СПОСОБ БИОПРОТЕКЦИИ, ОСНОВАННЫЙ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРЕПАРАТА БТШ70, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОТ ОПАСНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОРАЖАЮЩИХ ФАКТОРОВ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/02 A61P43/00 

Изобретение относится к области иммунологии.

Изобретение может быть использовано в иммунологических и вирусологических исследованиях по изучению и оценке защитных свойств препаратов нового поколения против поражающих факторов различной природы, а также для разработки методов биологической защиты.

Проблема защиты организма человека от поражающих факторов биологической природы в связи с возможными актами терроризма и борьбой с инфекционными заболеваниями в настоящее время является актуальной задачей. Как свидетельствуют данные многочисленных исследований, проведенных отечественными и зарубежными специалистами, ведущую роль в защите живой клетки от различных поражающих факторов и поддержании гомеостаза всего организма играет семейство белков теплового шока.

Исходя из этого, создание средств специфической профилактики и разработка принципиально новых биопротекторов, защищающих или снижающих патологическое воздействие неблагоприятных факторов биологической природы, является особенно важным.

Однако до последнего времени способов конструирования препаратов-биопротекторов, основанных на регуляции в организме уровня наиболее значимых белков теплового шока (БТШ), разработано не было, что было связано с отсутствием оптимальных моделей изучения системы БТШ и технологии получения препаративных количеств необходимых полипептидов. Вместе с тем, современные достижения в области молекулярной и клеточной биологии позволяют определить подходы, с помощью которых можно преодолеть вышеуказанные трудности.

К настоящему времени накопилось достаточное количество экспериментальных данных, свидетельствующих о ведущей роли системы БТШ в защите клеток организма как от внутренних, так и от внешних стрессовых факторов.

Анализ данных научной литературы свидетельствует о важности системы белков теплового шока для обеспечения гомеостаза организма на всех стадиях его развития и в экстремальных для него условиях. К основным клеточным процессам, регулируемым БТШ, относятся: клеточный цикл и деление, дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз, сигнальная трансдукция, репарация ДНК, трансмембранный и везикулярный транспорт, реакция на стрессовые воздействия, в том числе на патогены. Особенно высокую эффективность в эксперименте, по данным литературы, демонстрирует препарат из семейства БТШ70 [1, 2].

Основываясь на этих научных фактах, было сделано предположение о ключевой роли БТШ70 в защите организма от стресса различной этиологии и о возможности использования экзогенного физиологически активного пептида (ФАП) в качестве основы при разработке профилактического средства, повышающего устойчивость организма к поражающим факторам биологической природы.

Белки, относящиеся к семейству БТШ70, индуцируются в клетках и тканях всех известных организмов, включая человека, под действием огромного числа факторов абиогенного и натурального происхождения. В отдельной клетке млекопитающих имеется несколько членов семейства, однако только один из них, БТШ70 или БТШ72 (реже БТШ70), способен накапливаться в клетках в ходе их реакции на какое-либо воздействие. К индукторам БТШ70 относятся агенты, которые способны напрямую вызывать изменения в структуре клеточных (тканевых) белков, например различные отравляющие и наркотические вещества, а также радиация, нагрев до сублетальной температуры, этанол, свободные радикалы, тяжелые металлы, гипоксия, зоо- и фитотоксины и другие.

На сегодняшний день достаточно подробно изучен защитный эффект БТШ70 в отношении целого ряда химических факторов: солей тяжелых металлов, различных химических соединений, являющихся неблагоприятными сопутствующими факторами химического производства, цитотоксических лекарственных средств, однако практически отсутствуют данные о профилактической эффективности БТШ70 в отношении токсинов, занимающих промежуточное положение между факторами химической и биологической природы.

Еще одну группу индукторов БТШ70 представляют агенты, влияющие на структуру белка косвенно, через изменения функции белоксинтезирующих и модифицирующих систем, например ингибиторы протеасом и протеазных систем, вирусная инфекция и действие бактериальных токсинов [3-5]. К третьей группе относятся факторы, не являющиеся стрессовыми. Это индукторы нормальных физиологических процессов в клетке, пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Экспрессия БТШ70 модулируется специальными белками, факторами теплового шока, причем исследователи не исключают возможности влияния самих БТШ на активность собственных транскрипционных факторов, то есть авторегуляции процессов.

