СРЕДА ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2004 года по МПК C12N5/06 C12N5/08 

Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к средам для криконсервации клеток человека и животных.

Известны среды для криоконсервации клеток человека и животных, содержащие солевую основу, криопротектор, пируват, лактат, глюкозу, антибиотики, сульфаниламиды, бычий сывороточный альбумин, феноловый красный, хепес-буфер, например модифицированные среды М 1 и М 2 [1]. Однако данные среды не содержат аминокислоты, витамины, сыворотку, которые необходимы для адаптации и защиты клеток при проведении процедуры криоконсервации. Это приводит к нежелательному повреждению и гибели клеток в процессе криоконсервации при замораживании и оттаивании.

Наиболее близкой по составу к предлагаемой среде является среда, которая наряду с солевой основой, криопротектором, пируватом, лактатом, глюкозой, антибиотиками и сульфаниламидами, дополнительно содержит аминокислоты, витамины и сыворотку, например среда RPMI-1640 с добавлением 10-20% эмбриональной телячьей сыворотки, 5-10% диметилсульфоксида, 100 МЕ/мл пенициллина натриевой соли и 100 мкг/мд стрептомицина сульфата [6]. Данная среда благодаря наличию аминокислот, витаминов и сыворотки способствует защите и адаптации клеток к условиям криоконсервации. Однако она не содержит стабилизаторы клеточных мембран и коллоидных структур, которые повышают устойчивость клетки к замораживанию. В ней отсутствуют вещества, снижающие токсическое действие криопротектора (диметилсульфоксида) на клетки.

Новая техническая задача - повышение выживаемости клеток за счет усиления устойчивости клеток к криоконсервации и снижение токсического действия криопротектора.

Поставленную задачу решают применением новой среды, содержащей среду RPMI-1640, эмбриональную телячью сыворотку, диметилсульфоксид, антибиотики и сульфаниламиды, причем она дополнительно содержит ацетамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин и линолевую кислоту при следующем соотношении компонентов, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 10-20

Диметилсульфоксид 5-15

Ацетоамид 10-30

D-глюкуроновая кислота 0,01-0,03

Лецитин 0,05-0,15

Холестерин 0,05-0,15

Линолевая кислота 0,025-0,075

Сульфаниламиды и антибиотики 0,1-1,5

Среда RPMI-1640 До 100

Отличие прилагаемого изобретения от известных аналогов заключается в том, что среда дополнительно содержит ацетоамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту при следующем соотношении компонентов, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 10-20

Диметилсульфоксид 5-15

Ацетоамид 10-30

D-глюкуроновая кислота 0,01-0,03

Лецитин 0,05-0,15

Холестерин 0,05-0,15

Линолевая кислота 0,025-0,075

Сульфаниламиды и антибиотики 0,1-1,5

Среда RPMI-1640 До 100

Сравнение заявляемого технического решения с другими показывает, что предлагается композиция ингредиентов среды для криоконсервации клеток человека и животных, позволяющая повысить выживаемость клеток при криоконсервации, описание состава которой не обнаружено в литературных источниках.

С учетом изложенного, следует считать заявляемое решение соответствующее критерию “существенные отличия”. Применение данной среды в эксперименте на клетках животных и человека показало, что она “промышленно применима” при проведении процедуры криоконсервации.

Технология приготовления среды включает следующие операции:

- приготовление липосом с помощью ультразвука по стандартной методике из 1 части (по весу) холестерина, 5 частей линолевой кислоты, 10 частей лецитина [4];

- смешивание липосом со средой RPMI-1640, эмбриональной телячьей сывороткой, D-глюкуроновой кислотой, пенициллином и стрептомицином до полного растворения веществ;

- добавление (непосредственно перед употреблением) в среду диметилсульфоксида и охлаждение ее до комнатной температуры.

Полученная среда содержит, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 10-20

Диметилсульфоксид 5-15

Ацетоамид 10-30

D-глюкуро новая кислота 0,01-0,03

Лецитин 0,05-0,15

Холестерин 0,05-0,15

Линолевая кислота 0,025-0,075

Сульфаниламиды и антибиотики 0,1-1,5

Среда RPMI-1640 До 100

Концентрации компонентов в предлагаемой среде для криоконсервации клеток человека и животных подобраны на основании интерпретации данных экспериментальных исследований.

В связи с тем, что основное повреждающее действие на клетки при криоконсервации оказывает криопротектор диметилсульфоксид было решено, чтобы в среде для сравнения (прототип) концентрация криопротектора и эмбриональной телячьей сыворотки (стабилизатора клеточных мембран) в каждом из экспериментов соответствовала их содержанию в предлагаемой среде. Поэтому концентрации указанных компонентов в среде-прототипе соответственно находились в пределах, об.%: диметисульфоксид 5-15, эмбриональная телячья сыворотка 10-20.

