СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ВЕТЕРИНАРНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И КОНДИЦИОННОЙ СРЕДЫ Российский патент 2018 года по МПК A61K35/28 

Область техники

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения и применения в терапевтических целях регенеративного препарата, содержащего набор биологически активных веществ, выделенных из экстракта мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга (КМ) или жировой ткани (ЖТ) животных и кондиционной среды, полученной в результате культивирования данных клеток. Предлагаемый способ позволяет получить препарат, который обеспечивает эффективное стимулирование собственных восстановительных процессов организма животных.

Предпосылки создания изобретения

В настоящее время интенсивно проводятся исследования возможности получения и дифференцировки клеток из различных типов стволовых клеток, применяемых для замещения утраченных или поврежденных клеток жизненно важных органов и тканей путем трансплантации. В ходе роста и при индукции дифференцировки исходных стволовых клеток в специализированные формируется кондиционная среда, которая также обладает различной биологической активностью, в том числе обладает терапевтическим эффектом.

Создание препарата фармацевтического назначения, содержащего биологически активные вещества, в частности, ростовые факторы, на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды, на которой данные клетки культивируются, предполагает использование биотехнологических подходов, а не клеточных технологий, что не противоречит требованиям биоэтики и нормам права. Вследствие замены клеточных технологий на биотехнологические подходы, устраняются препятствия на всех этапах промышленного внедрения препарата от доклинических исследований и до коммерциализации с последующим получением разрешения на реализацию.

Следует отметить, что дегенеративные заболевания обусловлены нарушением способности отдельных тканей организма к восстановлению за счет реализации собственного регенераторного потенциала и развитие дистрофических процессов на фоне разрастания склеротической ткани. Фармакологическое действие применяемых для лечения подобных состояний средств направлено на стимуляцию либо замещение функций сохранившихся клеточных элементов. Однако концепция компенсации нарушений органов-мишеней за счет адаптационных процессов часто оказывается несостоятельной. Представленные факты указывают на необходимость развития стратегии регенеративной медицины, которая заключается в замене погибших либо неправильно функционирующих клеточных элементов на новые.

Уровень техники

Известен ряд кондиционных сред и фармацевтических композиций, получаемых из питательных сред в результате культивирования мезенхимальных стволовых клеток стабильной культуры, данные среды могут содержать также факторы дифференцировки. Подобные аналоги обеспечивают стимуляцию регенерационных процессов, однако обладают слишком узконаправленным действием. Так, известны среды, направленные на восстановление опорно-двигательного аппарата - хрящевой [заявка на изобретение РФ 2001116126 от 08.11.1999 г., приоритет Италия] и костной ткани [Mbalaviele G, Jaiswal N et al., Endocrinology, 1999]. Известна композиция, содержащая костномозговые МСК человека в количестве не менее 10⁵ клеток/мл и культуральную питательную среду, которая используется только для регенерации кожных покровов [патент RU 2455354 С1]. Разработана кондиционная среда Majumdar MK, Thiede MA, et al., Stem Cell Res., 2000], в которой поддерживают дифференцировку МСК в механоциты или остеобласты, выделяющие цитокины, которая способна активировать продолжительный рост гемопоэтических стволовых клеток.

Известна фармацевтическая композиция, содержащая кондиционную питательную среду, поддерживавшую рост эукариотических клеток и фармацевтический носитель [RU 2001133453/13. Заявка от 12.05.2000 г., приоритет US: 09/313,538 от 14.05.1999]. Композиция может иметь различную лекарственную форму. Фармацевтический носитель может включать один или несколько внеклеточных продуктов (компонентов кондиционной среды) выделяемых методами разделения белков. Данную композицию используют для стимуляции заживления ран и ожогов. К недостаткам рассматриваемой фармацевтической композиции можно отнести то, что лечебное действие обеспечивается не применением самой кондиционной среды, а комплексом внеклеточных продуктов и других элементов композиции. При этом, роль среды заключается в поддержании жизнедеятельности используемых в композиции клеток и среды для сохранения фармацевтического носителя.