БТШ70 известен благодаря двум своим свойствам, которые, возможно, связаны друг с другом. Во-первых, белок обладает шаперонной активностью, то есть способностью связывать вновь синтезированные или поврежденные полипептиды с последующим восстановлением их структуры или удалением их из клетки. Действие шаперонного механизма, основанного на БТШ70, до конца не изучено. Однако установлено, что в нем участвует не только сам БТШ70, но и другие белки, в частности, активирующие его АТФ-азу. Шаперонный механизм, позволяющий проводить коррекцию сборки полипептидных цепей и крупных надмолекулярных комплексов во всех органеллах, необходим любой клетке в нормальных условиях, тем более при действии повреждающих агентов. Именно поэтому в условиях стресса, когда появляются неправильно собранные белковые системы, клетка включает аппарат синтеза БТШ70, что приводит к накоплению этого белка в высокой концентрации.

Полное отсутствие экспрессии БТШ70 или его недостаточное количество в клетке может порождать различные патологии или усиливать чувствительность клеток, а следовательно, и организма в целом к стрессовым воздействиям. В то же время эксперименты по защите клеток от внешних поражающих факторов с помощью введенного экзогенного БТШ70 демонстрируют "спасающую" роль гетерологичного пептида. Поэтому в настоящее время все большее внимание биологов привлекает защитная роль БТШ70 при его экзогенном введении. Показано, например, что применение экзогенного БТШ70 in vitro увеличивает устойчивость культуры нервных клеток к тепловому стрессу и стауроспорин-обусловленному апоптозу [6]. Полагают, что при нормальных условиях БТШ70 "работает" в клетках как молекулярный шаперон, функция которого заключается в свертывании/развертывании, формировании ансамблей белков или их разрушении, а также транслокации цитоплазматических белков. В условиях стресса БТШ70 способствует удалению из клетки денатурированных белков, что облегчает нормальное функционирование клеток. Протективное действие БТШ70 может быть обусловлено и его способностью модифицировать активность кальций-зависимых калиевых каналов, как это наблюдается при его экзогенном применении [7].

Тем не менее, за исключением нескольких попыток в изучении протективной функции БТШ70 in vitro, защитные эффекты экзогенного БТШ70 in vivo практически не изучены.

Таким образом, разработка принципиально нового профилактического препарата для повышения устойчивости организма к поражающим факторам биологической природы, основанного на БТШ70, является актуальной задачей. До настоящего времени способ защиты на основе препарата БТШ70 в Российской Федерации не разработан и не имеет аналогов.

Целью настоящего изобретения является разработка способа защиты против поражающих факторов биологической природы, основанного на использовании препарата БТШ70.

Сущность изобретения состоит в том, что разработанный способ биопротекции, основанный на использовании препарата БТШ70, позволяет обеспечивать неспецифическую защиту от опасных инфекционных заболеваний вирусного происхождения. Обоснованы форма препарата биопротектора на основе БТШ70 и способы его введения в организм лабораторных животных. В качестве модельной вирусной инфекции используют экспериментальную инфекцию Венесуэльского энцефаломиелита лошадей - ВЭЛ (вирулентный штамм 237 вируса ВЭЛ) белых мышей.

Пример выполнения

Характеристика и молекулярно-биологические свойства препарата БТШ 70.

Обезвоженный препарат БТШ70, полученный с использованием оборудования RapidVapN₂ (Labconco, США), обладает следующими значениями физико-химических показателей:

- остаточная влажность - 8%;

- растворимость в дистиллированной воде - 100%;

- стабильность препарата - 95%;

- специфичность - без изменения.

Остаточную влажность определяют по стандартной методике путем взвешивания тары (пенициллиновый флакончик) с обезвоженным препаратом БТШ70 после выпаривания и через 4 часа инкубации в сухожаровом шкафу при температуре 120°С. Взвешивание проводят на аналитических весах Acculab V-200 (США). Показатель остаточной влажности соответствует процентному выражению разницы масс сухого препарата.