Антибиотики и сульфаниламиды применяли в общепринятых дозировках (пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл, стрептомицина сульфат 100 мкг/мл), составляло 0,1-1,5 об.%.

Пример 1

Кардиомиоциты выделяли из сердца новорожденных крысят породы “Вистар” с помощью ферментов [8]. Жизнеспособность (выживаемость), клеточность и морфологию клеток определяли по общепринятьм методам с использованием трипанового синего, гемоцитометра и окраски азур-II эозином соответственно [3, 5]. Доводили концентрацию клеток до 1×10⁷/мл средой следующего состава: среда RPMI-1640 - 80%, эмбриональная телячья сыворотка - 20%). К 1 мл клеточной суспензии по каплям добавляли среду для криоконсервации содержащую, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка - 10

Диметилсульфоксид 5

Ацетоамид 10

D-глюкуроповая кислота 0,01

Лецитин 0,05

Холестерин 0,05

Линолевая кислота 0,025

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Среда RPMI-1640 До 100

Материал перемешивали и помещали в контейнеры для криоконсервации по 1,5 мл и замораживали по двухступенчатой схеме. Первоначально охлаждали до -40°С со скоростью 1-2°С/мин. А затем переносили в жидкий азот (-196°С) и хранили в течение 1 и 5 лет [1]. После размораживания оценивали количество выживших клеток, клеточность и морфологию кариоцитов, как было описано выше.

В контроле использовали среду-прототип, содержащую, об.%:

Среда RPMI-1640 85

Эмбриональная телячья сыворотка 10

Диметилсульфоксид 5

Результаты представлены в таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 54,7±2,2, прототип 42,5±0,9, Рu<0,05) и 5 лет (опыт 53,1±1,3, прототип 40,3±1,2, Pu<0,05) достоверно выше, чем у прототипа.

Пример 2

Кардиомиоциты выделяли из сердца новорожденных крысят породы “Вистар” с помощью ферментов [8]. Жизнеспособность (выживаемость), клеточность и морфологию клеток определяли по общепринятым методам с использованием трипанового синего, гемоцитометра и окраски азур-II эозином соответственно [3, 5]. Доводили концентрацию клеток до 1×10⁷/мл средой следующего состава: среда RPMI-1640 - 80%, эмбриональная телячья сыворотка - 20%). К 1 мл клеточной суспензии по каплям добавляли среду для криоконсервации, содержащую, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 15

Диметилсульфоксид 10

Ацетоамид 20

D-глюкуроновая кислота 0,02

Лецитин 0,1

Холестерин 0,01

Линолевая кислота 0,05

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Среда RPMI-1640 До 100

Материал перемешивали и помещали в контейнеры для криоконсервации по 1,5 мл и замораживали по двухступенчатой схеме. Первоначально охлаждали до -40°С со скоростью 1-2°С/мин. А затем переносили в жидкий азот (-196°С) и хранили в течение 1 и 5 лет [1]. После размораживания оценивали количество выживших клеток, клеточность и морфологию кариоцитов, как было описано выше. В контроле использовали среду-прототип, содержащую, об.%:

Среда RPMI-1640 75

Эмбриональная телячья сыворотка 15

Диметилсульфоксид 10

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Результаты представлены в таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 67,1±3,3, прототип 48,1±1,7, Рu<0,05) и 5 лет (опыт 60,2±1,9, прототип 45,5±2,2, Pu<0,05) достоверно выше, чем у прототипа.

Пример 3

Кардиомиоциты выделяли из сердца новорожденных крысят породы “Вистар” с помощью ферментов [8]. Жизнеспособность (выживаемость), клеточность и морфологию клеток определяли по общепринятым методам с использованием трипанового синего, гемоцитометра и окраски азур-II эозином соответственно [3, 5]. Доводили концентрацию клеток до 1×10⁷мл средой следующего состава: среда RPMI-1640 - 80%, эмбриональная телячья сыворотка - 20%). К 1 мл клеточной суспензии по каплям добавляли среду для криоконсервации, содержащую, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 20

Диметилсульфоксид 15

Ацетоамид 30

D-глюкуроновая кислота 0,03

Лецитин 0,15

Холестерин 0,015

Линолевая кислота 0,075

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Среда RPMI-1640 До 100

Материал перемешивали и помещали в контейнеры для криоконсервации по 1,5 мл и замораживали по двухступенчатой схеме. Первоначально охлаждали до -40°С со скоростью 1-2°С/мин. А затем переносили в жидкий азот (-196°С) и хранили в течение 1 и 5 лет [1]. После размораживания оценивали количество выживших клеток, клеточность и морфологию кариоцитов как было описано выше. В контроле используют среду-прототип, содержащую, об.%:

Среда RPMI-1640 75

Эмбриональная телячья сыворотка 20

Диметилсульфоксид 15

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Результаты представлены в таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 56,1±1,3, прототип 49,9±2,4, Pu<0,05) и 5 лет (опыт 53,7±2,4, прототип 42,1±4,4, Pu<0,05) достоверно выше, чем у прототипа.