В регенеративной медицине возможно использование частиц, секретируемых МСК. Так, для лечения кожных заболеваний и ожогов могут быть применены везикулы, или экзосомы [WO 2009105044 А1]. Описан способ получения частиц, включающий получение среды, кондиционированной МСК, ее концентрирование, обработку путем гель-фильтрации, отбор фракции с динамическим рассеянием света, путем УФ-детектирования при 220 нм (сбор фракций, элюирующих со временем удерживания 11-13 минут). Полученная частица может быть использована в составе фармацевтической композиции, применяемой для лечения заболеваний. Несмотря на то, что имеются данные, указывающие на важную роль экзосом в реализации паракринных эффектов МСК, нет доказательств того, что именно фракция, описанная в изобретении, является ключевой для регенеративного действия этих клеток. Также описанная технология довольно сложно применима в процессе производства и не обеспечивает должной стандартизации конечного продукта.

Аналогом является ростовая среда, получаемая при выращивании кардиомиоцитов из МСК костного мозга [Fukuda К., Artificial Organs, 2001]. Основа рассматриваемой среды составляет IMDM, к которой добавлены антибиотики, антимикотики, L-глютамин и 20% фетальной сыворотки крови КРС, а также индуктор дифференцировки 5-азацитидин (деметилирующий агент). В ходе роста и пролиферации МСК и их дифференцировки в кардиомиоциты в среде накапливаются продукты жизнедеятельности, которые также являются компонентами данной среды. Недостатками указанной среды является то, что свойства продуктов жизнедеятельности не идентифицированы и эффект их не изучен. Кроме того, в среде сохраняются остатки препарата 5-азацитидин, которые обладают мутагенным действием.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения рассматривается кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом при термических ожогах [патент RU №2292212, 27.01.07]. Данная среда содержит минеральные соли и аминокислоты, пенициллин, амфотерицин, L-глутамин и эмбриональную телячью сыворотку, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста МСК костного мозга человека, среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в G₀ периоде клеточного цикла. Описанный прототип имеет ряд недостатков - ограниченный выбор сырья (МСК, получаемые только из костного мозга, не предполагает использование накопленной ранее и криоконсервированной культуры), узкий спектр регенеративного действия, а биологически активные вещества, входящие в клетки МСК в значительном количестве в состав препарата не входят. Определение времени сбора кондиционной среды косвенным путем (по фазе клеточного цикла), не позволяет получить продукт с максимальным содержанием цитокинов.

Сущность изобретения

Краткое описание изобретения

Способ получения регенеративного препарата на основе экстракта МСК и кондиционной среды, образующейся в процессе роста клеток, включает следующие этапы: деконсервирование или выделение de novo клеточного материала из косного мозга или жировой ткани животных, культивирование МСК в среде на основе DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с 10 % содержанием фетальной бычьей сыворотки (ФБС) до образования кондиционной среды с определенным содержанием ключевых интерлейкинов - ИЛ-β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, сбор кондиционной среды, получение экстракта МСК, путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, объединение экстракта с кондиционной средой МСК, стабилизация компонентов полученного препарата посредством глицина в конечной концентрации 20 мг/мл, стерилизующая фильтрация, розлив во флаконы и лиофильная сушка.

Подробное описание изобретения

При создании настоящего изобретения была поставлена задача по применению концепции регенеративной медицины в ветеринарии для восстановления функции жизненно важных органов животных путем замены дефективных клеточных элементов на новые за счет активации прогениторных клеток пораженной ткани.

Технический результат достигается посредством разработки способа получения препарата для ветеринарии, обладающего комплексным воздействием на регенеративные процессы в организме.

Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата обладающего высокой эффективностью, которая обусловлена действием сбалансированного комплекса цитокинов, содержащихся в экстрактах и секретируемых мезенхимальными стволовыми клетками в культуральную среду. Для реализации регенеративного действия МСК было подобрано содержание ключевых интерлейкинов, а именно ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, являющихся основными стимуляторами механизмов неспецифической защиты организма и специфического иммунного ответа, а также активаторами репаративных процессов в поврежденных тканях.

Предлагаемый способ предполагает следующие операции: выделение мезенхимальных стволовых клеток из косного мозга или жировой ткани животных (de novo) или деконсервирование готовой клеточной культуры, культивирование МСК в среде на основе DMEM с 10 % содержанием ФБС до образования кондиционной среды (в которой определяется содержание ключевых интерлейкинов: ИЛ-1β - не менее 2 пг/мл, ИЛ-2 - не менее 2 пг/мл, ИЛ-6 - не менее 10 пг/мл, ИЛ-10 - не менее 2 пг/мл, определяемых при помощи иммуноферментного анализа (ELISA)), сбор кондиционной среды, получение экстракта МСК, путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, объединение экстракта с кондиционной средой МСК, стабилизация компонентов полученного препарата (добавление глицина до конечной концентрации 20 мг/мл), розлив во флаконы по 1 мл и лиофильная сушка.