Растворимость определяют визуально, а также рассчитывают исходя из определенных концентраций препарата в растворе до получения сухой формы и после разведения обезвоженного БТШ70.

Стабильность и специфическую активность препарата оценивают с использованием методов электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга.

В процессе отработки технологии получения обезвоженного препарата БТШ70 с использованием системы RapidVapN₂ был подобран оптимальный температурно-временной режим, позволяющий получать препарат БТШ70 с вышеуказанными значениями оцениваемых физико-химических показателей.

Данные параметры приемлемы для сухих форм препаратов.

Молекулярно-биологические свойства сухой формы препарата БТШ70 представлены на фиг. 1.

Краткое описание фиг. 1.

Электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) выполняли по общепринятому методу Лаэммли с использованием комплекта оборудования MiniProtean-II (Bio-Rad, США) [8]. Для электрофореза готовили 2 пластины геля. Одна пластина геля использовалась для определения молекулярной массы и степени чистоты анализируемого препарата БТШ70. Вторую пластину геля использовали для иммуноблоттинга с целью оценки специфической активности препарата БТШ70.

После проведения электрофореза в 10% ПААГ пластину геля обрабатывали раствором для фиксации гелей в течение 1 часа, затем окрашивали раствором Кумасси R-250 в течение 2-3 часов при комнатной температуре. Избыток краски удаляли кипячением геля в дистиллированной воде в течение 20-30 мин.

Молекулярные массы белков определяли по калибровочному графику, построенному по показателям относительной подвижности белковых зон препарата БТШ70 к молекулярной массе белков-маркеров.

Данные, представленные на фиг. 1, свидетельствуют о наличии в препарате белка с молекулярной массой 70,0 кДа.

Степень чистоты препарата оценивают визуально, просматривая ПААГ в проходящем свете, и с использованием сканирующего денситометра CS-9301PC (Shimadzu, Япония). При учете результатов наличие дополнительных полос при просмотре электрофоретического геля, расчетная молекулярная масса которых не соответствует нативному белку БТШ70 (70 кДа), является признаком деградации исходного препарата. Проведенное исследование показывает, что в препарате БТШ70 не выявлено дополнительных полос полипептидов, что свидетельствует о высокой степени чистоты данного белка.

Специфичность препарата БТШ70 оценивают с помощью метода иммуноблоттинга. В качестве специфических антител в реакции используют мышиные моноклональные антитела против БТШ70 фирмы USBiological (США) в рабочем разведении 1:300. Отрицательным контролем служит сыворотка неиммунных белых мышей в рабочем разведении 1:300. В качестве конъюгата используют белок А, меченный пероксидазой хрена, в рабочем разведении 1:1000, фирмы Promega (США).

Проведенный анализ подтверждает специфическую иммунологическую активность БТШ70.

Краткое описание фиг. 2.

Исходя из предложенного способа использования препарата БТШ70 в качестве средства защиты против биологических поражающих факторов, в процессе исследований был разработан лабораторный образец препарата.

Лабораторный образец препарата представлен двумя флакончиками, в одном из которых находится обезвоженный препарат БТШ70, в другом - растворитель (физиологический раствор). Набор комплектуется крышкой-капельницей для интраназального применения. Использование двухкомпонентной формы препарата позволяет хранить его в течение длительного времени без потери физиологической эффективности. Применение препарата в двухкомпонентной форме возможно в том числе и для внутривенной инъекции.

Способ защиты против поражающих факторов биологической природы при использовании препарата БТШ70

На фиг. 3 показана профилактически-лечебная схема применения БТШ70 при интраназальном введении препарата белым мышам-самцам линии BALB/c (8-10 г).

Лабораторный образец препарата, представленный двумя флаконами, в одном из которых находится обезвоженный препарат БТШ70, в другом - растворитель (физиологический раствор), извлекают из холодильника, температура хранения - от 2°С до 4°С. К обезвоженному препарату БТШ70 добавляют растворитель, доводя до конечной концентрации белка в растворе 1 мг·мл^-1.

