КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Ksen, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2010 года по МПК C12N5/00 C12R1/91 A61K39/00 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, FRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) и мутированные антигены (MUM-1, СОК4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и FRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов 1 класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген как Melan-A/MART-1 содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентная) содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Известна поливалентная вакцина Mortona и соавт. [3], состоящая из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания этой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Известна вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий и вызывающая противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни больных при лечении злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Ksen из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 713Д.

Родословная клеточной линиии mel Ksen

Линия клеток получена из опухолевого образца пациентки К.Н.С., 60 лет, и/б 00/10951, находившейся на лечении в 2001 г. с диагнозом «диссеминированная меланома кожи передней брюшной стенки». Материал получен хирургическим путем при удалении метастатического пахового лимфатического узла. Предшествующее лечение: хирургическое.

Получение клеточной линии mel Ksen

Опухолевая ткань получена при удалении метастатического пахового лимфоузла. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии mel Ksen

Цитограмма культуры mel Ksen характеризуется присутствием клеток округлой формы мелкого, среднего и крупного размеров с четкими или фестончатыми границами негомогенной цитоплазмы, окрашенной в базофильные тона, и немногочисленных клеток веретенообразной и вытянутой удлиненной формы. Ядра клеток нормо- и гиперхромные с грубоглыбчатым строением хроматина, содержат центрально расположенные нуклеолы. Имеются двухъядерные, гигантские одноядерные и многоядерные клетки. Редко выявляются митозы.

Кариологическая характеристика клеточной линии mel Ksen

Дата фиксации клеток: 27.04.06

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски и состоянию хроматина. Проанализировано 20 метафаз. Число хромосом колеблется от 45 до 48. Модальное число хромосом соответствует диплоидному набору (2n).

Наблюдается транслокация части длинного плеча хромосомы 5 на короткое плечо дополнительной хромосомы 1 (в участке 1р32); делеция части длинного плеча хромосомы 5 (в некоторых метафазных пластинках таких делегированных хромосом встречается по 2 шт.); транслокация двух коротких плеч хромосомы 6 с образованием изохромосомы; транслокация короткого плеча хромосомы 7 и хромосомного материала неизвестного происхождения; моносомия по хромосоме 10; робертсоновская транслокация хромосом 15 и 21; маркерная хромосома.

Таким образом, дисбаланс кариотипа заключается в моносомии по хромосоме X, частичной трисомии по длинному и участку короткого плеча (р32-pter) хромосомы 1, частичной трисомии по короткому и части длинного плеча (р10-q12) и частичной моносомии по участку длинного плеча (q12-q21) хромосомы 5, частичной трисомии по короткому плечу и моносомии по длинному плечу хромосомы 6, частичной трисомии по короткому плечу хромосомы 7, моносомии по хромосоме 10.

Кариотип - 45~48,X,-X,+der(l)t(1;5)(p32;q21),del(5)(q12)×2,i(6)(p10),

+der(7)t(7;?)(p10;?),-10,der(15;21)(q10;q10),+mar

Культуральные свойства клеточной линии mel Ksen

Клеточная линия mel Ksen культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональной телячьей сыворотке (10%), содержащей антибиотики (пенициллин и стрептомицин в концентрации 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс/мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации клеточной линии mel Ksen

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка (20%), ДМСО (10%). Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до температуры минус 25°С, затем быстрое замораживание при температуре до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при температуре 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии mel Ksen

Пример 1. Культивирование использования клеточной линии mel Ksen.

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастатического пахового лимфатического узла меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sievetissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 15 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Ksen.

Полученная клеточная линия mel Ksen, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости). Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD63. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Заявляемая клеточная линия характеризуется экспрессией меланомного (дифференцировочного) маркера CD63, подчеркивающего специфичность данной клеточной линии.

Список литературы

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25:1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma. J. Urol. 1993, 149: 659-663.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.

4. Sondak V.K., Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine / Semin cancer Biol 2003. Dec. 13 (6):409-415.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин. Предложена новая клеточная линия меланомы человека mel Ksen для получения противоопухолевых вакцин. Заявленная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 713Д. Изобретение характеризуется экспрессией меланомного (дифференцировочного) маркера - CD63 и может использоваться для создания противоопухолевых (цельноклеточных, генноинженерных) вакцин, применяемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Клеточная линия меланомы человека mel Ksen, используемая для получения противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 713 Д.