Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов Российский патент 2018 года по МПК C12N1/04 C12N1/20 C12R1/21 C12R1/46 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может найти применение для научно-исследовательских и других лабораторий клинической микробиологии при необходимости сохранения прихотливых бактериальных культур Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae в течение длительного времени, в том числе для длительного хранения музейных штаммов.

Практика консервации и расконсервации микроорганизмов эмпирически выработала ряд приемов, основанных на знании механизмов погружения клеток в анабиотическое состояние и выхода из него.

Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов разнообразных микроорганизмов представляет собой пока еще не решенную проблему, нуждающуюся в дальнейшем изучении. Так, известно, что способность сохранять жизнеспособность в определенных условиях консервации связана не только с родом и видом микроорганизмов, но и с другими свойствами бактерий.

Среди методов хранения микроорганизмов, практикуемых в различного ранга коллекциях живых культур, различают два основных подхода:

1. Методы непродолжительного хранения микроорганизмов;

2. Методы длительного хранения микроорганизмов.

1. Методы первой группы позволяют сохранять микроорганизмы от нескольких недель, месяцев до одного года и имеют ряд недостатков, а именно: диссоциация микроорганизмов, загрязнение, неконтролируемая селекция мутантов микроорганизмов, не гарантированный срок сохранения жизнеспособности и т.д. Неправильный выбор поддерживающей среды может привести к потере микроорганизма. Большинство этих методов непригодно для сохранения прихотливых микроорганизмов, таких как S.pneumoniae и Н. Influenzae.

2. Методы длительного хранения микроорганизмов:

- глубокое замораживание, или криоконсервация микроорганизмов (от минус 70°С до минус 196°С);

- лиофильное высушивание (из замороженного состояния) или высушивание из жидкого состояния.

Криоконсервация осуществляется в сосудах с жидким газом (азотом) или в стационарных морозильных камерах. Заморозка проводится путем посева микроорганизмов в специальные среды сохранения с добавлением криопротекторов, обеспечивающих внутриклеточную и (или) внеклеточную защиту микроба от повреждающих факторов в процессе замораживания и размораживания. В качестве среды сохранения используют различные субстраты, но больший процент биомассы микроорганизмов при расконсервации сохраняется при использовании богатых по составу питательных сред [1, 2]. Это особенно важно учитывать при сохранении прихотливых микроорганизмов.

Лиофильное высушивание обеспечивает наиболее длительное хранение микроорганизмов, но выполняется на дорогостоящем оборудовании, что малодоступно для лабораторной практики.

Известны способы хранения прихотливых микроорганизмов:

- на яично-желточной среде Дорсэ при комнатной температуре (до 4-6 месяцев для пневмококков) [3, 4]. Недостатками метода являются - короткий срок хранения, невозможность культивирования Haemophilus influenzae.

- на стерильной дефибринированной крови кролика при температуре ниже минус 40°С [5]. Недостатком метода является то, что стерильная дефибринированная кровь кролика является недоступным препаратом для практических лабораторий.

- на консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1 при температуре минус 20°С [6].

Недостатки способа - возможное содержание антител к возбудителям инфекционных болезней и гибель сохраняемой культуры, низкий срок хранения - один год, невозможность дальнейшего хранения после расконсервации.

Наиболее близким способом к заявляемому является способ сохранения бактерий с использованием 18-24-часовых культур, выращенных на соответствующих питательных средах, путем замораживания при температуре минус 80°С в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 30% глицерина [7, 8]. В известном способе используется в качестве среды сохранения триптиказо-соевый бульон в виде сухой среды для приготовления бульона в условиях лаборатории или жидкой среды, готовой к использованию. Недостаток способа - низкая жизнеспособность микроорганизмов при хранении в результате недостаточного набора питательных компонентов в среде сохранения [1].

Задачей разработки является создание наиболее доступного способа длительного хранения прихотливых микроорганизмов для практических и научно-исследовательских лабораторий.

Техническим результатом заявленного способа является сохранение жизнеспособности (выживаемости) прихотливых микроорганизмов при консервации в течение длительного времени.

Технический результат достигается тем, что в способе длительного хранения прихотливых микроорганизмов с использованием 18-24-часовых культур путем замораживания при температуре минус 80°С в среде сохранения с добавлением криопротектора в виде 30% глицерина, в качестве среды сохранения используют готовую среду Signal blood culture system medium производства фирмы Oxoid, первоначально предназначенную для диагностики бактериального заражения крови.

