полученной на предыдущей стадии культивирования, и выдерживают в стационарном положении в термальной комнате при температуре 29°С в течение 20 часов, а засев пшеничных отрубей производят полученным субстратом в смесителе, для чего пшеничные отруби предварительно увлажняют УФ-стерилизованной водой, после внесения субстрата образовавшуюся массу тщательно перемешивают и помещают на поддоны, распределяя их слоем толщиной 4 см, поддоны помещают в термостат для проведения стадии ферментации, ферментацию ведут при температуре 29°С в течение 22 часов, образовавшийся после ферментации субстрат высушивают до влажности продукта 10% и инактивации дрожжей, высушенные ферментированные отруби пропускают через дробилку-измельчитель для получения конечного продукта в виде крупки.