В данном изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному способу, и в виде коммерческих культур МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения (например, такие как АТСС).

Краткое описание фигур

Изобретение поясняется фото, графиками и таблицами:

Фото 1. Мезенхимальные стволовые клетки из КМ крысы, нулевой пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 10×).

Фото 2. Мезенхимальные стволовые клетки из КМ крысы, третий пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 40×).

Фото 3. Колония МСК из ЖТ крысы, нулевой пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 40×).

График 1. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС МСК КМ) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.

График 2. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (КС МСК ЖТ) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.

График 3. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК КМ деконс.) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.

График 4. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс) на активность АлТ в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).

График 5. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс.) на активность АсТ в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).

График 6. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс.) на содержание белка в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).

Таблица 1. Значение ИП культур клеток ФЭП и МСК при добавлении разных концентраций регенеративного препарата.

Таблица 2. Биохимические параметры поражения печени в исследуемых группах животных.

Возможность осуществления изобретения и эффективность его применения подтверждаются следующими примерами:

Пример 1. Клетки костного мозга (КМ) выделяли из бедренных костей крыс (в количестве, обеспечивающем посевную концентрацию не менее 1×10⁶ кл/мл) сразу после декапитации, помещали в охлажденную среду DMEM/F12 (Biowest, USA), содержащую гентамицин (80 мкг/мл, Биолот, Россия) и амфотерицин Б (0,25 мкг/мл, Biowest, USA), дважды отмывали от крови указанной средой центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 минут.

Клетки высевали с концентрацией 1×10⁶ кл/мл (для чего производили предварительный подсчет клеток в камере Горяева с учетом жизнеспособности путем субвитального окрашивания трипановым синим) культивировали в пластиковых флаконах (SPL, Корея) с площадью ростовой поверхности 175 см² при температуре 37°С в атмосфере с 5%-м содержанием СО₂. В состав ростовой среды входила питательная среда DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10 % ФБС (Sigma Aldrich, USA), гентамицин (80 мкг/мл), амфотерицин Б (25 мкг/мл, Biowest, USA). Выделение клеточной фракции МСК основано на адгезии данных клеток к культуральному пластику, как субстрату.

Спустя сутки после начала культивирования производили ополаскивание средой с антибиотиком для удаления флотирующей фракции клеток и производили замену ростовой среды. В дальнейшем замену среды выполняли раз в 3-4 суток. По достижению конфлюентности монослоя (контролируется визуально при помощи инвертированного микроскопа) не менее 85%, его дезагрегировали диспергирующим раствором (0,05-0,1% трипсина (Biowest, USA) в растворе Версена (ПанЭко, Россия)) и проводили посев в новые культуральные флаконы с коэффициентом пересева 1:3.

Для получения кондиционной среды культуру вели в течение 3-4 пассажей, затем выполняли посев в культуральные флаконы из расчета 5-15×10³ клеток на 1 см² площади ростовой поверхности в 90±5 мл ростовой среды и культивировали в описанных выше условиях до достижения необходимой концентрации интерлейкинов в среде.

При достижения необходимой концентрации биологически активных веществ кондиционную среду, содержащую все продукты секреции МСК, собирали в стерильные центрифужные пробирки, очищали путем центрифугирования при 3000 об/мин и температуре 5±1°С в течение 10 минут от клеточного дебриса.

Полученная кондиционная среда может использоваться непосредственно по назначению или храниться в течение продолжительного времени в определенных условиях (до семи суток - при температуре 3±1°С, более длительно хранение требует температуры не выше минус 20°С).

После сбора кондиционной среды, получали экстракт МСК КМ: клеточный монослой, при конфлюентности не менее 90%, дезагрегировали указанным выше диспергирующим раствором, добавляли 0,9%-й раствор хлорида натрия (5-10 мл на 1 культуральный флакон), подвергали замораживанию при температуре минус 20±2°С, после чего выполняли оттаивание при комнатной температуре. Полученный экстракт МСК КМ собирали в стерильные центрифужные пробирки, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования при 3000 об/мин и температуре 5±3°С в течение 10 минут.