Изучив особенности микроорганизмов установили, что:

Streptococcus pneumoniae нуждается в особых условиях культивирования. К питательным средам обычно добавляют кровь и сыворотку крупного рогатого скота или лошадиную сыворотку, для роста требуется повышенная концентрация СО₂. Хранение культур в обычных условиях затруднено вследствие склонности пневмококка к аутолизу.

Бактерии рода Haemophilus также относят к труднокультивируемым микробам - все виды гемофильных бактерий нуждаются в присутствии в питательной среде ростовых факторов V и X, источником которых являются эритроциты крови [1]. Практическим путем подобраны среда сохранения, криопротектор, определена температура криоконсервации.

1. Выбор среды сохранения.

Выбор среды сохранения микроорганизмов основывается на питательных потребностях патогенов. Правильный выбор сред важен как для накопления микроорганизмов (жизнеспособность микроорганизмов значительно повышается, если исходная концентрация микробных клеток в суспензии была высокой, порядка 10⁹-10¹¹ кл/мл), так и для защиты клеток в процессе криоконсервации и расконсервации. Более концентрированная суспензия клеток имеет более высокий титр выживания при размораживании, чем разбавленная суспензия [9].

Для обеспечения ростовых потребностей Streptococcus pneumoniae в состав искусственных питательных сред должны входить аминокислоты (лизин, аргинин, метионин, треонин, гистидин, глицин, цистеин, аспарагин, изолейцин, валин и глютаминовая кислота). Необходимыми компонентами питательных сред также являются холин, витамины группы В. Учитывая физиологические потребности прихотливых микроорганизмов в качестве основ питательных сред, используются гидролизаты мяса, сои, казеина, куриные эмбрионы, продукты ферментативного гидролиза плаценты человека [1].

Несмотря на то, что предложенные среды обеспечивают типичный рост пневмококков и гемофилов, использование в них нестандартизованных компонентов существенно снижает их эффективность. Поэтому эффективное долговременное сохранение прихотливых микроорганизмов возможно только при использовании качественной, богатой по составу питательных веществ и стандартизованной среды [9]. Среда Signal blood culture system medium полностью соответствует этим требованиям.

2. Выбор криопротектора.

Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при охлаждении, замораживании и последующем отогреве. К настоящему времени известно свыше 100 соединений в качестве криопротекторов (спирты, амины, аминокислоты и их амиды, оксиды, углеводы, белки, природные и искусственные полимеры, неорганические соли и др.). Однако многие из известных криопротекторов могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания удаляют криопротектор из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования [10, 11, 12, 13]. В качестве криопротекторов в микробиологии обычно используют 10, 15, 20% растворы глицерина [9, 10]; 5, 7% растворы диметилсульфоксида (ДМСО); 12, 24% растворы сахарозы, а также глицерин и ДМСО в сочетании с глюкозой или сахарозой [9, 10, 11, 14].

Для нашего способа в качестве криопротектора был выбран 30% глицерин, обеспечивающий внутриклеточную и внеклеточную защиту микроорганизмов от повреждающих факторов. Для дальнейшей исследовательской работы с микроорганизмами не требуется отмывать и центрифугировать состав.

3. Определение температуры криоконсервации.

В настоящее время криоконсервация (криоанабиоз) является наиболее перспективным методом долгосрочного хранения микроорганизмов. При криоконсервации удается получить высокий уровень жизнеспособных клеток, титр которых при длительном хранении при температуре от минус 70°С до минус 196°С сохраняется на исходном уровне, что делает практически неограниченным возможное время хранения [10]. Существенным преимуществом криоконсервации перед высушиванием и лиофилизацией является возможность сохранения высокой биохимической активности и генетической стабильности [2]. Наиболее доступным для практических и научно-исследовательских лабораторий методом является криоконсервация в морозильниках при -70°С - 80°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят рабочий раствор среды сохранения, используя готовую среду Signal blood culture system medium (производится фирмой Oxoid, Великобритания, каталожный номер ВСО 100 - общее название системы; бутыль в комплекте с индикатором роста - ВСО 100М; флакон со средой без индикатора роста ВСО 102М). Среда представляет собой жидкий стерильный раствор в стерильном флаконе емкостью 84 мл, полностью готовый к использованию в качестве среды сохранения. Среда изначально предназначена для посева крови заболевших лиц с целью выделения даже минимальных количеств прихотливых микроорганизмов. В состав среды Signal blood culture system medium входит: триптонно-соевый бульон 10 г/л, желатиновый пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, поваренная соль 8 г/л, нитрат калия 2 г/л, глюкоза 1 г/л, L - аргинин 1 г/л, пируват натрия 1 г/л, желатин 1 г/л, тиогликоль натрия 0,5 г/л, цистеин HCl 0,4 г/л, двууглекислая сода 0,4 г/л, фосфатный буфер 0,3 г/л, полианетол сульфонат натрия 0,3 г/л, дитиотреитол 0,2 г/л, сульфат аденина 0,01 г/л, янтарно-кислый натрий 0,01 г/л, хлорид аммония 0,008 г/л, сульфат магния 0,008 г/л, витамин K(Menadione) 0,005 г/л, рН среды 7,0 [16].