С целью оценки неспецифических защитных свойств препарата БТШ70 в отношении вируса ВЭЛ используют здоровых самцов белых мышей линии BALB/c массой 7-8 г, содержавшихся в виварии на стандартном рационе.

В исследованиях по оценке защитной эффективности разрабатываемого профилактического средства в отношении вируса ВЭЛ используют жидкую форму препарата в виде назальных капель.

Применение схемы экстренной профилактики - лечения было продиктовано тем, что воздействие патогена на макроорганизм (заболевание/гибель) определяется не только инфицирующей дозой возбудителя, но и многими другими факторами, включая и количество биологически активного возбудителя, реплицирующегося в организме чувствительного животного. Поэтому было необходимо создать защитную концентрацию изучаемого профилактического препарата в течение срока, равного, как минимум, инкубационному периоду вызываемого заболевания. Инкубационный период заболевания, вызванного вирусом ВЭЛ, не превышает 5 суток. В этой связи препарат БТШ70 вводят животным интраназально в концентрации 15 мкг/мышь по схеме экстренной профилактики (в течение трех суток перед заражением вирусом ВЭЛ) - лечения (в течение 5 суток после заражения вирусом ВЭЛ), 1 раз в сутки.

В качестве инфицирующего материала используют гомогенат плодиков развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных вирулентным штаммом 237 вируса ВЭЛ.

Исходная биологическая активность вируссодержащего препарата, определенная титрованием на белых мышах BALB/c массой 7-8 г при подкожном инфицировании, составляет 9,12 lg LD₅₀·мл^-1. Культуру вируса ВЭЛ разводят с 10-кратным шагом (10^-1-10^-9) солевым раствором Хенкса, содержащим 2% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 Ед·мл^-1. Животных каждой из трех групп заражают тремя дозами вируссодержащей суспензии: 1,12, 0,12 и 0,012 lg LD₅₀·мл^-1. Первая группа мышей не получает препарат БТШ70 и служит в качестве положительного контроля, вторая группа получает препарат БТШ70 по схеме экстренной профилактики и лечения, а третьей группе вводят препарат БСА по той же схеме (отрицательный контроль). Каждая группа состоит из 8 животных. Гибель животных до 2-го дня после инфицирования считается неспецифической. Учет гибели животных проводится до 14-го дня после инфицирования.

В таблице 1 представлены результаты сравнительной оценки продолжительности жизни и гибели инфицированных вирусом ВЭЛ белых мышей, получавших и не получавших препарат БТШ70.

Протективную эффективность препарата БТШ70 (показатель защиты) рассчитывают, регистрируя гибель животных в эксперименте с последующим расчетом процента выживших животных. Процент выживших животных и среднюю ошибку процента рассчитывали по таблице B.C.Генеса [9].

На основании полученных данных о проценте выживших в эксперименте животных рассчитывали показатель защиты (ПЗ), как разность процентов выживших животных в опытной и контрольной группах.

Биологическую активность вируса и токсичность поражающих факторов химической природы, выраженную в LD₅₀, определяли, используя в опыте 6-10 животных на каждую дозу. Статистическую обработку проводили по методу В.Кербера в модификации И.П.Ашмарина [10].

Как следует из данных, представленных в таблице 1, биологическая активность вируса ВЭЛ в группе животных, получавших БТШ70, снижается по сравнению с контролем на 1,0 lg LD₅₀·мл^-1.

В группе животных, зараженных инфицирующей дозой вируса ВЭЛ, равной 1,12 lg LD₅₀·мл^-1, препарат БТШ70 защищает от гибели 50% животных по сравнению с контролем. При этом среднегармоническое время жизни животных возрастает более чем в 2 раза. В группе животных, получавших интраназально БСА, защитного эффекта препарата отмечено не было. В группах мышей, зараженных инфицирующими дозами вируса, равными 0,12 и 0,012 lg LD₅₀·мл^-1, наблюдается та же тенденция, выраженная в меньшей степени, что, вероятно, связано со снижением гибели мышей в группе положительного контроля и увеличением продолжительности их жизни.