Пример 4

10 мл Периферической крови человека, стабилизированной гепарином (100 ЕД/мл), осторожно наслаивали на 5 мл раствора фиколлгипака с плотностью 1,077 г/см³. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15-20 мин. Интерфазный слой содержащий моноциты и лимфоциты собирали и отмывали от фиколлгипака свежей порцией среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клеточность жизнеспособных мононуклеаров доводили до 1×10⁷/ мл и [2]. 1 Часть суспензии кариоцитов смешивали со средой для криоконсервации следующего состава, об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 15

Диметилсульфоксид 10

Ацетоамид 20

D-глюкуроновая кислота 0,02

Лецитин 0,1

Холестерин 0,01

Линолевая кислота 0,05

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Среда RPMI-1640 До 100

И замораживали в жидком азоте, как было описано выше. В контроле использовали среду прототипа, состоящую, об.%:

Среда RPMI-1640 75

Эмбриональная телячья сыворотка 15

Диметилсульфоксид 10

Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл

Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл

Через год клетки размораживали и оценивали их выживаемость (жизнеспособность) с помощью трипанового синего, с последующим морфологическим анализом. Результаты представлены и таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 85,7±2,28, прототип 76±1,3, Рu<0,05) достоверно выше, чем у прототипа.

Обоснование выбора ингредиентов

Повреждение и гибель клеток при консервации происходит главным образом за счет интрацеллюлярного образования кристаллов льда, которые разрывают мембраны клеток, а также токсического действия криопротектора (диметилсульфоксида) [5].

Диетилсульфоксид по своей эффективности в настоящее время считается одним из лучших крипротекторов среди известных аналогов (глицерин, метанол, сахароза, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и др.). Для снижения его токсического действия в среду вводят ацетоамид, применение которого основано на способности некоторых амидов снижать химическую активность растворов диметилсульфоксида [5].

С целью повышения устойчивости клеточных мембран к криоконсервации в нее добавляют: d-глукуроновую кислоту, лецитин, холестерин и линолевую кислоту.

D-глукуроновая кислота входит в состав гликозаминогликанов, образующих внутриклеточные коллоиды, связывающих воду, а также трансмембранные белки. Линолевая кислота и холестерин являются частью липидного, а лецитин - белкового слоев клеточных мембран. Эти вещества выполняют защитную, пластическую и антиоксидантную функции, которые страдают в процессе проведения криоконсервации [5, 7, 9].

Таким образом, применение предлагаемой среды для криоконсервации клеток человека и животных позволяет увеличить выживаемость клеток за счет усиления их устойчивости к криоконсервации и снижения токсического действия криопротектора (диметилсульфоксида).

Список используемой литературы

1. Биология развития млекопитающих. Методы/ М.Манк. - М.: Мир, 1990.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии, Томск, ТГУ, 1992.

3. Иммунологические методы/ Г.Фримель. - М.: Медицина, 1987.

4. Иммунологические методы исследований/ И.Мерковится, Б.Перниса. - М.: Мир, 1988.

5. Культура животных клеток. Методы/ Р.Фрешни. - М.: Мир. - 1989.

6. Лимфоциты: Методы/Дж.Клаус. - М.: Мир. - 1990, с.239-242.

7. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань. - М.: Медицина. - 1981.

8. Физиология и патология сердца/ Н.Сперелаксис. - М.: Медицина. - В2, т.2. - 1990.

9. Юшков Б.Г., Попов Г.К., Северин М.В., Ястребов А.П. Гликопротеины и гемопоэз. - Екатеринбург. - 1994.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, конкретно к средам для криоконсервации клеток человека и животных. Среда содержит эмбриональную телячью сыворотку, диметилсульфоксид, среду RPMI-1640, антибиотики, ацетоамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту в заданном соотношении компонентов. Изобретение обеспечивает повышение выживаемости клеток за счет усиления их устойчивости к криоконсервации и снижение токсического действия криопротектора. 2 табл.

Среда для криоконсервации клеток человека и животных, содержащая среду RPMI-1640, эмбриональную телячью сыворотку, диметилсульфоксид, пенициллин и стрептомицин, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ацетоамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту при следующем соотношении компонентов об.%:

Эмбриональная телячья сыворотка 10-20

Диметилсульфоксид 5-15

Ацетоамид 10-30

D-глюкуроновая кислота 0,01-0,03

Лецитин 0,05-0,15

Холестерин 0,05-0,15

Линолевая кислота 0,025-0,075

Стрептомицин 100 мкг/мл

Пенициллин 100 МЕ/мл

Среда RPMI-1640 До 100