Для приготовления рабочего раствора среды сохранения (среда + криопротектор) среда Signal blood culture system medium наливается стерильным шприцем в количестве 7 мл в стерильную пробирку емкостью 10-15 мл. Затем в эту же пробирку добавляется 3 мл глицерина, предварительно простерилизованного 15 мин при давлении 0,5 атм. Таким образом обеспечивается 30% концентрация глицерина в растворе.

Пробирки типа Eppendorf из полипропилена помещают с открытыми крышками в крафт-пакеты по 10 штук, стерилизуют автоклавированием при t 120°С - 45 мин [15]. Срок хранения стерильных пробирок типа Eppendorf трое суток. Рабочий раствор должен быть сразу разлит в стерильные пробирки типа Eppendorf в ламинарном боксе 2 класса биологической защиты по 1 мл. Далее пробирки типа Eppendorf со средой хранятся в штативе при t+2+8°С 7-10 дней.

Культуры Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae для длительного сохранения предварительно выращивают на кровяном агаре с добавлением 10% лошадиной сыворотки (Streptococcus pneumoniae) и на шоколадном агаре (Haemophilus influenzae) в атмосфере повышенной концентрации СО₂ 18-24 часа [1].

Стерильным одноразовым тампоном-зондом из вискозы снимают с агара видимый рост бактерий. Затем тампон-зонд помещают в пробирку типа Eppendorf со средой сохранения, интенсивно суспендируют его и вынимают, отжав о внутреннюю стенку пробирки. Пробирки типа Eppendorf с культурой маркируют маркером по стеклу, обозначая название, номер культуры, дату заморозки. Каждый штамм сохранялся в 5 экземплярах, чтобы протестировать жизнеспособность бактерий через 3 мес, 6 мес, 12 мес, 1,5 года и 2 года консервации. При обычном сохранении, исключающем исследовательские задачи по определению выживаемости бактерий, каждый штамм сохраняем в нескольких (от 3 до 5) экземплярах. Подписанные пробирки с культурой без дополнительного подращивания помещают в штатив и затем в морозильную камеру при t-80°C. Для расконсервации сохраняемой культуры одноразовой пластиковой бактериологической петлей прокалывается замороженная среда. Затем взятая на петлю масса растирается по поверхности кровяного (шоколадного) агара штриховым способом. Чашки инкубируют при 137°С в атмосфере повышенной концентрации СО₂ 18-24 часа. После посева пробирка с замороженной культурой вновь помещается в морозильник.

Нами было протестировано хранение предлагаемым способом 60 штаммов бактерий: 30 штаммов Streptococcus pneumoniae, 30 штаммов Haemophilus influenzae. Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показали, что все 60 культур сохранили свою жизнеспособность в течение 2-х лет хранения на испытуемой среде.

Преимуществом заявленного способа является то, что использование среды сохранения на основе среды Signal blood culture system medium, содержащей большой набор питательных компонентов и ростовых факторов, с добавлением 30% глицерина в качестве криопротектора обеспечивает выживаемость в высоком титре максимального количества проб с прихотливыми микроорганизмами, жизнеспособность и возобновление культивирования сохраняемых бактерий в течение минимум 2-х лет хранения. Культуры закладываются на хранение без дополнительного подращивания в термостате, из одной пробирки можно делать высев несколько раз без полного оттаивания, исключен трудоемкий этап «оживления» микроорганизмов после расконсервации. Дополнительным преимуществом является то, что если микробиологическая лаборатория выполняет исследования крови на стерильность с использованием среды Signal blood culture system medium, то можно без дополнительных затрат времени и денежных средств на приобретение другой среды сохранять лабораторные штаммы для последующего изучения.

Литература

1. Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие, Том 3, Клиническая микробиология под редакцией В.В. Меньшикова. М.: Лабора, 2009. - 879 с.