Для получения регенеративного препарата, осадок после центрифугирования, представляющий собой экстракт МСК КМ, объединяли с кондиционной средой, измеряли содержание ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, добавляли глицин (до конечной концентрации 20 мг/мл), разливали во флаконы по 1 мл и лиофильно высушивали.

Так, к концу четвертой недели от начала культивирования МСК КМ крыс можно получить до 3000 мл (при посевной концентрации на этапе выделения не менее 1×10⁶ кл/мл) раствора для лиофилизации на основе экстракта и кондиционной среды МСК КМ, который может быть использован для приготовления препарата, стимулирующего регенеративные процессы организма животного.

Пример 2. Клеточный материал получали из подкожной жировой ткани (ЖТ) крысы (в количестве, обеспечивающем посевную концентрацию не менее 1×10⁶ кл/мл) в стерильных условиях, после декапитации животного. Жировую ткань помещали в буферный раствор Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (Biowest, USA), содержащий гентамицин (80 мкг/мл, Биолот, Россия), фрагментировали до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергали ступенчатой ферментативной обработке. Ферментативную обработку выполняли следующим образом: к измельченной жировой ткани добавляли питательную среду DMEM high glucose (Biowest, USA) с добавлением антибиотика и антимикотика, а также фермента трипсина до концентрации 0,1-0,15%, выдерживали 30±5 минут при температуре 37±1°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке, затем среду с клетками фильтровали через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD) и добавляли 0,2-0,5% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), для инактивации трипсина. Повторяли описанную операцию дважды со снижением времени инкубации до 15±5 минут.

После фильтрации клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 1200 об/мин, супернатант полностью удаляли. Полученный осадок ресуспендировали в питательной среде DMEM high glucose (Biowest, USA) с 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), после чего клетки высевали в культуральные флаконы (70±5 мл клеточной суспензии/флакон) с площадью ростовой поверхности 175 см² (SPL, Корея) с концентрацией 1×10⁶ кл/мл и культивировали при 37°С с 5%-ной концентрацией СО₂.

Выделение клеточной фракции МСК, как и в предыдущем примере, основано на адгезии данных клеток к культуральному пластику, как субстрату. Накопление клеточной массы, формирование кондиционной среды и получение регенеративного препарата выполняли аналогичным образом примеру 1. Время производства препарата также составляло 4 недели, количество продукта - до 3000 мл (при посевной концентрации на этапе выделения не менее 1×10⁶ кл/мл) раствора для лиофилизации на основе экстракта и кондиционной среды

Пример 3. Клеточный материал получали путем деконсервирования культур клеток МСК (КМ или ЖТ крыс). Криопробирку с клетками (концентрация клеток не менее 1×10⁶ кл/мл, объем клеточной суспензии - 1 мл) помещали на водяную баню с температурой воды 37±1°С, периодически встряхивая, до полного размораживания. Производили отмывку клеток от криопротектора при помощи питательной среды DMEM high glucose (Biowest, USA). Для этого клеточную суспензию переносили в стерильный культуральный флакон с площадью ростовой поверхности S=25 см², добавляли небольшими дозами, чтобы исключить осмотическое повреждение, питательную среду DMEM high glucose (10-15 мл), полученную взвесь равномерно распределяли на две центрифужные пробирки и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в ростовой среде, содержащую питательную среду DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), гентамицин (40 мкг/мл, Биолот, Россия), амфотерицин Б (25 мкг/мл, Biowest, USA). Производили посев клеток (70±5 мл клеточной суспензии/флакон) в концентрации 8-10×10⁴ кл/мл в культуральные флаконы с площадью ростовой поверхности 175 см² (SPL, Корея) и культивировали при 37°С с 5% содержанием СО₂. Ростовую среду меняли каждые 3-4 суток. Накопление клеточной биомассы, получение кондиционной среды и препарата осуществляли аналогично как в Примере 1.

Пример 4. Свойства лекарственного средства на основе экстракта и кондиционной среды МСК костного мозга и жировой ткани оценивали по влиянию на пролиферацию культуры клеток фибробластов эмбрионов человека (ФЭЧ) и мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крыс (in vitro).

Для этого, модельные культуры клеток брали на третьем пассаже, производили посев в 12-ти-луночные культуральные планшеты (SPL, Германия) с добавлением исследуемого регенеративного препарата в ростовую среду в различных концентрациях (1%, 5%, 10%) культивировали в течение трех суток в стандартных условиях (инкубировали во влажной камере в CO₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂) с добавлением 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA) к среде 199 (ГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова, Россия) для ФЭЧ и DMEM/F12 (1:1) (Biowest, USA) - для МСК. Посевная концентрация клеток ФЭК - 8-10×10⁴ кл/мл, МСК - 7-9×10⁴ кл/мл среды. В качестве контроля использовали клетки, выращенные в ростовой среде без добавления регенеративного препарата.