Интраназальное введение белым мышам препарата БТШ70 по схеме экстренная профилактика - лечение вызывает защиту от гибели не менее 50% животных, инфицированных летальной дозой вирулентного штамма 237 вируса ВЭЛ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Feder M.E., Hofmann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology // Annu. Rev. Physiol. - 1999. - Vol.61. -P.243-282.

2. H.Hauser, L.Shen, Q.L.Gu et al. Secretory heat-shock protein as a dendritic cell-targeting molecule: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines // Gene Ther. - 2004. - Vol.11, №11. - Р.924-932.

3. Ульмасов Х.А., Каррыева Б.Ч., Караев К. Стрессовые белки и адаптация. - Ашхабад, 1993. - 212 с.

4. Muchowski P.J., Schaffar G., Sittler A., Wanker E.E., Hayer-Hartl M.K., Hartl U. HSP70 and HSP40 chaperones can inhibit self assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol.97, №14. - P.7841-7846.

5. Lee S.-H., Kim M., Yoon B.-W., Kim Y.-J., Ma S.-J., Roh J.-K., Lee J.-S., Seo J.-S. Targeted hsp70.1 disruption increases infarction volume after focal cerebral is chemia in mice // Stroke. - 2001. - Vol.32. - P.2905-2912.

6. Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova O., Fridlanskaya I., Tytell M., Cheetham M., Margulis B. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance // Brain Res. - 2001. - Vol.914, №№1-2. - P.66-73.

7. Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A., Kinev A.V., Voronin A.P. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - Vol.1282, №1. - P.156-62.

8. Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol.227. - P.680-685.

9. Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - M.: Наука, 1964. - 208 с.

10. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л., 1962. - 127 с.

11. Пшеничнов В.А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. - M.: Медицина, 1974. - 167 с.

Таблица 1
Защитная эффективность препарата БТШ70 в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ у белых мышейИнфицирующая доза вируса ВЭЛ, штамм 237,lg LD₅₀·мл^-1Выжило животных в группеСреднегармоническое время жизни инфицированных животных до гибели контрольБСАБТШ70контрольБСАБТШ70m/n%m/n%ПЗ, %m/n%ПЗ, %1,121/812±120/80+10-125/862±18504,356,311,30,123/838±183/838±1806/875±16376,2011,125,40,0127/888±127/888±1208/8100-101236,077,0∞Биологическая активность, lg LD₅₀·мл^-1≥9,12≥9,24≤8,12---Коэффициент защиты (КЗ), lg-<0≥1,0---Примечания
1. БТШ70 и БСА вводили белым мышам интраназально за три дня до заражения вирулентным штаммом 237 вируса ВЭЛ и в течение 5 суток после инфицирования, 1 раз в сутки по 15 мкг на мышь.
2. m - количество выживших животных в группе; n - общее количество животных в группе.
3. КЗ рассчитывали как разность lg LD₅₀×мл^-1 в контрольной и опытной группах.
4. Показатель рассчитывали по формуле: 1/=(l/t₁+1/t₂+...+1/t_N)/N, где t₁, t₂...t_N - сроки гибели каждого животного в группе из N животных. Для животных, оставшихся живыми, принимали [15].

Изобретение относится к медицине, к иммунологии и может быть использовано для биопротекции от опасных биологических и химических поражающих факторов. Белым мышам, инфицированным вирусом ВЭЛ в дозе 1,12 lg LD₅₀·мл^-1, вводят ежедневно однократно интраназально раствор препарата БТШ70 в дозе 15 мкг на мышь в течение трех дней до и в течение пяти дней после инфицирования. Данное изобретение способствует связыванию вновь синтезированных или поврежденных полипептидов с последующим восстановлением их структуры или удалением их из клетки, что, в свою очередь, способствует предупреждению различной патологии со стороны внутренних органов и повышению устойчивости организма в целом к действию поражающих факторов. 1 табл., 3 ил.

Способ биопротекции от поражающих факторов биологической природы - вирусной инфекции у белых мышей, инфицированных вирусом ВЭЛ в дозе 1,12 lg LD₅₀·мл^-1, включающий ежедневное однократное интраназальное введение раствора препарата БТШ70 в дозе 15 мкг на мышь в течение трех дней до и в течение пяти дней после инфицирования.