2. В.Д. Похиленко. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, A.M. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4 (12). - С. 99-121.

3. Wasas A.D., Huebner R.E., De Blanch M, Klugman K.P. Long-term survival of Streptococcus pneumoniae at room temperature on Dorset egg medium. J Clin Microbiol. 1998;36:1139-1140.

4. Ajello G.W., Feeley J.C., Hayes P.S., reingold A.L., Bolan G., Broome C.V., Phillips C.J. Trans-isolate medium: a new medium for primary culturing and transport of Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. J Clin Microbiol. 1984; 20:55-58.

5. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. Р. Вейант, У. Мосс, Р. Уивер, Д. Холлис, Дж. Джордан, Э. Кук, М. Дейншвар. - М.: Мир, 1999. - 791 с., стр. 56.

6. Патент 2535984 Российская Федерация, C12N 1/04, 2014. Способ длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания / Воронина Л.Г., Суматова Е.В., Кукушкина М.П.: опубл. 20.12.2014, Бюл. №35.

7. Протасова И.Н. Смена серотипов Streptococcus pneumoniae у детей, вакцинированных 7-валентной конъюгированной вакциной / И.Н. Протасова, Н.В. Бахарева, О.В. Перьянова, Т.А. Елистратова, М.В. Коваль // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2014. - №5(78).-С. 67-71.

8. Маянский Н.А. Определение капсульных серотипов пневмококка методом мультиплексной ПЦР /Н.А. Маянский, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, Т.А. Гречуха, В.Г. Пинелис, Л.С. Намазова-Баранова // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2010. - Том 2. - №6. - С. 6-11.

9. Патент 2123044 Российская Федерация, C12N 1/04, 2011. Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных / Шендеров Б.А., Гахова Э.Н., Манвелова М.А., Пиорунский Д.А., Карнаухов В.Н.: опубл. 10.12.1998.

10. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения: пер. с англ. / О. Смит. - М., 1963. - 430 с.

11. А.М. Белоус Криоконсерванты / A.M. Белоус, М.И. Шраго, Н.С. Пушкарь. - Киев: Наукова думка, 1979. - 198 с.

12. Патент 2008348 Российская Федерация, C12N 1/04, 1994. Способ хранения культур микроорганизмов / Афиногенов Г.Е., Доморад А.А., Шамолина И.И., Краснова М.В.; опубл. 28.02.94, Бюл. №4.

13. Патент 2185435 Российская Федерация, C12N 1/04, 2001. Способ хранения культур микроорганизмов / Ильин Д.Ю., Блинохватов А.Ф., Ильина Г.В., Иванов А.И.: опубл. 20.07.02, Бюл. №20.

14. Патент 2045573 Российская Федерация, C12N 1/04, 1995. Состав для хранения бактерий / Плотников О.П., Маркова Л.И., Виноградова Н.А., Харченко В.Г., Казаринова Т.Д.; опубл. 10.10.95, Бюл. №28.

15. ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы» стр. 9.

16. Ссылка на источник из уровня техники с описанием среды: http://www.biovitrum.ru/files//instrukciya_sistema_signal.pdf

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Предложен способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов, предусматривающий замораживание 18-24-часовых культур микроорганизмов при температуре минус 80°C в среде Signal blood culture system medium с добавлением 30% глицерина. Способ обеспечивает высокий титр выживаемости прихотливых микроорганизмов в течение минимум 2-х лет хранения. 1 табл.

Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов с использованием 18-24-часовых культур путем замораживания при температуре минус 80°С в среде сохранения с добавлением криопротектора в виде 30% глицерина, отличающийся тем, что в качестве среды сохранения используют готовую среду Signal blood culture system medium производства фирмы Oxoid, первоначально предназначенную для диагностики бактериального заражения крови, которая включает в себя: триптонно-соевый бульон 10 г/л, желатиновый пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, поваренную соль 8 г/л, нитрат калия 2 г/л, глюкозу 1 г/л, L-аргинин 1 г/л, пируват натрия 1 г/л, желатин 1 г/л, тиогликоль натрия 0,5 г/л, цистеин HCl 0,4 г/л, двууглекислую соду 0,4 г/л, фосфатный буфер 0,3 г/л, полианетол сульфонат натрия 0,3 г/л, дитиотреитол 0,2 г/л, сульфат аденина 0,01 г/л, янтарнокислый натрий 0,01 г/л, хлорид аммония 0,008 г/л, сульфат магния 0,008 г/л, витамин K (Menadione) 0,005 г/л, рН среды 7,0.