По окончании инкубации проводили снятие выросших культур с поверхности пластика и определение пролиферативного индекса. Индекс пролиферации (ИП) определяли, как отношение количества клеток в 1 мл суспензии, полученной в результате снятия клеток с подложки по достижению конфлюентности монослоя к посевной концентрации клеток (количество клеток в мл раствора при посеве на культуральные планшеты).

Полученные данные для культур двух морфологических типов свидетельствуют (табл. 1, графики 1-3) о повышении уровня пролиферативных свойств клеток обеих культур при добавлении в ростовые среды предлагаемого регенеративного препарата (полученного всеми тремя описанными в предыдущих примерах модификациях способа) на 10-85% для ФЭЧ и 2-25 % для МСК по сравнению с ростовой средой, при этом наблюдалась линейная зависимость между концентрацией препарата и значением индекса пролиферации.

Пример 5. Регенеративное действие препарата на основе экстракта и кондиционной среды культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани было изучено на модели острого поражения печени (МОПП) крыс (in vivo). Модель острого поражения печени была выполнена путем однократного введения крысам в желудок через зонд парацетамола (N-(4-гидроксифенил)ацетамида) в виде суспензии в дозе 700 мг на 1 кг массы тела. Процедура лечения после МОПП заключалась в ежедневном внутримышечном введении 0,5 мл исследуемого препарата животным опытной группы в течение 5 дней. В качестве контроля использовали крыс с МОПП, которые не подвергались терапевтическим воздействиям.

Спустя сутки после окончания курса лечения крыс выводили из эксперимента путем декапитации, предварительно обеспечив наркоз за счет внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 400 мг на 1 кг массы тела животного. В сыворотке крови определили активность ферментов аспартат-(АсТ) и аланинаминотрансферазы (АлТ) с помощью стандартного набора Vital и содержание общего белка - биуретовым методом. Исследованные биохимические параметры отражают функциональное состояние печени. Ферменты АсТ и АлТ присутствуют в значительных количествах в печени и почках, поэтому в норме концентрации АсТ и АлТ в крови невелики. При повреждении гепатоцитов происходит потеря ферментов АсТ и АлТ, и концентрация этих биохимических маркеров в крови возрастает. Изменение уровня общего белка (признак грубой патологии печени) не наблюдалось.

Результаты исследования (табл. 2 и графики 4-6) показывают, что применение в течение 5 дней предлагаемого регенеративного препарата на основе экстракта и кондиционной среды с использованием мезенхимальных стволовых клеток, как полученных de novo из костного мозга и жировой ткани, так и деконсервированных, приводило к значительному улучшению состояния животных с ОПП, что подтверждается концентрацией исследованных маркеров повреждения печени (показатели уровней АсТ, АлТ). Так, концентрации указанных ферментов в группе животных, получавших регенеративный препарат, значимо не отличались от показателей в группе интактных крыс (не подвергшихся МОПП).

Таким образом, предлагаемый регенеративный препарат обладает терапевтическим эффектом при остром поражении печени животных. Существенных различий в эффективности препарата, полученного из различных источников культур мезенхимальных стволовых клеток, также не было выявлено.

Источники информации:

1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков - М.: Мир, 1983. - 264 с.

2. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С. 4-8.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Фонима Т.Н., Ветошкина Т.В., Хричкова Т.Ю., Ермакова Н.Н., Плотников М.Б., Алиев О.И., Чернышева Г.А. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Приложение 2. - С. 14-21.

4. Патофизиология: Учебник для медицинских ВУЗов. / Под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2001. - 681-687.

5. Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Удут В.В. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.

6. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Френши - М.: Мир, 1989. - 333 с.

7. «Кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом», № патента 2292212, дата публикации 27.01.07 г, авторы: Коноплянников А.Г., Колесникова А.И., Саенко А.С., Бардычев М.С., Пасов В.В., Курпешева А.К., Крикунова Л.И.;

8. «Биологически активный препарат "лимфокинин", обладающий иммуномодулирующими свойствами», № патента 2048816, № заявки 93031657/14, дата подачи заявки 06.07.1993, дата публикации 27.11.1995, авторы: Быковская С.Н., Шадрин О.В., Дворянченко Д.Ю., патентообладатель ЗАО «Симера»;

9. «Средство для лечения ожогов и ран на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека, способ получения средства и способ лечения ожогов и ран», № патента 2574017, авторы: Стамбольский Д.В., Ткачук В.А., Семина Е.В., Тарасова Е.В., Рубина К.А., Кочегура Т.Н., Сысоева В.Ю., Ефименко А.Ю., Акопян Ж.А.;

10. «Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, способ его получения, способ стимуляции заживления ран или лечения ожогов, способ коррекции косметического дефекта, способ ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос», № патента 2280459, № заявки 2001133453/13, дата публикации заявки 20.01.2005, дата публикации 27.07.2006, авторы: Нотон Г.К. (Us), Хорвитз Д.Л. (Us), Эпплгейт М.А. (Us), Зелтинджер Дж. (Us), Мэнсбридж Дж.Н. (Us), Керн A. (Us), Лэндин Л.К. (Us), Рэтклифф Э. (Us), Пинни Р.Э. (Us); патентообладатель: Скинмедика, Инк. (Us);

11. «Mesenchymal stem cell conditioned medium», № патента WO 2008020815 A1, № заявки PCT/SG2007/000257, дата публикации 21.02.2008 г., авторы: Sai Kiang Lim, Elias Lye, патентообладатель Agency For Science, Technology And Research;

12. A. van Koppen, J.A. Joles, B. W. M. van Balkom et al., "Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned medium rescues kidney function in rats with established chronic kidney disease," PLoS ONE, vol. 7, no. 6, Article ID e38746, 2012;

13. В.R. Zhou, Y. Xu, S.L. Guo et al., "The effect of conditioned media of adipose-derived stem cells on wound healing after ablative fractional carbon dioxide laser resurfacing," BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 519126, 9 pages, 2013;

14. M.K. Jr. Patterson, Measurement of growth and viability of cells in culture. In: W.B. Jakoby, I.H. Pastin, eds., Methods in Enzymology, New York: Academic Press Inc., Vol. 58, 141-152, 1979;

15. Mbalaviele G, Jaiswal N, Meng A, Cheng L, Van Den Bos C, Thiede M. Human mesenchymal stem cells promote human osteoclast differentiation from CD34+ bone marrow hematopoietic progenitors // Endocrinology. 1999 Aug; 140 (8): 3736-3743;

16. S.H. Bhang, S. Lee, J.Y. Shin, T.J. Lee, H.K. Jang, and B.S. Kim, "Efficacious and clinically relevant conditioned medium of human adipose-derived stem cells for therapeutic angiogenesis," Molecular Therapy, vol. 22, no. 4, p. 862, 2014;

17. Leo Timmers, Sai Kiang Lim, Imo E. Hoefer «Human mesenchymal stem cell conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction», Stem Cell Research vol. 6, pp. 206-214, 2011;

18. Reza Moghadasali, Henricus A.M. Mutsaers, Mahnaz Azarnia "Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates regeneration of human renal proximal tubule epithelial cells after gentamicin toxicity" - Experimental and Toxicologic Pathology - vol. 65, pp.. 595-600, 2013.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения регенеративного ветеринарного препарата. Способ получения регенеративного ветеринарного препарата включает: культивирование выделенных de novo или деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из жировой ткани или костного мозга животного, в жидкой питательной среде с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки. Получают кондиционную среду с содержанием интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 в концентрациях не менее 2; 2; 10 и 2 пг/мл. Объединяют с экстрактом МСК, полученным путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии. Добавляют глицин до конечной концентрации 20 мг/мл раствора для лиофилизации, проводят стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию. Использование данного способа получения ветеринарного препарата с применением глицина в конечной концентрации 20 мг/мл позволяет стабилизировать рН и регенеративную активность препарата. 9 ил., 2 табл., 5 пр.

Способ получения регенеративного ветеринарного препарата включает: культивирование выделенных de novo или деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из жировой ткани или костного мозга животного, в жидкой питательной среде с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, получение кондиционной среды с содержанием интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 в концентрациях не менее 2; 2; 10 и 2 пг/мл, добавление экстракта МСК, полученного путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, добавление глицина до конечной концентрации 20 мг/мл раствора для лиофилизации, стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию.